Immunofluorescence לפקח על הספיגה הסלולארית של לקטופרין האדם והפעילות הקשורה אנטי נגד וירוס הצהבת מסוג C

Abstract

Immunofluorescence הוא טכניקת מעבדה הנפוצה ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה. הוא משמש בדרך כלל כדי להמחיש את ההפצה ו / או לוקליזציה של מולקולת יעד בתאים וברקמות. Immunofluorescence מסתמך על הספציפיות של נוגדנים שכותרתו ניאון נגד אנטיגנים המתאימים בתוך תא. שניהם יכולים לשמש גישות immunofluorescence ישירות ועקיפות הנשענות על השימוש בנוגדנים קשורים עם fluorochrome. immunofluorescence הישיר בתדירות נמוכה יותר בשימוש משום שהוא מספק אות נמוכה, כרוך בעלות גבוהה יותר ופחות גמישות. לעומת זאת, immunofluorescence העקיף הוא יותר נפוץ בגלל הרגישות הגבוהה שלה ומספק אות מוגברת מאז נוגדן אחד או יותר משני יכול לצרף לכל נוגדן ראשוני. בכתב היד הזה, שניהם במיקרוסקופ epifluorescence ומיקרוסקופיה confocal שמשו כדי לפקח על ההפנמה של לקטופרין האנושי, מרכיב חשוב של מערכת החיסוןמערכת, לתאי כבד. יתר על כן, אנו במעקב הפוטנציאל המעכב של HLF על השכפול תאיים של וירוס הצהבת מסוג C באמצעות immunofluorescence. שני היתרונות וחסרונות הקשורים בגישות אלה נדונים.

Protocol

1. תאי הכנה וטיפול

1. בצלחת 24 גם, לשים כיסוי זכוכית בחלק התחתון של הבארות. לשטוף היטב עם כל בופר פוספט (PBS).
2. תאי זרע הא-7 תומכים replicon subgenomic HCV בכל טוב לצפיפות של 5 × 10 ⁴ תאים / טוב. אם אין טיפול לעשות, יכולים להיות שנזרעו התאים בצפיפות גבוהה. מדיום התרבות הוא הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עובריים בסרום שור (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין, פירובט נתרן 1 מ"מ ו -250 מ"ג / מיליליטר G-418 (כדי לשמור על replicon).
3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. למחרת, טיפול בתאים עם 3 מיקרומטר של HLF מטוהר מחלב אנושי.

2. Paraformaldehyde / סוכרוז הכנה (12% סוכרוז PAF ו -12%)

1. שים 500 מיליליטר של PBS בכוס ומחמם אותו בין 20 ° C ו 30 מעלות צלזיוס. ממיסים 60 גרם של סוכרוז בPBS. ממיסים 60 גרם של paraformaldehyde (PAF) בפתרון PBS / סוכרוז. לאט לאט להוסיף NaOH 2N (3 עד 7 מיליליטר) עד פתרון ברור מתקבל.
2. התאם ל- pH 7.4 עם HCl. נפח מלא 500 מיליליטר עם PBS. סנן לפי הכבידה על מסנן Whatman. לפני השימוש, לדלל את הפתרון עם PBS לריכוז סופי של PAF 4% וסוכרוז 4% (אחסון 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע לכל היותר 1).

3. Immunofluorescence

1. בזמן הרצוי (0 שעה, שעה 2 או 24 שעות של טיפול), לשטוף תאים פעמיים (1 דקות) עם PBS ולתקן עם / 4% סוכרוז / 4% PAF PBS במשך 20 דקות ב RT. התאים הם בדרך כלל במפגש 30-40% ו1.5X10 ⁵ תאים משמשים.
2. Permeabilize תאים עם טריטון 0.15% X-100 ב PBS במשך 5 דקות ב RT ולחסום בסרום 10% נורמלים עז (NGS) בPBS במשך 20 דקות.
3. לדלל את הנוגדן הראשוני של החלבון של עניין ב -10% NGS (לדוגמה: נוגדנים נגד HLF עכבר עיקרי בדילול 1: 1,000). החל הנוגדן הראשוני לתאים.
4. לאחר 4 שעות ב RT או O /N ב 4 ° C, לשטוף את התאים שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 10% NGS. כתם התאים עם נוגדנים משני שכותרתו עם fluorochrome המדולל ב 10% NGS (דוגמא: Fluorochrome עם גל עירור של 488 ננומטר קשור לנוגדן אנטי עכבר 1: 1,000) במשך שעה 1 ב RT בחושך.
5. לשטוף את תאי פעם אחת עבור 5 דקות עם PBS ולהכתים את התאים עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 15 דקות ב RT בחושך.
6. לשטוף את התאים פעמיים ל5 דקות עם PBS. הר לכסות משקפיים בהרכבה בינונית SlowFade לפני ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ. התאים מוכנים לניתוח על ידי epifluorescence או confocal עכשיו.
7. השתמש בבקרה שונה על מנת להבטיח את הספציפיות של זיהוי. לדוגמא, ניתן להשמיט את כל הנוגדנים כדי לזהות autofluorescence. הנוגדן הראשוני ניתן להשמיט כדי לקבוע את הכתמים שאינם ספציפיים על ידי הנוגדנים משני. לבסוף, אם אפשר, לשלוט תאים או רקמות שלאלבטא גם המולקולה של עניין ניתן להשתמש.
8. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתאים (epifluorescence או confocal) ומערכות סינון מתאים לתווית הניאון משמשת. יכולות גם להיות מאוחסנות שקופיות בתיבת שקופיות ב< -20 ° C לבדיקה מאוחר יותר.

4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. שמור את הדגימות בחושך כדי למנוע photobleaching. הפעל את מקור האור של המיקרוסקופ נבחר (epifluorescence או confocal).
2. הפעל את המיקרוסקופ. הפעל את המצלמה למיקרוסקופ. שים את השקופיות במיקרוסקופ להדמיה. להוסיף שמן טבילה בשקופית להגדיל את הצמצם המספרי של העדשה האובייקטיבית.
3. בחר את המסננים המתאימים. התאם את מיקוד ומטרה מתאימה. התאם את התריסים כדי לזהות את fluorochrome המתאים אבל למנוע photobleaching. שמור את האורות מעל למזער אור רקע כאשר מסתכלים על מדגם.
4. ה שינוימסנני דואר לדמיין fluorochromes השונים (למשל DAPI ולגל עירור של 488 ננומטר). לצלם עם המצלמה.

Representative Results

היכולת של הקו הסלולרי כבד הא-7 להפנים HLF אקסוגני מנוהל הייתה פיקוח באמצעות immunofluorescence על miscroscope confocal. HLF התווסף לתקשורת והתרבות וההפנמה הורשה למשך 24 שעות, לאחר ש, HLF תאי נשטף עם PBS וקרום שייר מחויב HLF היה מושפל עם טיפול טריפסין 5 דקות (1 מיליליטר). תאים היו reseeded ויורשו לחזור לדבוק במשך 18 שעות לפני מכתים immunofluorescence. כדי לשרטט את גבולות cytoplasmic, קרומי התאים הוכתמו agglutinin נבט חיטת fluorochrome (WGA) של גל עירור של 488 ננומטר המצומד. צביעת HLF הושגה באמצעות נוגדן ראשוני נגד HLF וfluorochrome עם אורך גל של 633 ננומטר צמוד לנוגדנים משני. על מנת לקבוע את הלוקליזציה המדויקת של HLF, תאים היו צילמו הבא 0.5 מיקרומטר חתך אופקי רציף על ידי מיקרוסקופ confocal. איור 4 מציג optחתך iCal המקביל לעובי אמצע תא. בעקבות התוספת של HLF אקסוגני, כמות משמעותית של HLF זוהתה בתוך הציטופלסמה של hepatocytes. אין HLF נצפה בתוך התאים שלא טופלו בעת השימוש בהגדרות אינסטרומנטלי זהות. יחד, נתונים אלה מאשרים שיש לי hepatocytes היכולת לרכוש HLF מהסביבה תאית שלהם.

היכולת של HLF לעכב את השכפול תאיים של HCV היה הבא במעקב באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. הא-7 תאי התמיכה replicon subgenomic HCV (להביע HCV ns3, NS4A, NS4B, NS5A, חלבוני NS5B) שכפול טופלו עם 3 מיקרומטר HLF ל0, 2 או 24 שעות. הצביעה הכפולה-immunofluorescence לחלבונים HLF וHCV NS5A נותחה על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. תוצאות אלו מצביעות על כך שמכתימות replicon subgenomic HCV (כפי שנמדד על ידי immunofluorescence של חלבון 5A HCV הלא מבני) הופחת בתאים שטופלו בHLF. איור 5 טרונג> מגלה ירידה איכותית של כ -50% בעוצמת מכתימה HCV לאחר 24 שעות של טיפול HLF. זה תצפית מעניינת כמערכת replicon subgenomic זה חסר HCV E1 וגליקופרוטאינים מעטפת E2, שהם המטרות תרופתיות המקובלות של HLF. בד בבד עם הדעיכה של מכתים HCV, הצטברות HLF החלה להתגלות לאחר שעה 2, והצטברות HLF חזקה נצפתה לאחר 24 שעות.

איור 1. עיקרון של מיקרוסקופיה epifluorescence. בסוג זה של מיקרוסקופיה, מסנני עירור לבחור את אורך הגל הספציפי שמרגש את הדגימה (tissus או תאי מחסה נוגדנים שכותרתו ניאון). יתר על כן, מסנני פליטה נבחרו כדי להתאים את מאפייני פליטת רפאים של fluorophore משמש תווית הדגימה.עומס / 53053 53053fig1large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עיקרון איור 2. של מיקרוסקופיה Confocal. סוג זה של מיקרוסקופ משתמש חריר פליטה לחסל אות אור מחוץ לפוקוס. מאז ניתן להבחין רק אור המיוצר על ידי הקרינה קרובה מאוד למישור המוקד, ברזולוציה האופטית של התמונה היא הרבה יותר טובה מזו של מיקרוסקופי epifluorescence. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. סכמטי של immunofluorescence העקיף והישיר. Immunofluorescence ישיר כרוךרק סוג אחד של נוגדן שכותרתו עם fluorochrome שהוא ספציפי למולקולה של עניין (נוגדן ראשוני). לעומת זאת, immunofluorescence העקיף כרוך נוגדנים משני שכותרתו עם fluorochromes שהם ספציפיים למין של הנוגדן הראשוני ללא תווית. יותר מ נוגדן אחד משני יכול לצרף לכל נוגדן ראשוני אשר מגביר את אותות הקרינה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. ספיגת Hepatocellular של HLF. הא-7 תאים אקסוגניים טופלו עם 0 מיקרומטר או 3 HLF מיקרומטר למשך 24 שעות, שטפה פעמיים, שהוגש לטיפול טריפסין 5 דקות, יורשה לחזור לדבוק במשך 18 שעות ונתונים לimmunofluorescence. גרעינים הוכתמו wDAPI ה- i (ערוץ כחול), קרומי פלזמה תויגו עם WGA (ערוץ ירוק) וHLF היה מוכתם בנוגדן אנטי HLF (מסלול אדום). תמונות נרכשו על ידי מיקרוסקופ confocal בהגדלה מקורית של 60x. החתכים האופטיים אופקיים מייצגים את אמצע העובי-של התאים. בר סולם, 10 מיקרומטר. שונה מ( 11). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

5. טיפול HLF איור מפחית צביעת HCV. הא-7 תאי תמיכה שכפול replicon subgenomic HCV טופלו עם 3 מיקרומטר HLF ל0, 2, או 24 שעות ונתונים לimmunofluorescence. הגרעינים הוכתמו DAPI (ערוץ כחול), HCV התגלה על ידי נוגדן אנטי NS5A (מסלול אדום) וHLF היה מוכתם באנטי-HLFntibody (ערוץ ירוק). תמונות נרכשו על ידי מיקרוסקופ epifluorescence בהגדלה מקורית של 60x. בר סולם, 10 מיקרומטר. שונה מ( 11). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מגיפת HCV נותרה איום גלובלי, עם 80% מהחולים שנדבקו זה עתה התפתחות זיהום כרוני, לשים אותם בסיכון של שחמת, אי ספיקת כבד או קרצינומה hepatocellular. סוכנים אנטי מיקוד שכפול HCV והתבגרות פועל-ישיר מייצגים סוכנים אנטי HCV ראש, כפי שהודגם לאחרונה על ידי אישור הרגולטורים של שני מעכבי ns3 N-סופית פרוטאז (Boceprevir וTelaprevir). הפעילות אנטי-HCV HLF הוא האמין כרגע להתנהג כמעכב כניסה נגיפי, מחייבת במחזור virions ומונעת מהם להיכנס ליעד hepatocellular. המחקר שלנו בHLF מציג מנגנון תאיים רומן אנטי HCV פעולה (להבדיל מנטרול virion תאי) ^7.

Immunofluorescence ניתן להשתמש ביעילות כדי להמחיש את ההפצה ו / או לוקליזציה של מולקולת יעד במדגם ביולוגי. כפי שנמצא בהרבה טכניקות הקרינה אחרות, אחד מהתומכים העיקרייםblems הקשורים immunofluorescence הוא photobleaching (הרס פוטו של fluorochrome) ^8. הפסד זה של פעילות שנגרם על ידי photobleaching ניתן לעקוף או על ידי העסקת fluorochromes חזק יותר, כי הם נוטים פחות photobleaching או על ידי הפחתת עוצמת או משך הזמן של חשיפה לאור. יתר על כן, מאז נוגדנים אינם יכולים לחצות את קרום התא, immunofluorescence מוגבל בדרך כלל רק לתאים קבועים. גישות חלופיות כדי לפקח על ההפצה / לוקליזציה של חלבונים בתאים חיים ולכן בדרך כלל מסתמכות על הביטוי של חלבונים המכילים חלבון תחומים ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) ^9. עם זאת, התוספת של אפיטופים GFP כזה לפעמים קשורה לשינוי בלוקליזציה והפעילות של חלבונים. גם immunofluorescence ניתן להשתמש במספר דגימות שונות, כולל סעיפי רקמות, שורות תאים בתרבית, או תאים בודדים הוא גם משמש לעתים קרובות כדי לפקחהלוקליזציה / ההפצה של חלבונים, glycans, ומולקולות קטנות. היתרונות העיקריים של שיטה זו מתגוררים בפשטותו ואת העובדה שניתן להשתמש בו בשילוב עם שיטות אחרות, שאינו נוגדן של מכתים ניאון (למשל, מכתים DNA). יתר על כן, שני נוגדנים מיוצרים באופן מסחרי הם זולים יחסית וזמינים במגוון רחב של צבעים.

במחקר הנוכחי, immunofluorescence של תאי כבד התמיכה HCV replicon subgenomic חשף ירידה איכותית בעוצמה מכתימה HCV על טיפול בHLF. זה תצפית מעניינת כמערכת replicon subgenomic זה חסר HCV E1 וגליקופרוטאינים מעטפת E2, שהם המטרות תרופתיות המקובלות של HLF. בניגוד לפעילות נטרול virion תאי, HLF היה צריך להיות מופנם על ידי hepatocytes נגוע HCV כדי לפגוע בשכפול נגיפי. השימוש במיקרוסקופ fuorescence אפשר לנו evaluאכלתי את האפשרות הזאת. על קדם-דגירה על hepatocytes נגוע HCV, HLF אקסוגניים הופנם בהצלחה, והראה לפגוע בשכפול נגיפי תאיים. ההבנה של פעילות HLF רומן הזה אנטי מהווה צעד קדימה בהבנה של המנגנון (pleiotropic והסביר) הגלובלי של עיכוב של חלבון חסינות מולדת זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic  and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000