Introduction
Seit ihrer Entwicklung in der Mitte der 1990er Jahre die SOD1 G93A-transgenen Mausmodell ist die am weitesten verbreitete Tiermodell der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) 1. Diese transgenen Mausmodell wurde gentechnisch verändert, um eine mutante Form des menschlichen Cu / Zn Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) -Gen beherbergt, das ALS-assoziierten Glycin-zu-Alanin-Mutation an der Aminosäure 93 (G93A) überexprimieren. Die Mutation G93A ist eine von vielen Mutationen im SOD1-Gen, die zusammen Make-up etwa ein Fünftel der familiären ALS Fällen 2.
Die SOD1-G93A-Modell hat sich zu einem Arbeitspferd der ALS Arzneimittelentwicklung Forschung, weil zusätzlich zu seiner offensichtlich genetische Verbindung an ALS, rekapituliert sie viele der pathologischen Merkmale von ALS beim Menschen wie Motorneuronenverlust, progressive Muskelschwäche und Atrophie, mit eventuellen Lähmung und Tod 3. Obwohl, wie es oft der Fall bei transgenen Tiermodellen gibt es eine inhärente biological Variabilität SOD1-G93A Mäusen verbunden. Scott et al. haben festgestellt, dass Kohorten von mindestens 24 Wurf abgestimmt ausgewogenes Geschlechterverhältnis Mäuse werden in der Arzneimittelwirksamkeit Studiendesigns, um die Geräusche, die durch die biologische Variabilität 4 zu überwinden brauchte. Die große Zahl der Tiere in diesen Studien in Kombination mit dem aggressiven Krankheitsverlauf und die Notwendigkeit für die tägliche Überwachung erforderlich, verbietet die Verwendung von aufwendigen, zeitraubende und potenziell stressvollen Techniken zur Messung neuromuskuläre Stärke und Funktion (zB, Elektromyographie, Griffstärke, Rotorod , etc.). Stattdessen hebt er die Notwendigkeit einer in-vivo-Screening-Tool, das zuverlässig beurteilt die neuromuskuläre Funktion der SOD1-G93A Mäusen in einer schnellen Weise.
Bei ALS-TDI ein Protokoll entwickelt, das für die zuverlässige Beurteilung der neuromuskulären Funktion der SOD1-G93A Mäusen in weniger als 30 sec pro Maus im Durchschnitt ermöglicht. Dieses Protokoll encompaSSES täglichen Bewertung der Hinterlauf-Funktion mit einem einfachen neurologische Punktesystem (NeuroScore), die in diesem Bericht in der Presse und in Video beschrieben wird. NeuroScore auf Hinterlauf-Funktion konzentriert, weil hindlimb Defizite sind die frühesten berichteten neurologischen Anzeichen einer Krankheit im SOD1-G93A Mäusen 5,6. Ferner wird die von ALS TDI entwickelte Protokoll bietet eine unvoreingenommene Beurteilung der Beginn der Paralyse (leichte oder teilweisen Lähmung), Progression und Schwere der Lähmung und es empfindlich genug, um Arzneimittel-induzierte Veränderungen in der Fortschreiten der Krankheit zu identifizieren.
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Protocol
Alle Versuche werden in Übereinstimmung mit den von den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Tieren beschriebenen Protokollen durchgeführt und wurden von ALS TDI Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen.
1. Tiere, Wohnen und Studiendesign
Anmerkung:. Die SOD1 G93A-Maus Kolonie wurde von der hohen Kopien B6SJLTgN (SOD1G93A) 1Gur Stamm ursprünglich von Gurney et al 7 hergestellt abgeleitet. Die Kolonie wird derzeit von der Kreuzung transgene C57BL / 6-SJL Männchen mit Wildtyp C57BL / 6-SJL F1 Weibchen gehalten. Die F1-Tiere sind durch Kreuzung SJL Männern mit B6 Weibchen erzeugt. Mäuse werden zu ALS TDI wöchentlich bei 35-45 Tage alt ausgeliefert.
- Ermöglichen Mäusen mindestens eine Woche, um die Tierstation (12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus bei einer Temperatur von 18-23 ° C und 40-60% Luftfeuchtigkeit) vor der Zuweisung einer Studie akklimatisiert.
- Haus männlichen SOD1-G93A mice eine Maus pro Käfig, da Gruppe untergebracht Männer neigen zu kämpfen. Haus weibliche SOD1-G93A Mäusen bis zu zwei pro Käfig. Bieten Anreicherung der Umwelt, in der Form von Kunststoff-Hütten. Liefern Nahrung und Wasser ad libitum, es sei denn, die Mäuse sind Teil einer Studie Drug Administration erfordert im Trinkwasser / Essen. In diesen Fällen Ration und Rekord Nahrung und Wasser.
- Beginnen Sie eine Drogen-Wirksamkeitsstudie etwa im Alter von 50 Tage und umfassen 64 Wurf abgestimmt ausgewogenes Geschlechterverhältnis Mäusen (32 pro Kohorte). Schließlich, stellen Sie sicher, dass die Forscher die Durchführung der Studien zu den Versuchsbedingungen geblendet.
HINWEIS: Es wird empfohlen, dass ein typisches Arzneimittel-Wirksamkeitsstudie beginnt im Alter von Tag 50 jedoch von der Art der therapeutischen Intervention vorzuziehen, um die Studie früher oder später starten können basieren.
Hinweis: Eine Studie mit 32 Mäuse pro Kohorte mit Strom versorgt wird, um geschlechtsspezifische Arzneimittelwirkungen zu erkennen. Wenn keine geschlechtsspezifische Vergleiche erforderlich sind, sollten 24 Mäuse pro Kohorte ausreichen, um die Gesamtarzneimittelwirkungen zu erkennen.
2. Körpergewicht
- Record Körpergewichte für alle Mäuse in Studien täglich mit einer Genauigkeit von einem Zehntel Gramm. Hinweis: Das Körpergewicht ist ein empfindlicher Indikator für die Krankheitsprogression und jeder Krankheitsgefühl, die unter chronischen Drogenbehandlung ergeben könnten.
- Maus-Körpergewichte unterscheiden sich erheblich im Laufe eines Tages, höher in den Morgen, so notieren Sie auf der gleichen Zeit jeden Tag.
3. Neurologische Scoring System (NeuroScore)
- Beurteilen Sie neurologischen Scores (NS) für jede Maus täglich durch die Beobachtung der Maus unter den folgenden drei Bedingungen durchgeführt nacheinander: a) die Maus am Schwanz aufgehängt ist, b) wird die Maus erlaubt zu gehen, und nach dem Beginn der Paralyse c) Maus auf die Seite gelegt.
- Für den Schwanz Suspensionstest, halten Sie die Maus etwa 1,5 "von der Basis des Schwanzes über den Draht Spitze ihrer eigenen Käfig für 1-2 sec, weg von der Lebensmittelbecken, während observing die Hinterbeine. Wiederholen Sie den Suspensionstest 3 Mal und notieren Sie die konsequenteste Ergebnis.
- Für den Gehtest, platzieren Sie die Maus auf eine saubere Oberfläche, die eine gewisse Zugkraft und ein wenige Gehminuten von 25 cm bietet (z. B. mit Klebeband ein Papiertuch ab Verrutschen zu verhindern). Lassen Sie die Maus, um insgesamt 75 cm (3 × Länge des Papierhandtuch) zu Fuß unter Beachtung ihrer Gangart.
- Für die "Stellreflexes" Test, platzieren Sie die Maus auf der linken oder rechten Seite und mit einem Stoppuhren messen die Zeit es braucht, um sich selbst von beiden Seiten rechts ohne fremde Hilfe. Hinweis: Nur ein Versuch des Tests erforderlich ist.
- Bestimmen die NS jedes Hinterlauf (links oder rechts), die unabhängig auf einer Skala von 0 bis 4 Hinweis: Zum Beispiel kann ein Wert von 0, 1, dass die linke Hinterlauf NS 0 ist, während die rechte Hintergliedmaße NS 1 ist.
- Weisen Sie neurologischen Scores (0-4) entsprechend dem folgenden Satz von Beobachtungen (Zusammenfassung in Tabelle 1):
- Vergeben NS 0 (Präsymptomatische), wenn Folgendes eingehalten wird: Wenn die Maus am Schwanz aufgehängt ist, präsentiert der Hinterlauf ein normales splay dh sie ist voll ausgefahren weg von der seitlichen Mittellinie und es bleibt in dieser Position für 2 Sekunden oder länger. Wenn die Maus erlaubt zu gehen, wird normalen Gang beobachtet.
- Vergeben NS 1 (Erste Symptome), wenn Folgendes eingehalten wird: Wenn die Maus am Schwanz aufgehängt ist, präsentiert der Hinterlauf eines abnormalen splay, dh sie ist zusammengebrochen oder teilweise in Richtung seitliche Mittellinie zusammengebrochen ist oder sich während Schwanzaufhängungs zittert oder eingefahren ist / verschränkt. Wenn die Maus erlaubt zu gehen, ist normal oder leicht langsame Gangart beobachtet.
- Vergeben NS 2 (Beginn der Paralyse), wenn Folgendes eingehalten wird: Wenn die Maus am Schwanz aufgehängt ist, ist die Hinterlauf teilweise oder vollständig zusammengebrochen, nicht viel erstrecken. (Es könnte noch gemeinsame Bewegung sein). Wenn die Maus erlaubt zu gehen, wird die Hinterlauf für vorne mot verwendetIonen jedoch die Zehen rollen nach unten mindestens zweimal während einer 90 cm Spaziergang oder einen Teil des Fußes entlang Käfigboden / Tabelle verschieben. Wenn die Maus auf seiner linken und rechten Seite angeordnet ist, ist es in der Lage, sich innerhalb von 10 Sekunden von beiden Seiten rechts.
- Vergeben NS 3 (Lähmung), wenn Folgendes eingehalten wird: Wenn die Maus am Schwanz aufgehängt, gibt es starre Lähmung der hinteren Gliedmaßen in oder minimale gemeinsame Bewegung. Wenn die Maus erlaubt, zu Fuß gibt es Vorwärtsbewegung aber die Hinterlauf wird nicht für die Vorwärtsbewegung verwendet. Wenn die Maus auf seiner linken und rechten Seite angeordnet ist, ist es in der Lage, sich innerhalb von 10 Sekunden von beiden Seiten rechts. Hinweis: In seltenen Fällen nach dem Auftreten der Lähmung, Urin Feuchtigkeit möglicherweise auf die Hinterbeine erscheinen. Unbehandelt Urin Feuchtigkeit könnte, um Urin "Burn" und Hautverletzungen führen. Gönnen Urin Feuchtigkeit durch Abschneiden der Haare, gelten warmem Wasser aufsaugt, um den Urin zu entfernen, und sanft trocken tupfen. Wenn Hautveränderungen vorliegen gelten antibiotic Salbe.
- Vergeben NS 4 (Humane Endpunkt), wenn Folgendes eingehalten wird: Wenn die Maus am Schwanz aufgehängt, gibt es starre Lähmung in den hinteren Gliedmaßen. Wenn die Maus erlaubt zu gehen, gibt es keine Vorwärtsbewegung. Wenn die Maus auf der linken und der rechten Seite platziert Es ist nicht in der Lage, sich innerhalb von 10 Sekunden von jeder Seite rechts. Dh Fehlen des Stellreflexes.
4. Dateneingabe und Analyse
- Im Laufe eines Arzneimittels Wirksamkeitsstudie, geben Sie die Daten für jede Maus in ein Labor-Informations-Management-System (LIMS) oder in einen handelsüblichen Spreadsheet-Software gesammelt.
Hinweis: Die ALS TDI entwickelten LIMS-Software ist ein zentrales Repository für alle internen Studien gesammelten Daten, so dass diese Daten bequem über die Zeit für ALS-TDI Forschern zugänglich. LIMS verfolgt jede einzelne Maus, mit seiner einzigartigen ID, zurück in seine Abstammung, Körpergewicht oder neurologische Punktzahl auf alle Studientage,und schließt alle anderen Beobachtungen während seiner Lebenszeit festgestellt. LIMS erzeugt schließlich eine Tabelle, die für die nachfolgenden Analysen verwendet wird. - Nach dem Abschluss eines Arzneimittels Wirksamkeitsstudie, dh wenn alle Mäuse die humane Endpunkt zu erreichen, verwenden Sie Tabellenkalkulationsprogramm (siehe Tabelle der Materialien), um die kombinierte NS für jede Maus berechnet, für jeden Tag durch Mittelung der linken und rechten Hinterlauf NS . Als nächstes berechnen die mittlere Alter bei der jedes NS für jede Maus und der Zahl der Tage pro Maus bei einer bestimmten NS ausgibt.
- Analysieren Veränderungen bei NS im Laufe der Zeit durch den Import der Daten aus dem Tabellenkalkulationsprogramm auf die Statistik-Software (siehe Tabelle der Materialien). Montieren Sie diese Daten mit Hilfe eines Modells des Ordnungs logistische Regression, die die erwartete NS schätzt, mit Durchschnittsalter bei NS und Drogenbehandlung Effekte in der Regression. Unter Verwendung des Log-Rank-Chi-Quadrat-Test schätzen den Effekt Wahrscheinlichkeit Wahrscheinlichkeit und bestimmen, ob die Drogenbehandlungseffekt auf NS Progression statistischenly signifikante (siehe Supplemental-Code-Datei für Schritt-für-Schritt-Anleitung).
Hinweis: Ein p-Wert <0,05 wird als statistisch signifikant.
Anmerkung: Diese Methode der statistischen Analyse im Einklang mit der Ordnungs Natur des NS-Daten und der variablen Natur der NS-Trajektorien für einzelne Mäuse. Es wird bevorzugt, weil einzelne NS Trajektorien deutlich anders was zu NS-Zeit-assoziierten Gruppe Durchschnittswerte, die nicht repräsentativ für NS-Antworten ausreichend sein. Zusätzlich in einigen Fällen NS schwanken kann, insbesondere, wenn in Null-zu-Eins-Bereich. - Schließlich Einsatz Grafik-Software (siehe Tabelle der Materialien) zu erzeugen "Ordinal Erwartete NS vs Schnittsalter bei NS" Graphen für Arzneimittel behandelten und Kontrolltieren (Abbildung 2, siehe Zusatzcodedatei für die Schritt-für-Schritt-Anleitung). Benutzen Sie diese Diagramme, um bequem zu schätzen Verschiebungen zwischen Medikament behandelten und Kontrollgruppen durch Interpolation aus der y-Achse die mittlere Erkrankungsalter (i.e., NS 2) auf der x-Achse.
Anmerkung: Der Unterschied in der Durchschnittsalter der beiden Gruppen eine Arzneimittel-induzierte-Verschiebung und wird als ein praktisches Maß für die Größe der Wirkung behandelt.
Hinweis: Nach rechts Verschiebungen in der erwarteten NS vs. mittlere Alter deuten Kurve verlangsamt symptomatischen Fortschreiten der Krankheit. Umgekehrt links Verschiebungen in der erwarteten NS vs. mittlere Alter deuten Kurve beschleunigt symptomatischen Fortschreiten der Krankheit.
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Representative Results
Die neurologischen Notendaten für die 90 männlichen und 94 weiblichen nicht behandelten SOD1-G93A Mäusen studierte an ALS TDI beim 2014 wurden ausgewertet. Die Ergebnisse zeigen, dass männliche Mäuse haben typischerweise eine aggressivere Krankheitsprogression als weiblichen Mäusen, wie durch einen höheren Anteil an deren Lebensdauer bei NS 1 im Vergleich zu Weibchen belegt. NS 2 und NS 3 auftreten, mit nahezu gleicher Häufigkeit auf Geschlechter. NS 0 wurde aus der Analyse ausgeschlossen, weil es als ein "normaler" Phänotyp führt. NS 4 wurde ebenfalls ausgeschlossen, da per Definition kann sie nur einmal im SOD1-G93A Maus Lebzeiten (Tabelle 2 und Abbildung 1) auf.
NS Daten von einem Fortschreiten der Krankheit ALS Wirksamkeit pharmakologischen Studie der Testverbindung TDI173 im SOD1-G93A Mäusen vorgestellt (n = 16 pro Gender / Behandlung; 64 gesamt Mäuse). In Abbildung 2 wird die Geschwindigkeit der neurologischen Krankheitsprogression dargestellt, als durch die Ordnungsregressionsanalyse der Daten c fangenaptured Verwendung des hierin detailliert NeuroScore Protokoll. TDI173 behandelten Mäusen wurden mit Vehikel behandelten Kontrolle verglichen. Keine statistisch signifikante Unterschiede beobachtet, wenn Geschlechtern getrennt analysiert wurden, aber statistische Signifikanz wurde erreicht, als Geschlechter zusammengelegt wurden. Die Kaplan-Meier-Analyse der Überlebenszeit, auch wenn die ähnliche Trends wie die ordinalen logistischen statistische Analyse, nicht empfindlich genug, um signifikante Unterschiede selbst zu offenbaren, wenn Geschlechter zusammengelegt wurden (Abbildung 3).
| NS 1 | Die Hinterlauf stellt eine abnorme splay, dh, es ist eingeklappt oder teilweise in Richtung seitliche Mittellinie zusammengebrochen ist oder sich während Schwanzaufhängungs zittert oder eingefahren / umklammert. | Normal oder etwas langsameren Gangart. | N / A |
| NS 2 | Die hinteren Gliedmaßen teilweise oder vollständig zusammengebrochen, nicht viel erstrecken. Es könnte stgemeinsame Bewegung krank. | Die Hinterlauf wird für die Vorwärtsbewegung verwendet, aber die Zehen rollen nach unten mindestens zweimal während einer 75 cm Spaziergang oder einen Teil des Fußes entlang Käfigboden / Tabelle verschieben. | Die Maus ist in der Lage, sich innerhalb von 10 Sekunden von beiden Seiten rechts. |
| NS 3 | Starre Lähmung der hinteren Gliedmaßen in oder minimale gemeinsame Bewegung. | Vorwärtsbewegung aber die Hinterlauf wird nicht für die Vorwärtsbewegung verwendet. | Die Maus ist in der Lage, sich innerhalb von 10 Sekunden von beiden Seiten rechts. |
| NS 4 | Starre Lähmung in den hinteren Gliedmaßen. | Kein Vorwärtsbewegung. | Die Maus ist nicht in der Lage, sich innerhalb von 10 Sekunden von jeder Seite rechts. |
Tabelle 1: Zusammenfassung der phänotypische Beobachtungen zur neurologischen Scores zuweisen.
| Frequenz des NS1 | Häufigkeit der NS2 | Frequenz von NS3 | ||||
| Männlich | Weiblich | Männlich | Weiblich | Männlich | Weiblich | |
| Anzahl der Mäuse | 90 | 94 | 90 | 94 | 90 | 94 |
| Minimum | 12 | 5 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 25% | 29 | 16 | 4 | 4 | 0 | 0 |
| Median | 37 | 27,5 | 5 | 5 | 1 | 1 |
| 75% | 44 | 37,5 | 7.5 | 6.5 | 2.5 | 3 |
| Maximale | 61 | 60 | 28 | 11 | 8 | 9 |
Tabelle 2: Eine Frequenzanalyse der NS Daten aus nicht-behandelten SOD1-G93A Mäusen ab dem Alter von Tag 50 bis zum Tod täglich erzielt. Verteilungen wurden NS für 1, 2 und 3 berechnet.
Abbildung 1. Grafische Darstellung der Anzahl der Tage, an jedem abnormalen NeuroScore für jede Maus aus der Bevölkerung von unbehandelten SOD1-G93A Mäusen in unserer Kolonie verbracht während 2014 (männlich n = 90, weiblich n = 94). Die Partitur Frequenzen für die gleiche Mäuse werden für jede mögliche NS dargestellt. NS 4 weggelassen wurde, weil das Ereignis kann nur einmal in jeder Maus Lebensdauer per Definition auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere versio ansehen n dieser Figur.
Abbildung 2 Eine typische ordinalen logistischen statistische Analyse Graph, neurologische Krankheitsprogression von TDI173 behandelten Mäusen (rote Linie), um Wurf abgestimmt Vehikel-behandelten Kontrollmäusen.. (Blaue Linie; Berichtet p-Werte stellen Log-Rank-Chi-Quadrat-Test) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 3 Eine typische Kaplan-Meier-Analyse Diagramm, Lebensdauer TDI173 behandelten Mäusen (rote Linie), um Wurf abgestimmt Vehikel-behandelten Kontrollmäusen (blaue Linie; Berichtet p-Werte stellen Log-Rank-Test).jove.com/files/ftp_upload/53257/53257fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In diesem Bericht beschreiben wir eine schnelle und einfache Video-Protokoll, die, wenn sie richtig angewendet wird, ist in der Lage, zuverlässige Beurteilung der Krankheitsprogression bei SOD1-G93A Mäusen und Identifizierung von Arzneimittel-induzierter Veränderungen. Während verschiedene Gruppen haben phänotypische Scoring-Systeme für die SOD1-G93A Mäusen 8-10 entwickelt, haben sie oft keine ausreichende Angaben über das Verfahren und die für die Replikation unzureichend. Als Ergebnis werden Scoring-Systeme selten außerhalb der spezifischen Gruppe, die sie entwickelt, verwendet. In diesem Bericht, die Kombination aus einer detaillierten Manuskript mit Video minimiert Scoring Unklarheiten und inter-Experimentator Variabilität so dass für das Protokoll, um von anderen Laboratorien verabschiedet werden und ermöglicht Vergleiche zwischen den Studien statt an verschiedenen Einstellungen.
Die in diesem Bericht, die als NeuroScore bezeichnet beschriebenen neurologischen Punktesystem, Ordnungsdaten, wo die genauen Zahlenwerte zu den Sätzen von Zeichen und sy zugeschrieben erzeugtmptoms haben keine Bedeutung jenseits Gründung Platz Schwere der Erkrankung. In diesem Fall NS 0 ist die am wenigsten schwere Krankheitszustand und bedeutet eine Maus mit normaler Hinterlauf-Funktion, während NS 4 ist die schwerste Krankheitszustand mit Mäusen, bei oder nahe Morbidität sekundär zu neuromuskulären Erkrankungen. Auch wenn die Scoring-System nutzt eine symptomatische Schwellen, umfasst jede Ordnungs NS-Wert ein breites Spektrum an möglichen klinischen Präsentationen von denen viele auf Video aufgenommen und in diesem Bericht enthalten.
NS 1 umfasst das Spektrum der frühen Symptome der Krankheit in SOD1-G93A Mäusen, die weit von der Maus auf Maus variieren. Einige Mäuse zeigen eine abnorme Spreizfuß mit den Hinterbeine zusammenbrech in Richtung der Mittellinie während andere Hinterlauf Zittern und einige sogar zeigen hindlimb Einfahren oder umklammert. Ferner ist in den frühen Stadien der Krankheit die NS einiger Mäusen könnte mehrere Tage zwischen NS 1 und 0 Unweigerlich zwar schwanken, im SOD1-G93A Mäusen die FrequenzNS 1 mit der Zeit zunimmt und es enthält mehr und mehr von den verschiedenen beschriebenen Phänotypen. Im Durchschnitt, männlich und weiblich SOD1-G93A Mäusen in der Regel verbringen 37 und 28 Tagen bzw. in diesem Stadium.
NS 2 stellt den Beginn der Paralyse (leichte oder teilweisen Lähmung) und bietet unbestreitbare Beweise für das Vorhandensein der Pathologie. Zwar ist es nicht ungewöhnlich, dass ein Wildtyp-Maus, um manchmal als NS 1 vorhanden, NS 2 tritt nur in SOD1-G93A Mäusen. Ähnlich NS 1, NS 2 erfasst ein Spektrum von Symptomen. In einer Bühnenpräsentation der NS 2 Anfang der Mauszeiger ambulanten und energisch. Eine erweiterte Darstellung der NS 2 zeigt eine Maus mit einem stark eingeschränkten Bewegungsfähigkeit. Erweiterte Parese der Hinterbeine kann den Mäusen aus dem Erreichen der Nahrung und Wasser an der Oberseite des Käfigs zu verhindern, so Futterpellets sollte am Boden des Käfigs angeordnet oder hydratisiert Lebensmittel vorzusehen. Außerdem sollten mehr sipper Röhrchen auf Wasserflaschen platziert werden. SOD1-G93A Mäusen typically verbringen 5 Tage in diesem Stadium.
NS 3 bedeutet vollständige Lähmung der hinteren Gliedmaßen, und nach allem, ist die einfachste Phänotyp zu identifizieren und Score. Die Lähmungen durch NS 3 umfasste entweder schlaffe oder spastische sein, sind aber in der Regel spastischen. Zu diesem Zeitpunkt werden die Mäuse sind sehr krank und sollten häufig kontrolliert werden. Im Durchschnitt SOD1-G93A Mäusen verbringen 1-2 Tagen in diesem Stadium.
NS 4 bezeichnet die Abwesenheit von "Stellreflexes", die nicht ausschließlich auf die Hinterlauf-Funktion, wie NS 0-3 ab, sondern stattdessen den ganzen Körper Wellness der Maus widerspiegelt. Die Fähigkeit eines Maus ein normales "Aufrichtungsreflexes" zeigen, erfordert Motivation, Energie, sondern auch die Funktion von mehreren Muskelgruppen einschließlich hindlimbs sowie der vorderen und Bauch. Es ist wichtig anzumerken, daß Fortschreiten der Krankheit in diesen Mäusen ist oft nicht symmetrisch ist und eine Maus, die Aufrichtungsreflexes erfolgreich abgeschlossen werden kann, wenn auf einer Seite m gestelltay unfähig sein, dies zu tun, wenn sie auf der anderen Seite platziert. Es ist daher wichtig, für die humane Behandlung von Tieren und für die Integrität der Studie, die Prüfung auf beiden Seiten durchzuführen und einschläfern die Maus, wenn es scheitert, sich auf jeder Seite rechts.
NS 4 definiert den Zeitpunkt der Euthanasie und standardmäßig direkt deckt sich mit Überlebensdaten. Allerdings ist die Gesamtfortschreiten der Krankheit, wie durch Ordnungsregressionsanalyse der NS definiert ist, nicht vollständig überlappen könnten mit Kaplan-Meier-Überlebenskurven und Körpergewichtsdaten. Bestimmte therapeutische Interventionen können Krankheitsbeginn oder Symptome beeinflussen, aber nicht, um die Gesamtlebensdauer auswirken.
Zwar nicht in der Tiefe in diesem Bericht erörtert, kann das Körpergewicht eine weitere Maßnahme, die in Kombination zur NS verwendet werden können, um Krankheiten Entstehung und Progression im SOD1-G93A aber es kann durch Unterschiede in der Ernährung verzerrt sein zu bewerten und von Therapeutika, die Ödeme oder Einfluss verursachen Fettstoffwechsel 11,12.
13 manifestieren und nicht die Hinterlauf motorische Defizite, einen Phänotyp, die nicht von NeuroScore erfasst wird. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist die Tatsache, dass es entworfen wurde und gilt nur für eine hohe Kopien SOD1-G93A Mäusen. Nach unserer Erfahrung der klinischen Präsentation der Krankheit in anderen Mausmodellen von ALS, wie die niedrige Kopien SOD1 G93A-Maus 14 oder der TDP-43-Maus 15,16, ist anders als in der hohen Kopien SOD1-G93A Mäusen und dieser NS-System vielleicht schlecht geeignet für diese Modelle zu sein. Somit ist es wichtig, dass die Transgen-Kopienzahl der Mäuse vor der Zuordnung zu Untersuchungen zu bestimmen und sicherzustellen, dass er gleich dem der hohe Kopienpositivkontrollmäusen ist. Unabhängig die Vorteile von unsing diese neurologische Punktesystem überwiegen die Grenzen und das Video-Protokoll kann als eine ausgezeichnete Trainingsgerät für ALS Forscher dienen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 002726 | Strain of mice used in this study |
| Breeders | Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA | Colony maintainance | |
| Scale | Navigator OHAUS, Parsippany, NJ | Model N14120 | Used to weigh mice |
| Nutra-GelH | Bio-Serv, Flemington, NJ | #S4798 | Wet food provided to sick mice |
| Irradiated Lab Animal Diet | Harlan, Indianapolis, IN | 2918-111914M | Chow diet |
| Lab-grade Sani-chips | Harlan Teklad, Indianapolis, IN | 7090 | Bedding |
| JMPH | SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC | v10.0.2 | Statistical software |
| Microsoft Excel | Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA | Excel 2013 (v 15.0) | Spreadsheet software |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad software Inc., La Jolla, CA | v5.4 | Graphing software |
| Mouse Huts | Bio-Serv, Flemington, NJ | K3272 | For environmental enrichment |
References
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
- Gurney, M. E. The use of transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis in preclinical drug studies. J Neurol Sci. 152, Suppl. 1 (6415), (1997).
- Scott, S., et al. Design, power, and interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Hegedus, J., Putman, C. T., Gordon, T. Time course of preferential motor unit loss in the SOD1 G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol. Dis. 28 (2), 154-164 (2007).
- Gordon, T., Ly, V., Hegedus, J., Tyreman, N. Early detection of denervated muscle fibers in hindlimb muscles after sciatic nerve transection in wild type mice and in the G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurol. Res. 31 (1), 28-42 (2009).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Kim, K., Moore, D. H., Makriyannis, A., Abood, M. E. AM1241, a cannabinoid CB2 receptor selective compound, delays disease progression in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur. J. Pharmacol. 542 (1-3), 1-3 (2006).
- Weydt, P., Hong, S. Y., Kliot, M., Moller, T. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Azari, M. F., et al. Behavioural and anatomical effects of systemically administered leukemia inhibitory factor in the SOD1(G93A G1H) mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain Res. 982 (1), 92-97 (2003).
- Guan, Y., et al. Thiazolidinediones expand body fluid volume through PPARgamma stimulation of ENaC-mediated renal salt absorption. Nat. Med. 11 (8), 861-866 (2005).
- Savcheniuk, O. A., et al. The effect of probiotic therapy on development of experimental obesity in rats caused by monosodium glutamate. Fiziol. Zh. 60 (2), 63-69 (2014).
- Smittkamp, S. E., Brown, J. W., Stanford, J. A. Time-course and characterization of orolingual motor deficits in B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J mice. Neuroscience. 151 (2), 613-621 (2008).
- C, M., Gurney, M. E. A low expressor line of transgenic mice carrying a mutant human Cu,Zn superoxide dismutase (SOD1) gene develops pathological changes that most closely resemble those in human amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol. 93 (6), 537-550 (1997).
- Wegorzewska, I., Baloh, R. H. TDP-43-based animal models of neurodegeneration: new insights into ALS pathology and pathophysiology. Neurodegener. Dis. 8 (4), 262-274 (2011).
- Hatzipetros, T., et al. C57BL/6J congenic Prp-TDP43A315T mice develop progressive neurodegeneration in the myenteric plexus of the colon without exhibiting key features of ALS. Brain Res. 1584, 59-72 (2014).
