Introduction
מאז הפיתוח שלה באמצע שנתי ה -1990 דגם העכבר מהונדס SOD1-G93A היה מודל החיה הנפוצה ביותר של מחלת ניוון (ALS) 1. מודל עכבר מהונדס זה מהונדס גנטי לביטוי יתר טופס מוטציה של גן סופראוקסיד דיסמוטאז Cu / Zn האנושי 1 (SOD1) חסת גליצין קשור-ALS למוטצית אלאנין בחומצת אמינו 93 (G93A). המוטציה G93A היא אחד של מוטציות רבות בגן SOD1 שהאיפור באופן קולקטיבי כחמישית ממקרי ה- ALS המשפחתיים 2.
מודל SOD1-G93A הפך סוס עבודה מחקר לפיתוח תרופות ALS כי בנוסף לקשר הגנטי הברור שלה לALS, היא דומה רבות של התכונות פתולוגיים של ALS בבני אדם כגון אובדן מוטורי נוירון, חולשת שרירים מתקדמת וניוון, עם סופו של דבר שיתוק ומוות 3. אם כי, כפי שקורה לעתים קרובות עם מודלים של בעלי חיים מהונדסים, יש דו טבועהשתנות ological קשורות עם SOD1 לעכברים-G93A. סקוט ואח '. קבע כי קבוצות של לפחות 24 עכברי מין מאוזן בהתאמה המלטה יש צורך במחקר עיצובי סמים יעילות כדי להתגבר על הרעש שנוצר על ידי השונות הביולוגיות 4. המספר הגדול של בעלי חיים הנדרשים במחקרים אלה, בשילוב עם התקדמות המחלה האגרסיבית ואת הצורך בניטור יומי אוסר על השימוש בטכניקות משוכללות, גוזל זמן ופוטנציאל דחק למדידת כוח ותפקוד עצבית-שרירית (לדוגמא, electromyography, כוח אחיזה, rotorod , וכיוצא בזה.). במקום זאת, הוא מדגיש את הצורך בin vivo כלי הקרנה שבאופן מהימן מעריך את התפקוד העצבית-שרירית של SOD1 לעכברים-G93A באופן מהיר.
בALS TDI פרוטוקול פותח שמאפשר ההערכה אמינה של התפקוד העצבית-שרירית של SOD1 לעכברים-G93A בפחות מ -30 שניות לכל עכבר בממוצע. encompa פרוטוקול זהsses הערכה יומית של פונקצית hindlimb באמצעות מערכת פשוטה נוירולוגיות ניקוד (NeuroScore) אשר מתוארת בדוח זה בעיתונות ובוידאו. על תפקוד hindlimb NeuroScore מתמקד בגלל גירעונות hindlimb הם המוקדם ביותר שדווחו סימן נוירולוגיות של מחלה בעכברי SOD1-G93A 5,6. יתר על כן, הפרוטוקול שפותח על ידי ALS TDI מספק הערכה בלתי מוטה של תחילת paresis (שיתוק קל או חלקי), התקדמות והחומרה של שיתוק והוא רגיש מספיק כדי לזהות שינויים בהשפעת סמים בהתקדמות מחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים שנערכו בהתאם לפרוטוקולים שתוארו על ידי המכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בבעלי חיים ואושרו על ידי הוועדה של ALS TDI טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש (IACUC).
1. בעלי חיים, שיכון, ועיצוב הלימוד
הערה: המושבה עכבר SOD1-G93A נגזרה מB6SJLTgN המתח הגבוה 1Gur עותק (SOD1G93A) המיוצר במקור על ידי et al גורני 7.. המושבה כיום מתוחזק על ידי חציית זכרים C57BL / 6-SJL מהונדסים עם נקבות C57BL / 6-SJL F1 wild-type. בעלי החיים F1 נוצרים על ידי חציית זכרים SJL עם נקבות B6. עכברים נשלחים לשבועון TDI ALS ב35-45 ימים של גיל.
- לאפשר עכברים לפחות אחד שבוע להסתגל למתקן בעלי החיים (מחזור אור / חושך של 12 שעות בטמפרטורה של C ° 18-23 ולחות 40-60%) לפני הקצאה למחקר.
- SOD1-G93A זכר בית מיקרופוןדואר עכבר אחד בכל כלוב, מאז הקבוצה שוכנו זכרים נוטים להילחם. עכברי הבית הנקבה SOD1-G93A עד שני לכלוב. לספק העשרה סביבתית, בצורה של בקתות פלסטיק. לספק כרצונך מזון ומי מודעה, אלא אם העכברים הם חלק ממחקר הדורש מתן תרופה במי שתייה / אוכל. במקרים אלה, מנה ומזון שיא ומים.
- בגין מחקר סמים יעילות סביב גיל 50 יום וכולל 64 עכברי מין מאוזן בהתאמה המלטה (32 לכל מחזור). לבסוף, להבטיח כי החוקרים עורכים המחקרים עיוורו לתנאי ניסוי.
הערה: מומלץ כי מחקר סמים יעילות טיפוסי מתחיל בגיל 50 יום אך המבוסס על הסוג של התערבות טיפולית שזה עשוי להיות עדיף להתחיל המחקר מוקדם או במאוחר.
הערה: מחקר עם 32 עכברים למחזור הוא מופעל כדי לזהות סמים לוואי מין ספציפי. אם אין השוואות בין המינים ספציפיים נדרשות, 24 עכברים למחזור צריכים להספיק כדי לזהות סמים השפעות הכוללות.
2. משקל גוף
- משקל גוף רשומה לכל העכברים בלימוד יומי עם דיוק של עשירית גרם. הערה: משקל גוף הוא אינדיקטור רגיש להתקדמות מחלה ושל כל חולשה שעלולה להיגרם כתוצאה מטיפול תרופתי כרוני.
- משקל גוף העכבר להשתנות במידה ניכרת במהלך יום, להיות גבוה יותר בבקרים, ובכך לרשום אותם בערך באותו הזמן בכל יום.
3. מערכת נוירולוגיות ניקוד (NeuroScore)
- להעריך ציוני נוירולוגיות (NS) עבור כל עכבר יומי על ידי התבוננות בעכבר תחת שלושה התנאים הבאים מבוצעים ברצף:) העכבר מושעה בזנבו, ב) העכבר מותר ללכת, ולאחר תחילת paresis ג) עכבר ממוקם על צידו.
- לבדיקת ההשעיה זנב, להחזיק את העכבר כ 1.5 "מבסיס הזנב מעל החוט של הכלוב בביתם במשך 1-2 שניות, הרחק מאגן המזון, ואילו הערהארווינג hindlimbs. חזור על בדיקת ההשעיה 3 פעמים ולהקליט את התוצאה העקבית ביותר.
- למבחן ההליכה, הנח את העכבר על משטח נקי שמספק כמה מתיחה ומרחק הליכה של 25 סנטימטר (למשל., מגבת נייר מודבקת למטה למניעת החלקה). אפשר העכבר כדי ללכת כולל של 75 סנטימטר (אורך 3X של מגבת נייר) תוך התבוננות בהליכה שלה.
- למבחן "רפלקס ליישר", הצב את העכבר על צדו ימני או השמאלי ובאמצעות תחנה-שעון למדוד את הזמן שלוקח לתקן את עצמו עד ללא עזרה משני הצדדים. הערה: רק משפט אחד של מבחן זה נדרש.
- לקבוע NS של כל hindlimb (ימין או שמאל) באופן עצמאי בסולם מ 0 עד 4. הערה: לדוגמא ציון של 0, 1 מציין כי hindlimb עזבה NS הוא 0, ואילו hindlimb NS הנכון הוא 1.
- להקצות עשרות נוירולוגיות (0-4) המתאימות לקבוצה של תצפיות (סיכום שנקבעו בלוח 1) הבאה:
- הקצאת NS 0 (Pre-סימפטומטי) אם הבא הוא ציין: כאשר העכבר הוא מושעה בזנב, hindlimb מציגה נוטה החוצה נורמלי כלומר, הוא מוארך מקו האמצע לרוחב באופן מלא והוא נשאר בתפקיד זה במשך 2 שניות או ארוך יותר. כאשר העכבר מותר ללכת, הליכה נורמלית הוא ציין.
- הקצאת 1 NS (סימפטומים ראשונים) אם הבא הוא ציין: כאשר העכבר הוא מושעה בזנב, hindlimb מציגה נוטה החוצה נורמלי, כלומר, הוא התמוטט או באופן חלקי התמוטט לכיוון קו האמצע לרוחב או שרועד בהשעית זנב או שהוא חזר בו / שלובות. כאשר העכבר מותר ללכת, הליכה רגילה או מעט איטית הוא ציין.
- הקצאת NS 2 (Onset של paresis) אם הבא הוא ציין: כאשר העכבר הוא מושעה בזנב, hindlimb היא באופן חלקי או לחלוטין התמוטט, לא להאריך הרבה. (יש עדיין עשויה להיות תנועה משותפת). כאשר העכבר מותר ללכת, hindlimb משמשת לmot קדימהיון עם זאת הבהונות כלפי מטה להתכרבל לפחות פעמיים במהלך הליכה של 90 סנטימטר או כל חלק של כף הרגל גורר לאורך תחתית כלוב / שולחן. כאשר העכבר ממוקם בצדו הימני והשמאלי, הוא מסוגל לתקן את עצמו בתוך 10 שניות משני הצדדים.
- הקצאת 3 NS (שיתוק) אם הבא הוא ציין: כאשר העכבר הוא מושעה בזנב, יש שיתוק נוקשה בhindlimb או תנועה משותפת מינימאלית. כאשר העכבר מותר ללכת קדימה יש תנועה עם זאת hindlimb לא נמצאת בשימוש לתנועה קדימה. כאשר העכבר ממוקם בצדו הימני והשמאלי, הוא מסוגל לתקן את עצמו בתוך 10 שניות משני הצדדים. הערה: לעתים רחוקות, לאחר תחילת השיתוק, לחות שתן עלולה להופיע בhindlimbs. לחות שתן שלא טופלה עלולה לגרום לשמאל שתן "לשרוף" ונגעים בעור. פנק את לחות שתן על ידי גזירת השיער, להחיל מים חמים סופג להסיר את השתן, ובעדינות למחוק יבש. אם נגעים בעור נמצאים תחול antibioמשחה טיק.
- הקצאת 4 NS (נקודת סיום הומנית) אם הבא הוא ציין: כאשר העכבר הוא מושעה בזנב, יש שיתוק נוקשה בhindlimbs. כאשר העכבר מותר ללכת, אין תנועה קדימה. כאשר העכבר ממוקם בצדו הימני והשמאלי הוא לא מסוגל לתקן את עצמו בתוך 10 שניות מצד או. כלומר, היעדר ליישר רפלקס.
4. הזנת נתונים וניתוח
- במהלך מחקר יעילות תרופה, להזין נתונים שנאספו עבור כל עכבר למערכת ניהול מידע מעבדה (LIMS) או לתוכנת גיליון אלקטרוני זמינה באופן מסחרי.
הערה: תוכנת LIMS המפותחת TDI ALS היא מאגר מרכזי לכל הנתונים שנאספו ממחקרים פנימיים, מה שהופך את הנתונים הללו בנוחות נגישה לאורך זמן לחוקרי ALS TDI. LIMS עוקב כל עכבר בודד, עם זיהוי הייחודי שלה, חזרה לשושלת, משקל הגוף או ציון הנוירולוגיות בכל הימים העיון,וכולל את כל תצפיות אחרות ציינו במהלך חייו. LIMS סופו של דבר יוצר גיליון אלקטרוני המשמש לניתוחים שלאחר מכן. - עם השלמת מחקר סמים יעילות, כלומר, כאשר כל העכברים להגיע לנקודת הסיום ההומנית, תוכנת גיליון אלקטרוני שימוש (ראה טבלה של חומרים) כדי לחשב את NS המשולב לכל עכבר, עבור כל יום על ידי ממוצעי hindlimb ימין ועל שמאל NS . בשלב הבא, לחשב את הגיל החציוני בכל NS לכל עכבר ומספר הימים בכל עכבר מבלה בNS מסוים.
- ניתוח שינויים הכוללים בNS לאורך זמן על ידי יבוא נתונים מהתוכנה הגיליון האלקטרוני לתוכנה הסטטיסטית (ראה טבלה של חומרים). להתאים את הנתונים הללו באמצעות מודל של רגרסיה לוגיסטית סודר האומד את NS הצפוי, עם גיל החציונים בNS ותרופה לטיפול בתופעות ברגרסיה. שימוש במבחן כיכר צ'י יומן הדרגה להעריך את הסתברות סבירות השפעה ולקבוע אם אפקט תרופה-טיפול על התקדמות NS הוא סטטיסטיly משמעותי (ראה קובץ קוד נוסף להוראות צעד-אחר-צעד).
הערה: p-value <0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית.
הערה: שיטה זו של ניתוח סטטיסטי מכבדת את הטבע הסידורי של נתונים NS והטבע המשתנה של מסלולי NS לעכברים בודדים. הוא העדיף משום מסלולי NS בודדים יכולים להיות שונים במידה ניכרת וכתוצאה מכך ממוצעי קבוצה הקשורים זמן NS שאינם מספיק רעיוני של תגובות NS. בנוסף, בחלק מהמקרים NS יכול להשתנות, במיוחד כאשר בטווח אפס-על-אחד. - לבסוף, תוכנת גרפים שימוש (ראה טבלה של חומרים) כדי ליצור "סודר צפוי NS לעומת חציון גיל בNS" גרפים לבעלי חיים שטופל בתרופה ושליטה (איור 2; ראה נוסף קוד קובץ להוראות צעד-אחר-צעד). השתמש בגרפים אלה כדי להעריך נוחות משמרות בין קבוצות שטופלה בתרופה ושליטה על ידי ביון מהציר y הגיל החציוני של תחילת מחלה (i.דואר., NS 2) על ציר x.
הערה: ההבדל בגיל החציוני בין שתי הקבוצות מייצג שינוי תוצאת משימוש בסמים ומטופל כאמצעי מעשי של סדר הגודל של השפעה.
הערה: משמרות ימינה בלעומת העקומה הצפויה NS חציון הגיל מצביע על האטת התקדמות מחלה סימפטומטית. לעומת זאת, משמרות שמאלה בעיקול לעומת הגיל החציוני הצפוי NS מצביעות מואצות התקדמות מחלה סימפטומטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נתוני ציון הנוירולוגית של 90 גברים ו -94 נקבות עכברים שאינם מטופלים SOD1-G93A למדו בALS TDI בשינה 2014 הוערכו. התוצאות מראות כי יש לי עכברי זכרים בדרך כלל התקדמות מחלה אגרסיבית יותר מאשר נקבות עכברים, כפי שמעידים חלק גדול יותר של תוחלת החיים שלהם ליום 1 בNS בהשוואה לנשים. NS 2 וNS 3 להתרחש בתדירות כמעט שווה על פני מינים. NS 0 הוצא מהניתוח, כי זה נחשב פנוטיפ "נורמלי". 4 NS גם לא נכלל כי על פי הגדרה זה יכול להתרחש רק פעם אחת בחיים של SOD1-G93A עכבר (טבלה 2 ואיור 1).
נתונים NS מוצגים ממחקר ALS התקדמות המחלה פרמקולוגיה היעילות של TDI173 מתחם המבחן בSOD1 לעכברים-G93A (n = 16 למין / טיפול; 64 עכברים בסך הכל). באיור 2, קצב התקדמות מחלה נוירולוגית מוצג כנתפס על ידי ניתוח רגרסיה סידורי של הנתונים גaptured באמצעות פרוטוקול NeuroScore המפורט במסמך זה. עכברים שטופל TDI173 הושוו לשליטה ברכב שטופל. אין הבדלים משמעותיים סטטיסטי נצפו כאשר מינים נותחו בנפרד אך הגיעה למשמעות סטטיסטית כאשר מינים מוזגו. ניתוח קפלן-מאייר של הישרדות, למרות שמראה מגמות דומות לניתוח הסטטיסטי לוגיסטי הסודר, לא היה רגיש מספיק כדי לחשוף הבדלים משמעותיים גם כאשר מינים מוזגו (איור 3).
| 1 NS | Hindlimb מציגה נוטה החוצה נורמלי, כלומר, הוא התמוטט או התמוטט בחלקו לכיוון קו האמצע לרוחב או שרועד בהשעית זנב או שהוא חזר בו / שלובות. | הליכה רגילה או מעט איטית. | NA |
| NS 2 | Hindlimb היא באופן חלקי או לחלוטין התמוטטה, לא להאריך הרבה. ייתכן שרחחולה להיות תנועה משותפת. | Hindlimb משמשת לתנועה קדימה זאת הבהונות כלפי מטה להתכרבל לפחות פעמיים במהלך הליכה 75 סנטימטר או כל חלק של כף הרגל גוררת לאורך תחתית כלוב / שולחן. | העכבר הוא מסוגל לתקן את עצמו בתוך 10 שניות משני הצדדים. |
| NS 3 | שיתוק נוקשה בhindlimb או תנועה משותפת מינימאלית. | תנועה קדימה זאת hindlimb לא נמצאת בשימוש לתנועה קדימה. | העכבר הוא מסוגל לתקן את עצמו בתוך 10 שניות משני הצדדים. |
| 4 NS | שיתוק נוקשה בhindlimbs. | אין תנועה קדימה. | העכבר הוא לא מסוגל לתקן את עצמו בתוך 10 שניות מצד או. |
טבלה 1: סיכום של תצפיות פנוטיפי משמשים להקצאה עשרות נוירולוגיות.
| תדר של ns1 | תדר של NS2 | תדר של ns3 | ||||
| זכר | נקבה | זכר | נקבה | זכר | נקבה | |
| מספר העכברים | 90 | 94 | 90 | 94 | 90 | 94 |
| מינימום | 12 | 5 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 25% | 29 | 16 | 4 | 4 | 0 | 0 |
| חציון | 37 | 27.5 | 5 | 5 | 1 | 1 |
| 75% | 44 | 37.5 | 7.5 | 6.5 | 2.5 | 3 |
| מקסימום | 61 | 60 | 28 | 11 | 8 | 9 |
טבלה 2: ניתוח תדירויות נתוני NS מעכברים שטופלו לא SOD1-G93A הבקיע יומי מיום גיל 50 ועד מוות. הפצות חושבו עבור 1 NS, 2, ו -3.
איור 1. ייצוג גרפי של מספר הימים בילו בכל NeuroScore נורמלי לכל עכבר מהאוכלוסייה של SOD1 לעכברים שלא טופלו ב- G93A המושבה שלנו בשנת 2014 (זכר n = 90, נקבת n = 94). תדרי הציון לאותו עכברים מיוצגים לכל NS האפשרי. 4 NS הושמט בגלל האירוע יכול להתרחש רק פעם אחת בחיים של כל עכבר על ידי הגדרה. לחץ כאן כדי לצפות בVersio גדול n של נתון זה.
איור 2 גרף טיפוסי סודר לוגיסטי ניתוח סטטיסטי השוואת התקדמות מחלה נוירולוגית של עכברים שטופל TDI173 (קו אדום) לעכברי שליטת המלטה מתאימים שטופל רכב.. (קו כחול; מדווח p-ערכים מייצגים יומן דרגת מבחן כיכר צ'י) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 3 גרף טיפוסי קפלן-מאייר ניתוח השוואת תוחלת חיים של עכברים שטופל TDI173 (קו אדום) לעכברי שליטת המלטה מתאימות רכב שטופל (קו כחול; p-ערכים מדווחים מייצגים יומן דרגת מבחן)."Target =" _ jove.com/files/ftp_upload/53257/53257fig3large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול וידאו מהיר ופשוט, שאם מיושם כהלכה, מסוגל באופן מהימן הערכת התקדמות המחלה בעכברי SOD1-G93A וזיהוי שינויים בהשפעת סמים. בעוד קבוצות שונות פיתחו מערכות ניקוד פנוטיפי לSOD1 לעכברי G93A-8-10, הם לעתים קרובות לא מספקים פרטים מספיקים על ההליך ואינם מתאימים לשכפול. כתוצאה מכך, מערכות ניקוד משמשות מחוץ לקבוצה הספציפית שמפתחת אותם רק לעתים נדירות. בדוח זה, שילוב של כתב יד מפורטת עם וידאו ממזער בהירויות ניקוד והשתנות הבין-הנסיין ובכך מאפשרות לפרוטוקול להיות מאומצים על ידי מעבדות אחרות ומאפשרות השוואות בין לימודים המתקיימים בהגדרות שונות.
שיטת ניקוד הנוירולוגית המתוארת בדוח זה, המכונה NeuroScore, מייצרת נתונים סודרים בי הערכים המספריים המדויקים לייחס לסטים של סימנים וסאיםיש לי mptoms אין משמעות מעבר להקמת חומרת מחלה מדורגת. במקרה זה, NS 0 הוא מדינת המחלה קשה לפחות ומסמן עכבר עם פונקצית hindlimb רגילה תוך 4 NS הוא מצב המחלה החמור ביותר עם עכברים באו מתקרב תחלואה משנית למחלה עצבית-שרירית. למרות ששיטת הניקוד עושה שימוש בספי סימפטומטי, כל ערך NS סודר כולל קשת רחבה של מצגות קליניות אפשריות שרבים מהם נתפסו על וידאו וכלול בדוח זה.
1 NS מקיף את הספקטרום של סימפטומים המוקדמים של מחלה בעכברי SOD1-G93A, אשר יכול להשתנות במידה רבה מעכבר לעכבר. עכברי חלק להפגין נוטים החוצה נורמלי עם hindlimbs קורסת כלפי קו האמצע, בעוד שאחרים יראו רעידות hindlimb וחלקם אפילו להראות הכחשה hindlimb או קמוץ. יתר על כן, בשלבים המוקדמים של מחלה בשלבי NS של כמה עכברים עשוי להשתנות בכל מקרים אף לכמה ימים בין NS 1 ו0., בSOD1 לעכברים-G93A התדירותעליות NS 1 עם זמן וזה כולל יותר ויותר של פנוטיפים השונים שתוארו. בממוצע, עכברי זכרים וSOD1-G93A נקבה בדרך כלל לבלות 37 ו -28 ימי בהתאמה בשלב זה.
NS 2 מייצג את תחילתה של paresis (שיתוק קל או חלקי) ומספק ראיות מוטלת בספק את קיומו של פתולוגיה. אמנם זה לא נדיר עבור עכבר wild-type ללפעמים נוכחי כ1 NS, NS 2 מתרחש רק בSOD1 לעכברים-G93A. בדומה ל1 NS, NS 2 לוכד ספקטרום של סימנים ותסמינים. במצגת שלב מוקדמת של NS 2 העכבר הוא אמבולטורי ואנרגטי. מצגת מתקדמת יותר של NS 2 מגלה עכבר עם יכולת מוגבלת לנוע. paresis מתקדם בhindlimbs עלול למנוע עכברים מלהגיע המזון ומים בחלק העליון של הכלוב, כך צריכים להיות ממוקמים כדורי מזון בחלק התחתון של הכלוב או צריך להיות מסופקים מזון התייבשות. כמו כן, צריכים להיות ממוקמים צינורות קשית ארוכים יותר על בקבוקי מים. typica SOD1 לעכברים-G93Ally לבלות 5 ימים בשלב זה.
NS 3 מסמל שיתוק hindlimb מלא, ועל ידי כל החשבונות הוא פנוטיפ הקל ביותר לזיהוי וציון. הסימפטומים השיתוק הקיפו על ידי NS 3 עשויים להיות גם רפויים או עוויתיים, אך הם בדרך כלל ספסטי. בשלב זה, העכברים חולים מאוד וצריכים להיות במעקב בתדירות גבוהה. בממוצע, SOD1 לעכברים-G93A לבלות 1 עד 2 ימים בשלב זה.
4 NS מציין את היעדר "רפלקס ליישר" שאינו תלוי באופן בלעדי פונקצית hindlimb כמו NS 0-3 אבל במקום זה משקף את כל בריאות הגוף של העכבר. היכולת של עכבר כדי להפגין "רפלקס ליישר" נורמלי דורשת מוטיבציה, אנרגיה, אלא גם הפונקציה של קבוצות שרירים רבות, כולל hindlimbs, forelimbs, והבטן. חשוב לציין כי התקדמות מחלה בעכברים אלו היא לעתים קרובות לא סימטרית ועכבר שיכול להשלים בהצלחה את רפלקס ליישר כאשר הניחו על מטר צד אחד איי להיות מסוגל לעשות זאת כאשר הניח בצד השני. לכן חשוב, לטיפול ההומני של בעלי חיים ועל השלמות של המחקר, לבצע בדיקות בשני הצדדים ולהרדים את העכבר אם היא לא מצליחה לתקן את עצמו מכל צד.
4 NS מגדיר את התאריך של המתת חסד וכברירת מחדל ישירות מיישר עם נתוני הישרדות. עם זאת, התקדמות המחלה הכוללת, כפי שהוגדר על ידי ניתוח רגרסיה סידורי של NS, אולי לא לגמרי חופפת עם עקומות הישרדות קפלן-מאייר ונתוני משקל גוף. התערבויות טיפוליות מסוימות עשויות להשפיע על הופעת מחלה או תסמינים, אך אינה מצליחות להשפיע תוחלת חיים כללית.
אמנם לא דן לעומק בדו"ח זה, משקל גוף יכול להיות מדד נוסף שניתן להשתמש בשילוב לNS להעריך תחילת מחלה והתקדמות בSOD1-G93A עם זאת זה יכול להיות מוטה על ידי הבדלים בתזונה ועל ידי תרופות שגורמות לבצקת או השפעה חילוף חומרים של שומן 11,12.
= "Jove_content" ילדה> הנכס הגדול ביותר של פרוטוקול TDI ALS הוא הפשטות שלו וביצוע מהיר. זה יכול לבוא על חשבון לא לכידת פנוטיפים מחלה מסוימות. לדוגמא, במקרים נדירים סימפטומים הקשורים לALS בעכברי SOD1-G93A עשויים להתבטא גירעונות מנוע orolingual וforelimb כ13 ולא hindlimb גירעונות מנוע, פנוטיפ שאינו נתפס על ידי NeuroScore. מגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא העובדה שהוא מיועד ולחל רק על SOD1 לעכברים-G93A גבוה עותק. מניסיוננו, המצגת הקלינית של מחלה במודלים של עכברים אחרים של ALS, כמו עותק הנמוך SOD1-G93A העכבר 14 או TDP-43 העכבר 15,16, הוא שונה מאשר במערכת הגבוהה NS זה העותק SOD1 לעכברים-G93A ו יכול להיות חולה מתאים לדגמים אלה. לפיכך, חשוב לקבוע את מספר עותק transgene של עכברים לפני הקצאתם ללימודים ולוודא שזה שווה לזה של עכברים חיובית-שליטה גבוהה עותק. ללא קשר, את היתרונות שלנוing שיטת ניקוד נוירולוגית זה עולה מגבלותיו ופרוטוקול וידאו זה יכול לשמש ככלי מצוין להכשרת חוקרי ALS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 002726 | Strain of mice used in this study |
| Breeders | Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA | Colony maintainance | |
| Scale | Navigator OHAUS, Parsippany, NJ | Model N14120 | Used to weigh mice |
| Nutra-GelH | Bio-Serv, Flemington, NJ | #S4798 | Wet food provided to sick mice |
| Irradiated Lab Animal Diet | Harlan, Indianapolis, IN | 2918-111914M | Chow diet |
| Lab-grade Sani-chips | Harlan Teklad, Indianapolis, IN | 7090 | Bedding |
| JMPH | SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC | v10.0.2 | Statistical software |
| Microsoft Excel | Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA | Excel 2013 (v 15.0) | Spreadsheet software |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad software Inc., La Jolla, CA | v5.4 | Graphing software |
| Mouse Huts | Bio-Serv, Flemington, NJ | K3272 | For environmental enrichment |
References
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
- Gurney, M. E. The use of transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis in preclinical drug studies. J Neurol Sci. 152, Suppl. 1 (6415), (1997).
- Scott, S., et al. Design, power, and interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Hegedus, J., Putman, C. T., Gordon, T. Time course of preferential motor unit loss in the SOD1 G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol. Dis. 28 (2), 154-164 (2007).
- Gordon, T., Ly, V., Hegedus, J., Tyreman, N. Early detection of denervated muscle fibers in hindlimb muscles after sciatic nerve transection in wild type mice and in the G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurol. Res. 31 (1), 28-42 (2009).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Kim, K., Moore, D. H., Makriyannis, A., Abood, M. E. AM1241, a cannabinoid CB2 receptor selective compound, delays disease progression in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur. J. Pharmacol. 542 (1-3), 1-3 (2006).
- Weydt, P., Hong, S. Y., Kliot, M., Moller, T. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Azari, M. F., et al. Behavioural and anatomical effects of systemically administered leukemia inhibitory factor in the SOD1(G93A G1H) mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain Res. 982 (1), 92-97 (2003).
- Guan, Y., et al. Thiazolidinediones expand body fluid volume through PPARgamma stimulation of ENaC-mediated renal salt absorption. Nat. Med. 11 (8), 861-866 (2005).
- Savcheniuk, O. A., et al. The effect of probiotic therapy on development of experimental obesity in rats caused by monosodium glutamate. Fiziol. Zh. 60 (2), 63-69 (2014).
- Smittkamp, S. E., Brown, J. W., Stanford, J. A. Time-course and characterization of orolingual motor deficits in B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J mice. Neuroscience. 151 (2), 613-621 (2008).
- C, M., Gurney, M. E. A low expressor line of transgenic mice carrying a mutant human Cu,Zn superoxide dismutase (SOD1) gene develops pathological changes that most closely resemble those in human amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol. 93 (6), 537-550 (1997).
- Wegorzewska, I., Baloh, R. H. TDP-43-based animal models of neurodegeneration: new insights into ALS pathology and pathophysiology. Neurodegener. Dis. 8 (4), 262-274 (2011).
- Hatzipetros, T., et al. C57BL/6J congenic Prp-TDP43A315T mice develop progressive neurodegeneration in the myenteric plexus of the colon without exhibiting key features of ALS. Brain Res. 1584, 59-72 (2014).
