Abstract
Immunofluorescenza è una tecnica di laboratorio comunemente usata per studiare molti aspetti della biologia. Esso è tipicamente usato per visualizzare la distribuzione e / o la localizzazione di una molecola bersaglio in cellule e tessuti. Immunofluorescenza basa sulla specificità degli anticorpi fluorescenti marcati contro loro antigeni corrispondenti all'interno di una cella. Entrambi gli approcci diretti e indiretti immunofluorescenza possono essere utilizzati che si basano sull'uso di anticorpi legati con un fluorocromo. Immunofluorescenza diretta è meno frequentemente utilizzato perché fornisce il segnale più bassa, comporta costi più elevati e meno flessibilità. Al contrario, immunofluorescenza indiretta è più comunemente utilizzato per la sua elevata sensibilità e fornisce un segnale amplificato da più di un anticorpo secondario può collegare a ciascun anticorpo primario. In questo manoscritto, sia epifluorescenza e microscopia confocale sono stati usati per monitorare l'internalizzazione di lattoferrina umana, una componente importante del sistema immunitariosistema, nelle cellule epatiche. Inoltre, abbiamo monitorato il potenziale inibitorio del HLF sulla replica intracellulare del virus dell'epatite C mediante immunofluorescenza. Entrambi i vantaggi e gli svantaggi associati a questi approcci sono discussi.
Protocol
1. Le celle di preparazione e trattamento
- In una piastra a 24 pozzetti, mettere una copertura in vetro sul fondo dei pozzetti. Lavare ogni pozzetto con tampone fosfato (PBS).
- Seme Huh-7 cellule di supporto HCV replicone subgenomico in ciascun pozzetto ad una densità di 5 × 10 4 cellule / pozzetto. Se non esiste alcun trattamento per fare, le cellule possono essere seminate ad una densità maggiore. Il terreno di coltura è Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, 1 mM sodio piruvato e 250 mg / ml G-418 (per mantenere la replicone).
- Incubare a 37 ° C e 5% CO 2. Il giorno dopo, trattare le cellule con 3 mM di HLF purificata da latte umano.
2. Paraformaldeide / saccarosio Preparazione (12% PAF e il 12% di saccarosio)
- Mettere 500 ml di PBS in un becher e riscaldarla tra 20 ° C e 30 ° C. Sciogliere 60 g di saccarosio in PBS. Sciogliere 60 g di paraformaldeide (PAF) nel / soluzione di saccarosio PBS. Aggiungere lentamente NaOH 2N (3 a 7 ml) fino a soluzione limpida ottenuta.
- Regolare il pH a 7,4 con HCl. Volume completa a 500 ml con PBS. Filtra per gravità su filtro Whatman. Prima dell'uso, diluire con PBS ad una concentrazione finale di 4% e il 4% PAF saccarosio (memoria 4 ° C per 1 settimana massimo).
3. immunofluorescenza
- Al tempo desiderato (0 ore, 2 ore o 24 ore di trattamento), lavare le cellule due volte (1 minuto) con PBS e fissare con PBS / 4% PAF / 4% di saccarosio per 20 minuti a temperatura ambiente. Le cellule sono tipicamente a 30-40% di confluenza e sono utilizzati 1,5x10 5 cellule.
- Permeabilize le cellule con 0,15% triton X-100 in PBS per 5 minuti a RT e blocco in siero normale di capra 10% (NGS) in PBS per 20 min.
- Diluire l'anticorpo primario della proteina di interesse in 10% NGS (esempio: principale del mouse anticorpo anti-HLF diluito 1: 1000). Applicare l'anticorpo primario alle cellule.
- Dopo 4 ore a temperatura ambiente o O /N a 4 ° C, lavare le cellule tre volte per 5 min a 10% NGS. Macchiare le cellule con anticorpo secondario marcato con fluorocromo diluito in 10% NGS (esempio: Fluorocromo con lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm legata ad un anticorpo anti-topo 1: 1.000) per 1 ora a RT al buio.
- Lavare le cellule una volta per 5 minuti con PBS e macchiare le cellule con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (1 mg / ml) per 15 minuti a RT al buio.
- Lavare le cellule due volte per 5 minuti con PBS. Monte coprire occhiali sul mezzo di montaggio SlowFade prima visualizzazione tramite microscopia. Le cellule sono ora pronti per l'analisi da epifluorescenza o microscopia confocale.
- Utilizzare diversi controlli per assicurare la specificità del rilevamento. Ad esempio, tutti gli anticorpi possono essere omessi per rilevare autofluorescenza. L'anticorpo primario può essere omesso per determinare la colorazione non specifica da parte dell'anticorpo secondario. Infine, se possibile, controllare cellule o tessuti che non lo fannoesprimono la molecola di interesse può anche essere usato.
- Visualizzare i campioni utilizzando appropriati microscopio a fluorescenza (epifluorescenza o confocale) e set di filtri appropriati per l'etichetta fluorescente usato. Le diapositive possono anche essere memorizzati in una scatola di diapositive a <-20 ° C per un esame successivo.
4. microscopia a fluorescenza
- Conservare i campioni al buio per evitare photobleaching. Accendere la sorgente di luce del microscopio scelta (epifluorescenza o confocale).
- Accendere il microscopio. Accendere la fotocamera per il microscopio. Mettere il vetrino sul microscopio per la visualizzazione. Aggiungere olio per immersione sul vetrino per aumentare l'apertura numerica della lente obiettivo.
- Selezionare i filtri appropriati. Regolare la messa a fuoco e l'obiettivo appropriato. Regolare le imposte, al fine di rilevare il fluorocromo appropriata ma evitare photobleaching. Mantenere luci ambientali per minimizzare sfondo chiaro quando guardando campione.
- Cambia °filtri e di visualizzare diversi fluorocromi (ad esempio DAPI e per una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm). Scatta foto con la fotocamera.
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Representative Results
La capacità del epatica linea cellulare Huh-7 di internalizzare esogena amministrato HLF è stata monitorata mediante immunofluorescenza su una miscroscope confocale. HLF è stato aggiunto al mezzo di coltura e l'internalizzazione stato consentito per 24 ore, dopo di che, extracellulare HLF è stato lavato con PBS e membrana residuo legato HLF stato degradato con un 5 min trattamento tripsina (1 ml). Le cellule sono state reseeded e ha permesso di ri-aderire per 18 ore prima di immunofluorescenza. Al fine di delineare i limiti citoplasmatici, le membrane di cellule sono state colorate con germe di grano agglutinina (WGA) fluorocromi di lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm coniugato. La colorazione HLF è stata ottenuta utilizzando un anticorpo primario anti-HLF e un fluorocromo con una lunghezza d'onda di 633 nm legata all'anticorpo secondario. Al fine di determinare la localizzazione precisa del HLF, cellule sono state ripreso seguente sequenziale 0,5 micron orizzontale sezione trasversale mediante microscopia confocale. La Figura 4 presenta un optical sezione trasversale corrispondente a metà dello spessore cellule. Dopo l'aggiunta di esogeno HLF, una quantità significativa di HLF è stato rilevato all'interno del citoplasma degli epatociti. No HLF è stata osservata all'interno delle cellule non trattate utilizzando le impostazioni strumentali identiche. Insieme, questi dati confermano che epatociti hanno la capacità di acquisire HLF dal loro ambiente extracellulare.
La capacità di HLF di inibire la replicazione intracellulare dell'HCV era accanto monitorata con epifluorescenza. Huh-7 cellule di supporto HCV replicone subgenomico (esprimendo HCV NS3, NS4A, NS4B, dell'NS5A, proteine NS5B) replica sono stati trattati con 3 micron HLF per 0, 2 o 24 ore. La colorazione doppia immunofluorescenza per le proteine HLF e HCV NS5A è stata analizzata mediante microscopia in epifluorescenza. Questi risultati indicano che l'HCV replicone subgenomico colorazione (come misurato con immunofluorescenza della HCV non strutturale proteina 5A) è stato ridotto in cellule trattate con HLF. Figura 5 Trong> rivela una riduzione qualitativa di circa il 50% in HCV intensità di colorazione dopo 24 ore di trattamento HLF. Questa è un'osservazione interessante come questo sistema replicone subgenomico manca HCV E1 ed E2 glicoproteine, che sono i bersagli farmacologici comunemente accettati HLF. In concomitanza con il venir meno di HCV colorazione, l'accumulo di HLF ha cominciato ad essere rilevato dopo 2 ore, e forte accumulo HLF è stata osservata dopo 24 ore.
Figura 1. Principio di epifluorescenza. In questo tipo di microscopia, filtri di eccitazione selezionare la lunghezza d'onda specifica che eccita il campione (tissus o celle ospitano anticorpi fluorescenti marcati). Inoltre, filtri di emissione sono scelti per abbinare le caratteristiche di emissione spettrali del fluoroforo utilizzato per etichettare il campione.carico / 53053 / 53053fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Principio di microscopia confocale. Questo tipo di microscopia utilizza un pinhole emissione di eliminare il segnale fuori fuoco luce. Dal momento che solo la luce prodotta da fluorescenza molto vicino al piano focale può essere rilevato, la risoluzione ottica dell'immagine è molto migliore di quella di microscopi epifluorescenza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Schema di immunofluorescenza indiretta e diretta. Immunofluorescenza diretta coinvolgesolo tipo di anticorpo marcato con un fluorocromo, che è specifico per la molecola di interesse (anticorpo primario). Al contrario, immunofluorescenza indiretta coinvolge anticorpi secondari marcati con fluorocromi che sono specifici per la specie dell'anticorpo primario senza etichetta. Più di un anticorpo secondario può allegare a ogni anticorpo primario che aumenta il segnale di fluorescenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. epatocellulare assorbimento di esogeni Huh-7 cellule HLF. Sono state trattate con 0 pM o 3 micron HLF per 24 ore, lavato due volte, sottoposto ad un trattamento tripsina 5 minuti, ha permesso di ri-aderire per 18 ore e sottoposto a immunofluorescenza. I nuclei erano macchiati wesimo DAPI (blu canale), membrane plasmatiche sono stati etichettati con WGA (canale verde) e HLF era macchiato di un anticorpo anti-HLF (canale rosso). Le immagini sono state acquisite al microscopio confocale a un ingrandimento originale di 60x. Le sezioni ottiche orizzontali rappresentano la metà spessore delle celle. Barra della scala, 10 micron. Modificato da (11). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. trattamento HLF riduce HCV colorazione. Huh-7 cellule di supporto replicazione di HCV replicone subgenomico sono stati trattati con 3 micron HLF per 0, 2, o 24 ore e sottoposti a immunofluorescenza. I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu canale), l'HCV è stato rivelato da un anticorpo anti-NS5A (canale rosso) e HLF era macchiato di un anti-HLF unntibody (canale verde). Le immagini sono state acquisite da epifluorescenza a un ingrandimento originale di 60x. Barra della scala, 10 micron. Modificato da (11). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'epidemia HCV rimane una minaccia globale, con l'80% dei pazienti contagiati in via di sviluppo una infezione cronica, mettendoli a rischio di cirrosi, insufficienza epatica o epatocarcinoma. Azione diretta agenti antivirali mirati replicazione di HCV e la maturazione rappresentano agenti anti-HCV primi, come recentemente dimostrato dalla approvazione di regolamentazione di due inibitori della proteasi NS3 N-terminale (boceprevir e telaprevir). L'attività anti-HCV HLF è attualmente crede di comportarsi come un inibitore ingresso del virus, rilegatura circolante virioni e impedendo loro di entrare nella loro obiettivo epatocellulare. La nostra ricerca su HLF presenta un romanzo intracellulare meccanismo anti-HCV di azione (distinto da extracellulare virione neutralizzazione) 7.
Immunofluorescenza può essere efficacemente utilizzato per visualizzare la distribuzione e / o localizzazione di una molecola bersaglio in un campione biologico. Come si trova in molte altre tecniche di fluorescenza, uno dei pro principaleproblematiche connesse con immunofluorescenza è photobleaching (distruzione fotochimica del fluorocromo) 8. Questa perdita di attività causata da photobleaching può essere aggirata sia impiegando fluorocromi più robusti che sono meno inclini a photobleaching o riducendo l'intensità o lasso di tempo di esposizione alla luce. Inoltre, poiché gli anticorpi non possono attraversare la membrana cellulare, immunofluorescenza è generalmente limitata solo alle cellule fisse. Approcci alternativi per monitorare la distribuzione / localizzazione delle proteine nelle cellule vive quindi generalmente contare sulla espressione di proteine contenenti domini proteici fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP) 9. Tuttavia, l'aggiunta di tali epitopi GFP è talvolta associata con una modifica nella localizzazione e l'attività delle proteine. Immunofluorescenza può essere utilizzato anche su diversi campioni anche sezioni di tessuto, linee cellulari coltivate, o cellule individuali è anche frequentemente usato per monitorarela localizzazione / distribuzione delle proteine, glicani, e piccole molecole. I principali vantaggi di questa tecnica risiede nella sua semplicità ed il fatto che esso può essere utilizzato in combinazione con altri metodi, non-anticorpo di fluorescenza (ad esempio, colorazione DNA). Inoltre, anticorpi secondari prodotti commercialmente sono relativamente poco costoso e disponibile in una vasta gamma di colori.
Nel corso di studio, immunofluorescenza di cellule epatiche che sostengono una HCV replicone subgenomico rivelato una riduzione qualitativa dell'intensità HCV colorazione in seguito al trattamento con HLF. Questa è un'osservazione interessante come questo sistema replicone subgenomico manca HCV E1 ed E2 glicoproteine, che sono i bersagli farmacologici comunemente accettati HLF. A differenza della extracellulare dell'attività virione neutralizzazione, HLF avrebbe bisogno di essere interiorizzato dagli epatociti con infezione da HCV, al fine di mettere in pericolo la replicazione virale. L'utilizzo della microscopia fuorescence ci ha permesso di valumangiato questa possibilità. Al momento di pre-incubazione in epatociti con infezione da HCV, esogeno HLF è stato interiorizzato con successo, e dimostrato di alterare la replicazione virale intracellulare. La comprensione di questo romanzo HLF attività antivirale costituisce un passo in avanti nella comprensione del meccanismo globale (e probabilmente pleiotropico) di inibizione di questa proteina immunità innata.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| PAF | BioShop | PAR070.1 | Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes |
| PBS | Wisent | 311-425-CL | Without Ca2+ & Mg2+ |
| NGS | Wisent | 053-150 | |
| AlexaFluor 488-labeled anti-mouse | Invitrogen | A11017 | |
| AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit | Invitrogeb | A21069 | |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA) | Invitrogen | W11261 | Potentially mutagenic |
| Anti-NS5A rabbit | Abcam | ab2594 | |
| Anti-hLF mouse | Abcam | ab10110 | |
| SlowFade | Invitrogen | S36937 | |
| Hoechst stain | Life Techn. | H1399 | Potentially mutagenic and carcinogenic |
| hLF | Sigma | L0520 | |
| Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope | Nikon | TE2000-E | |
| epifluorescence/confocal microscope | Olympus | FV1000 |
References
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- Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
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- Green Remington, S. J.
