Immunofluorescens til Monitor den cellulære optagelse for Human Lactoferrin og dets associerede antiviral aktivitet mod hepatitis C-virus

Abstract

Immunofluorescens er en teknik, der almindeligvis laboratorium anvendes til at undersøge mange aspekter af biologien. Det er typisk bruges til at visualisere distribution og / eller lokalisering af et målmolekyle i celler og væv. Immunofluorescens afhængig af specificiteten af ​​fluorescerende-mærkede antistoffer mod deres tilsvarende antigener inden for en celle. Både direkte og indirekte immunofluorescens tilgange kan bruges som er afhængige af brugen af ​​antistoffer er forbundet med en fluorokrom. Direkte immunfluorescens er mindre hyppigt brugt, fordi det giver lavere signal, indebærer højere omkostninger og mindre fleksibilitet. I modsætning hertil er indirekte immunfluorescens mere almindeligt anvendt på grund af sin høje følsomhed og tilvejebringer et forstærket signal i mere end en sekundær antistof kan knytte til hver primære antistof. I dette manuskript, blev begge epifluorescensmikroskopi og konfokal mikroskopi anvendes til at overvåge internalisering af humant lactoferrin, en vigtig komponent i immunsystemetsystemet, i leverceller. Desuden har vi overvåget potentielle hæmmende hLF på den intracellulære replikation af hepatitis C-virus ved hjælp af immunfluorescens. Både fordele og ulemper forbundet med disse fremgangsmåder diskuteres.

Protocol

1. Celler Forberedelse og behandling

1. I en 24-brønds plade, sætte et glas dækslet på bunden af ​​brøndene. Vask hver brønd med fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
2. Seed Huh-7 celler understøtter HCV subgenomiske replicon i hver brønd til en densitet på 5 x 10 ⁴ celler / brønd. Hvis der ikke er nogen behandling for at gøre, kan cellerne podet ved en højere densitet. Dyrkningsmediet er Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 250 mg / ml G-418 (for at sikre replicon).
3. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO _2. Den næste dag, behandle cellerne med 3 uM hLF oprenset fra human mælk.

2. Paraformaldehyd / saccharose Forberedelse (12% PAF og 12% saccharose)

1. Sæt 500 ml PBS i et bægerglas og opvarme det mellem 20 ° C og 30 ° C. 60 g saccharose i PBS opløses. 60 g paraformal Opløsdehyde (PAF) i PBS / saccharoseopløsning. Tilsæt langsomt NaOH 2N (3 til 7 ml), indtil der opnås en klar opløsning.
2. Juster pH til 7,4 med HCI. Komplet volumen til 500 ml med PBS. Filter af tyngdekraften på Whatman filter. Før brugen fortyndes opløsningen med PBS til en slutkoncentration på 4% PAF og 4% saccharose (Storage 4 ° C i 1 uge maksimum).

3. Immunofluorescens

1. På det ønskede tidspunkt (0 timer, 2 timer eller 24 timer af behandlingen), vask celler to gange (1 min) med PBS og fix med PBS / 4% PAF / 4% saccharose i 20 minutter ved stuetemperatur. Cellerne er typisk 30-40% konfluens og 1,5x10 ⁵ celler anvendes.
2. Permeabilisere cellerne med 0,15% Triton X-100 i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur og blokere i 10% normalt gedeserum (NGS) i PBS i 20 min.
3. Fortynd det primære antistof for proteinet af interesse i 10% NGS (eksempel: primære muse-anti-hLF antistof fortyndet 1: 1000). Anvend det primære antistof til cellerne.
4. Efter 4 timer ved stuetemperatur eller O /N ved 4 ° C, vaskes cellerne tre gange i 5 minutter med 10% NGS. Farv cellerne med sekundært antistof mærket med fluorokrom fortyndet i 10% NGS (eksempel: Fluorokrom med en excitationsbølgelængde på 488 nm koblet til et antistof anti-muse 1: 1000) i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
5. Vask cellerne én gang i 5 minutter med PBS og plette cellerne med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1 ug / ml) i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
6. Vask cellerne to gange i 5 minutter med PBS. Mount dækker briller på SlowFade montering medium inden visualisering gennem mikroskopi. Cellerne er nu klar til analyse ved epifluorescens eller konfokal mikroskopi.
7. Brug forskellige kontroller for at sikre specificitet afsløring. For eksempel kan alle antistoffer udelades med henblik på at detektere autofluorescens. Det primære antistof kan udelades for at bestemme den ikke-specifikke farvning med det sekundære antistof. Endelig, hvis det er muligt, kontrollere celler eller væv, som ikkeudtrykke kan også anvendes molekylet af interesse.
8. Visualiser prøverne ved hjælp af passende fluorescens mikroskop (epifluorescens eller konfokal) og filtersæt passende for fluorescerende mærke anvendes. Slides kan også lagres i et dias boks ved <-20 ° C til senere undersøgelse.

4. Fluorescens mikroskopi

1. Opbevar prøverne i mørke for at forhindre fotoblegning. Tænd lyskilden af ​​den valgte mikroskop (epifluorescens eller konfokal).
2. Tænd mikroskopet. Tænd kameraet for mikroskopet. Sæt slide på mikroskopet til visualisering. Tilføj fordybelse olie på dias for at øge numeriske åbning af den objektive linse.
3. Vælg de passende filtre. Juster fokus og passende mål. Juster skodder for at detektere den passende fluorochrom men forhindrer fotoblegning. Hold loftslampe ud for at minimere baggrunden lys, når man ser på prøve.
4. Skift the filtrene til at visualisere forskellige fluorochromer (f.eks DAPI og til en excitationsbølgelængde på 488 nm). Tag billeder med kameraet.

Representative Results

Evnen af ​​den hepatiske Huh-7 cellelinie at internalisere exogent administreret hLF blev overvåget ved anvendelse immunofluorescens på en konfokal miscroscope. hLF blev tilsat til dyrkningsmediet og internaliseringen lodes i 24 timer, hvorefter blev ekstracellulær hLF vasket med PBS og resterende membranbundne hLF blev nedbrudt med en 5 min trypsinbehandling (1 ml). Celler blev podet og tilladt at re-klæbe i 18 timer før immunfluorescensfarvning. For at skitsere de cytoplasmatiske grænser blev cellerne membranerne farvet med hvedekimagglutinin (WGA) fluorokrom af en excitationsbølgelængde på 488 nm konjugat. HLF farvning blev opnået under anvendelse af et anti-hLF primære antistof og et fluorochrom med en bølgelængde på 633 nm koblet til det sekundære antistof. For at bestemme den præcise lokalisering af hLF blev celler afbildet efter sekventielle 0,5 um horisontalt tværsnit ved konfokal mikroskopi. Figur 4 præsenteres en optical tværsnit, der svarer til midten af ​​celletykkelse. Efter tilsætningen af ​​exogent hLF, blev en betydelig mængde af hLF påvises inde i cytoplasmaet af hepatocytter. Nr hLF blev observeret inden for de ubehandlede celler ved brug af identiske instrumentale indstillinger. Samlet set viser disse data bekræfter, at hepatocytter har evnen til at erhverve hLF fra deres ekstracellulære miljø.

Evnen af ​​hLF at inhibere intracellulær replikation af HCV blev dernæst overvåget under anvendelse epifluorescensmikroskopi. Huh-7-celler understøtter HCV subgenomiske replicon (som udtrykker HCV-NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B proteiner) replikation blev behandlet med 3 uM hLF for 0, 2 eller 24 timer. Den dobbelt-immunofluorescensfarvning for hLF og HCV NS5A-proteiner blev analyseret ved epifluorescensmikroskopi. Disse resultater viser, at HCV subgenomiske replicon farvning (som målt ved immunfluorescens af HCV ikke-strukturelle 5A protein) blev reduceret i celler behandlet med hLF. Figur 5 Trong> afslører en kvalitativ reduktion på ca. 50% i HCV farvningsintensitet efter 24 timer hLF behandling. Dette er en interessant observation, da dette subgenomiske replikon systemet mangler HCV E1 og E2 kappeglycoproteiner, som er de almindeligt accepterede farmakologiske mål for hLF. Samtidig med fading af HCV-farvning, begyndte hLF ophobning påvises efter 2 timer, og stærk hLF akkumulering blev observeret efter 24 timer.

Figur 1. Princip for epifluorescensmikroskopi. I denne type mikroskopi, excitationsfiltre vælge den specifikke bølgelængde, der exciterer prøven (TISSUS eller celler, der huser fluorescensmærkede antistoffer). Desuden er emissionsfiltre udvalgt til at passe de spektrale emissionskarakteristika af fluoroforen anvendes til at mærke prøven.belastning / 53053 / 53053fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Princippet om Konfokalmikroskopi. Denne type mikroskopi bruger en emission pinhole at eliminere out-of-fokus lyssignal. Siden kan påvises kun lys fra fluorescens meget tæt på fokalplanet, den optiske opløsning af billedet er meget bedre end for epifluorescens mikroskoper. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Skematisk af den indirekte og direkte immunofluorescens. Direkte immunfluorescens involvererkun én type antistof mærket med et fluorochrom, som er specifikt for molekylet af interesse (primært antistof). I modsætning hertil indirekte immunfluorescens involverer sekundære antistoffer mærket med fluorokromer, der er specifikke for de arter af umærkede primære antistof. Mere end en sekundær antistof kan knytte til hver primært antistof, der øger fluorescenssignal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Hepatocellulært optagelse af fremmed hLF. Huh-7 celler blev behandlet med 0 uM eller 3 uM hLF i 24 timer, vasket to gange, underkastet en 5 min trypsinbehandling, fik lov at re-klæbe i 18 timer og underkastet immunofluorescens. Kerner blev farvet wi'te DAPI (blå kanal), blev plasmamembraner mærket med WGA (grøn kanal) og hLF blev farvet med et anti-hLF antistof (røde kanal). Billeder blev erhvervet af konfokal mikroskopi på en original forstørrelse på 60x. De vandrette optiske tværsnit repræsenterer midten af ​​tykkelsen af ​​cellerne. Scale bar, 10 um. Modificeret fra (11). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. hLF behandling reducerer HCV-farvning. Huh-7-celler understøtter HCV subgenomiske replikon replikation blev behandlet med 3 uM hLF for 0, 2 eller 24 timer og underkastet immunofluorescens. Kerner blev farvet med DAPI (blå kanal), blev HCV afsløret af et anti-NS5A-antistof (rød kanal) og hLF blev farvet med et anti-a hLFntibody (grøn kanal). Billeder blev erhvervet af epifluorescens mikroskopi på en original forstørrelse på 60x. Scale bar, 10 um. Modificeret fra (11). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

HCV-epidemien fortsat en global trussel, med 80% af nyligt inficerede patienter, der udvikler en kronisk infektion, sætte dem i fare for skrumpelever, leversvigt eller leverkræft. Direkte virkende antivirale midler rettet mod HCV-replikation og modning repræsenterer prime anti-HCV-midler, som for nylig demonstreret ved myndighedsgodkendelse af to NS3 N-terminale proteasehæmmere (Boceprevir og telaprevir). HLF anti-HCV-aktivitet er i øjeblikket menes at opføre sig som en viral entry inhibitor, bindende cirkulerende virioner og forhindre dem i at komme ind i deres hepatocellulær målet. Vores forskning hLF præsenterer en hidtil ukendt intracellulært anti-HCV virkningsmekanisme (forskellig fra ekstracellulære virion neutralisering) ^7.

Immunofluorescens kan effektivt anvendes til at visualisere distribution og / eller lokalisering af et målmolekyle i en biologisk prøve. Som fundet i mange andre fluorescensteknikker, en af ​​de vigtigste problemer forbundet med immunofluorescens er fotoblegning (fotokemisk ødelæggelse af fluorochrom) ^8. Dette tab af aktivitet som følge af fotoblegning kan omgås enten ved at anvende mere robuste fluorochromer, der er mindre tilbøjelige til at fotoblegning eller ved at reducere intensiteten eller tidsrum for lyseksponering. Eftersom antistoffer ikke kan krydse cellemembranen, immunfluorescens er normalt kun begrænset til fikserede celler. Alternative metoder til at overvåge distribution / lokalisering af proteiner i levende celler derfor generelt afhængige af ekspressionen af proteiner, der indeholder fluorescerende proteindomæner såsom grønt fluorescerende protein (GFP) ^9. Imidlertid er tilsætningen af ​​sådanne GFP epitoper undertiden forbundet med en ændring i lokaliseringen og aktiviteten af ​​proteiner. Immunofluorescens kan også anvendes på en række forskellige prøver, herunder vævssnit, dyrkede cellelinier, eller individuelle celler er det også ofte anvendes til at overvågelokaliseringen / fordeling af proteiner, glycaner, og små molekyler. De vigtigste fordele ved denne teknik opholde sig i sin enkelhed og den omstændighed, at den kan anvendes i kombination med andre, ikke-antistof-metoder til fluorescerende farvning (f.eks DNA-farvning). Desuden fremstillet kommercielt sekundære antistoffer er relativt billige og fås i en bred vifte af farver.

I den aktuelle undersøgelse, immunofluorescens af leverceller i forbindelse med en HCV-subgenomiske replicon afslørede en kvalitativ reduktion af HCV farvningsintensitet efter behandling med hLF. Dette er en interessant observation, da dette subgenomiske replikon systemet mangler HCV E1 og E2 kappeglycoproteiner, som er de almindeligt accepterede farmakologiske mål for hLF. I modsætning til den ekstracellulære virion neutralisering aktivitet, ville hLF skal internaliseres af HCV-inficerede hepatocytter til at svække viral replikation. Brugen af ​​fuorescence mikroskopi tilladt os at stillingtagen tilspiste denne mulighed. Ved præ-inkubation på HCV-inficerede hepatocytter blev eksogent hLF succes internaliseret og vist sig at hæmme intracellulær virusreplikation. Forståelsen af ​​denne roman hLF antiviral aktivitet udgør et skridt fremad i forståelsen af ​​den globale (og sandsynligvis pleiotropisk) mekanisme for hæmning af denne medfødte immunitet protein.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic  and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000