Introduction
Da quando il suo sviluppo negli metà del 1990 il modello di topo transgenico SOD1-G93A è stato il modello animale più diffuso della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) 1. Questo modello di topo transgenico è stato geneticamente modificato per iperespressione di una forma mutante del gene umano Cu / Zn superossido dismutasi 1 (SOD1) ospitare la glicina ALS-associata a mutazioni alanina a aminoacidi 93 (G93A). La mutazione G93A è una delle tante mutazioni nel gene SOD1 che collettivamente il make-up di circa un quinto dei casi di SLA familiare 2.
Il modello SOD1-G93A è diventato un cavallo di battaglia della ricerca lo sviluppo di farmaci SLA perché oltre alla sua evidente legame genetico per la SLA, si ricapitola molte delle caratteristiche patologiche della SLA nell'uomo come la perdita dei motoneuroni, progressiva debolezza muscolare e atrofia, con eventuale paralisi e la morte 3. Anche se, come spesso accade con modelli animali transgenici, c'è un bi intrinsecavariabilità ological associati con i topi SOD1-G93A. Scott et al. hanno determinato che le coorti di almeno 24 topi di genere equilibrata lettiera abbinati sono necessari disegni di studio farmaco-efficacia al fine di superare il rumore creato dalla variabilità biologica 4. Il gran numero di animali necessari in questi studi, in combinazione con la progressione della malattia aggressiva e la necessità di monitoraggio giornaliero vieta l'uso di tecniche in termini di tempo e potenzialmente stressanti elaborati per misurare forza e la funzione neuromuscolare (ad esempio, elettromiografia, forza di presa, Rotorod , ecc). Invece, evidenzia la necessità di un vivo strumento di screening in che valuta in modo affidabile la funzione neuromuscolare di topi SOD1-G93A in modo rapido.
A ALS TDI un protocollo è stato sviluppato che consente la valutazione affidabile della funzione neuromuscolare di topi SOD1-G93A in meno di 30 secondi per topo in media. Questo encompa protocolloSSES valutazione giornaliera della funzione degli arti posteriori utilizzando un semplice sistema di punteggio neurologico (NeuroScore) che è descritta in questa relazione in corso di stampa e in video. NeuroScore si concentra sulla funzione degli arti posteriori, perché i deficit arti posteriori sono il primo riferito segno neurologico della malattia nei topi SOD1-G93A 5,6. Inoltre, il protocollo sviluppato da SLA TDI fornisce una valutazione imparziale di insorgenza della paralisi (lieve o parziale paralisi), la progressione e la gravità di paralisi ed è abbastanza sensibile per identificare i cambiamenti indotti da farmaci a progressione della malattia.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono condotti in conformità con i protocolli descritti dai National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali e sono stati approvati dalla cura degli animali e l'uso istituzionale comitato di SLA TDI (IACUC).
1. Gli animali, della casa, e lo studio di design
Nota: Il mouse colonia SOD1-G93A è stato derivato dalla alta copia B6SJLTgN (SOD1G93A) ceppo 1Gur originariamente prodotto da Gurney ed altri 7.. La colonia è attualmente mantenuto attraversando transgenici maschi C57BL / 6-SJL con wild-type femmine C57BL / 6-SJL F1. Gli animali F1 sono generate dall'incrocio maschi SJL con le femmine B6. I topi sono spediti a ALS TDI settimanale a 35-45 giorni di età.
- Lasciare topi almeno una settimana per acclimatarsi al stabulario (luce 12 ore / buio ciclo, ad una temperatura di 18-23 ° C e 40-60% di umidità) prima di assegnare ad uno studio.
- Casa SOD1-G93A maschio mice un mouse per gabbia, in quanto gruppo ospitato i maschi tendono a combattere. Casa topi femmina SOD1-G93A fino a due per gabbia. Fornire arricchimento ambientale, sotto forma di capanne di plastica. Fornire cibo e acqua ad libitum, a meno che i topi fanno parte di uno studio che richiede la somministrazione del farmaco in acqua potabile / cibo. In questi casi, razione alimentare e registrare e acqua.
- Iniziare uno studio farmaco-efficacia in giro giorno di 50 anni e comprendono 64 lettiera corrispondenza di genere equilibrata topi (32 per coorte). Infine, assicurarsi che i ricercatori che conducono studi sono accecati alle condizioni sperimentali.
Nota: Si raccomanda che un tipico studio farmaco-efficacia inizia a giorno 50 anni tuttavia, in base al tipo di intervento terapeutico potrebbe essere preferibile iniziare lo studio precedente o successiva.
Nota: Uno studio con 32 topi per coorte è alimentato per rilevare droga effetti specifici di genere. Se non sono necessarie confronti specifici di genere, 24 topi per coorte dovrebbe essere sufficiente per rilevare droga effetti complessivi.
2. Peso corporeo
- Pesi corporei record per tutti i topi in studi giornaliero con una precisione di un decimo di grammo. Nota: Il peso corporeo è un indicatore sensibile della progressione della malattia e di qualsiasi malessere che potrebbero derivare da un trattamento farmacologico cronico.
- Peso corporeo mouse variano considerevolmente nel corso di una giornata, essendo più alta al mattino, quindi li registrano intorno alla stessa ora ogni giorno.
3. Neurologico Scoring System (NeuroScore)
- Valutare punteggi neurologici (NS) per ciascun topo quotidianamente osservando il mouse sotto le seguenti tre condizioni eseguite in sequenza: a) il mouse è sospeso dalla sua coda, b) il mouse viene permesso di camminare, e dopo l'inizio della paresi c) mouse viene posizionato su un lato.
- Per il test di sospensione posteriore, tenere il mouse circa 1,5 "dalla base della coda sopra la parte superiore del filo della loro gabbia casa per 1-2 sec, lontano dal bacino cibo, mentre obsErving arti posteriori. Ripetere il test di sospensione 3 volte e registrare il risultato più consistente.
- Per il test del cammino, posizionare il mouse su una superficie pulita che fornisce una certa trazione e una distanza di 25 cm (per es., Un tovagliolo di carta registrata giù per evitare scivolamenti). Lasciare che il mouse per camminare un totale di 75 cm (lunghezza 3X del tovagliolo di carta), mentre si osserva la sua andatura.
- Per il test "riflesso di raddrizzamento", posizionare il mouse sul lato sinistro o destro e utilizzando un cronometro misurare il tempo necessario per raddrizzarsi fino senza assistenza da entrambi i lati. Nota: solo una prova di questo test è richiesto.
- Determinare la NS di ogni arti posteriori (sinistra o destra) in modo indipendente su una scala da 0 a 4. Nota: Per esempio un punteggio di 0, 1 indica che il arti posteriori di sinistra NS è 0, mentre la destra arti posteriori NS è 1.
- Assegnare punteggi neurologici (0-4) corrispondente alla seguente serie di osservazioni (sintesi di cui alla tabella 1):
- Assegnare NS 0 (pre-sintomatica) se il seguente si osserva: Quando il mouse è sospeso per la coda, la arti posteriori presenta una strombatura normale cioè, punto di massima estensione di distanza dalla linea mediana laterale e rimane in questa posizione per 2 sec più a lungo. Quando è consentito il mouse per camminare, andatura normale si osserva.
- Assegna NS 1 (primi sintomi) se si osserva quanto segue: Quando il mouse è sospeso per la coda, la arti posteriori presenta una strombatura anormale, cioè, è compressa o parzialmente crollato verso linea mediana laterale O trema durante la sospensione della coda o è rientrato / abbracciato. Quando è consentito il mouse per camminare, andatura normale o leggermente lento si osserva.
- Assegnare NS 2 (insorgenza di paresi) se la seguente si osserva: Quando il mouse è sospeso per la coda, la arti posteriori è parzialmente o completamente crollato, che non si estende molto. (Ci potrebbe essere ancora il movimento articolare). Quando è consentito il mouse per camminare, il arti posteriori viene utilizzata per mot avantiion però arricciare le dita dei piedi verso il basso almeno due volte nel corso di un 90 centimetri passeggiata o qualsiasi parte del piede sta trascinando sulla parte inferiore della gabbia / tavolo. Quando il mouse è posizionato sul lato sinistro e destro, è in grado di raddrizzarsi entro 10 secondi da entrambi i lati.
- Assegnare NS 3 (paralisi) se il seguente si osserva: Quando il mouse è sospeso per la coda, c'è la paralisi rigida in arti posteriori OR minimo movimento articolare. Quando è consentito il mouse per camminare non c'è movimento in avanti però il arti posteriori non viene utilizzato per il movimento in avanti. Quando il mouse è posizionato sul lato sinistro e destro, è in grado di raddrizzarsi entro 10 secondi da entrambi i lati. Nota: Raramente, dopo l'inizio della paralisi, urina umidità potrebbe apparire sugli arti posteriori. Sinistra umidità urina non trattata può portare a urina "bruciare" e lesioni cutanee. Trattare urina umidità clipping i capelli, applicare acqua calda assorbe per rimuovere l'urina, e asciugare delicatamente asciutto. Se lesioni cutanee sono presenti applicano antibiopomata tic.
- Assegnare NS 4 (Humane end-point), se la si osserva seguente: Quando il mouse è sospeso per la coda, c'è la paralisi rigida nelle arti posteriori. Quando è consentito il mouse per camminare, non vi è alcun movimento in avanti. Quando il mouse è posizionato sul lato sinistro e destro non è in grado di raddrizzarsi entro 10 secondi da una parte QUALSIASI. Cioè, l'assenza del riflesso di raddrizzamento.
4. Data Entry e analisi
- Nel corso di uno studio di efficacia droga, inserire i dati raccolti per ogni mouse in una Laboratory Information Management System (LIMS) o in un software di foglio elettronico disponibile in commercio.
Nota: il software LIMS ALS TDI-sviluppato è un repository centrale per tutti i dati raccolti da studi interni, rendendo questi dati facilmente accessibile nel tempo per gli investigatori SLA TDI. LIMS tracce qualsiasi individuo del mouse, con il suo ID univoco, al suo lignaggio, il peso corporeo o punteggio neurologico tutti i giorni di studio,e comprende tutte le altre osservazioni rilevate durante la sua vita. LIMS genera infine un foglio che viene utilizzato per le analisi successive. - Dopo il completamento di uno studio di droga efficacia, cioè, quando tutti i topi raggiungono il punto finale umana, software uso foglio (vedi TABELLA MATERIALI) per calcolare il combinato NS per ogni mouse, per ogni giorno facendo la media del hindlimb sinistra e destra NS . Avanti, calcola l'età media di ciascun NS per ogni mouse e il numero di giorni ogni mouse passa ad una particolare NS.
- Analizzare movimenti complessivi NS nel tempo importando i dati dal foglio di calcolo al software statistico (vedi Tabella dei Materiali). Montare questi dati utilizzando un modello di regressione logistica ordinale che stima l'atteso NS, con età media alla NS e droga trattamento come effetti nella regressione. Utilizzando il test del chi quadro log-rank stimare la probabilità effetto verosimiglianza e determinare se l'effetto della droga trattamento su NS progressione è statisticaly significativo (vedi file di codice supplementare per passo-passo le istruzioni).
Nota: Un valore di p <0.05 è considerato statisticamente significativo.
Nota: Questo metodo di analisi statistica rispetta la natura ordinale dei dati NS e la natura variabile delle traiettorie NS per singoli topi. Si è preferito perché percorsi individuali NS possono essere notevolmente diverse con conseguente NS tempo associata medie di gruppo che non sono sufficientemente riflettente di risposte NS. Inoltre, in alcuni casi NS possono oscillare, in particolare quando nella gamma da zero a uno. - Infine, il software uso graficamente (vedi tabella dei Materiali) per generare "ordinale Expected NS vs mediana Età al NS" grafici per gli animali trattati con farmaci e di controllo (Figura 2; cfr Codice supplementare File per passo-passo le istruzioni). Utilizzare questi grafici per valutare comodamente spostamenti tra i gruppi trattati con farmaci e controllo interpolando dalla y l'età media di insorgenza della malattia (i.e., NS 2) sul asse x.
Nota: La differenza di età media tra i due gruppi rappresenta un cambiamento farmaco-indotta ed è trattata come una misura pratica della grandezza dell'effetto.
Nota: si sposta verso destra della curva della NS età mediana attesi indicano rallentato la progressione della malattia sintomatica. Al contrario, si sposta leftward nel NS curva della età media attesi indicano accelerato la progressione della malattia sintomatica.
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Representative Results
I dati neurologici punteggio di 90 maschi e 94 donne non trattate topi SOD1-G93A studiato presso ALS TDI nel corso del 2014 sono stati valutati. I risultati mostrano che i topi maschi di solito hanno una progressione della malattia più aggressiva rispetto ai topi di sesso femminile, come evidenziato da una percentuale maggiore della loro vita a NS 1 rispetto alle femmine. NS 2 e 3 NS si verificano con frequenza pressoché uguale in tutta generi. NS 0 è stato escluso dall'analisi perché è considerato un fenotipo "normale". NS 4 è stato anche escluso perché, per definizione, può avvenire solo una volta nella vita di un topo SOD1-G93A (Tabella 2 e Figura 1).
Dati NS è presentato da una progressione della malattia studio di efficacia farmacologia SLA di prova composto TDI173 nei topi SOD1-G93A (n = 16 per genere / trattamento; 64 topi totale). Nella figura 2, il tasso di progressione della malattia neurologica è presentato come catturata mediante analisi di regressione ordinale di dati captured utilizzando il protocollo NeuroScore qui descritto. Topi TDI173 trattati sono stati confrontati a veicolo trattati controllo. Non sono state osservate differenze significative quando generi sono stati analizzati separatamente, ma la significatività statistica è stato raggiunto quando sono state fuse generi. L'analisi di Kaplan-Meier della sopravvivenza, anche se mostra un andamento simile, come l'analisi statistica logistico ordinale, non era abbastanza sensibile da rivelare differenze significative anche quando generi sono state fuse (Figura 3).
| NS 1 | La arti posteriori presenta una strombatura anormale, cioè, è compressa o parzialmente crollato verso linea mediana laterale O trema durante la sospensione della coda o si è retratto / giunte. | Andatura normale o leggermente più lento. | N / A |
| NS 2 | La arti posteriori è parzialmente o completamente crollato, che non si estende molto. Ci potrebbe still essere movimento articolare. | La arti posteriori è utilizzato per il movimento in avanti ma le dita arricciarsi verso il basso almeno due volte nel corso di un 75 centimetri passeggiata o qualsiasi parte del piede è trascinando fondo gabbia / tavolo. | Il mouse è in grado di raddrizzarsi entro 10 secondi da entrambi i lati. |
| NS 3 | Paralisi rigida in arti posteriori OR minimo movimento articolare. | Movimento in avanti però il arti posteriori non viene utilizzata per il movimento in avanti. | Il mouse è in grado di raddrizzarsi entro 10 secondi da entrambi i lati. |
| NS 4 | Paralisi rigida negli arti posteriori. | Nessun movimento in avanti. | Il mouse non è in grado di raddrizzarsi entro 10 secondi da un lato SIA. |
Tabella 1: Sintesi delle osservazioni fenotipiche utilizzati per assegnare i punteggi neurologici.
| Frequenza di NS1 | Frequenza di NS2 | Frequenza di NS3 | ||||
| Maschio | Femminile | Maschio | Femminile | Maschio | Femminile | |
| Numero di topi | 90 | 94 | 90 | 94 | 90 | 94 |
| Minimo | 12 | 5 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 25% | 29 | 16 | 4 | 4 | 0 | 0 |
| Mediano | 37 | 27.5 | 5 | 5 | 1 | 1 |
| 75% | 44 | 37.5 | 7.5 | 6.5 | 2.5 | 3 |
| Massimo | 61 | 60 | 28 | 11 | 8 | 9 |
Tabella 2: analisi della frequenza dei dati di NS da topi non trattati SOD1-G93A segnati tutti i giorni dalle 50 giorno età fino alla morte. Le distribuzioni sono stati calcolati per NS 1, 2 e 3.
Figura 1. Rappresentazione grafica del numero di giorni trascorsi in ogni NeuroScore anomalo per ogni mouse da parte della popolazione di non trattato topi SOD1-G93A nella nostra colonia nel corso del 2014 (maschio n = 90, femminile n = 94). Le frequenze di punteggio per lo stesso i topi sono rappresentate per ogni possibile NS. NS 4 è stata omessa in quanto l'evento può avvenire solo una volta nella vita di ogni mouse per definizione. Clicca qui per visualizzare un versio più grande n di questa figura.
Figura 2 Un grafico tipico ordinale logistico statistico analisi confrontando la progressione della malattia neurologica di topi TDI173 trattati (linea rossa) per i rifiuti corrispondenti topi di controllo trattati con veicolo.. (Linea blu; Segnalato valori di p rappresentano log-rank test del chi quadrato) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Figura 3 Un grafico tipico di Kaplan-Meier analisi a confronto la durata della vita dei topi TDI173 trattati (linea rossa) per i rifiuti corrispondenti topi di controllo trattati con veicolo (linea blu; p-value riportati rappresentano log-rank test).jove.com/files/ftp_upload/53257/53257fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo rapporto, si descrive un protocollo video semplice e veloce che, se applicata correttamente, è in grado di valutare in modo affidabile la progressione della malattia nei topi SOD1-G93A e identificare cambiamenti indotte da farmaci. Mentre diversi gruppi hanno sviluppato sistemi di scoring fenotipiche per i topi SOD1-G93A 8-10, spesso non forniscono dettagli sufficienti sulla procedura e sono inadeguati per la replica. Come risultato, sistemi di scoring sono raramente utilizzati all'esterno del gruppo specifico che le sviluppa. In questa relazione, la combinazione di un manoscritto dettagliata con il video riduce al minimo le ambiguità di punteggio e di variabilità inter-sperimentatore consentendo così per il protocollo da adottare da altri laboratori e che consentono il confronto tra gli studi che si svolgono presso diverse impostazioni.
Il sistema di punteggio neurologico descritto nella presente relazione, denominata NeuroScore, genera dati ordinali dove i valori numerici esatti attribuiti ai gruppi di segni e symptoms non hanno alcun significato al di là di stabilire classificato la gravità della malattia. In questo caso, NS 0 è lo stato di malattia meno grave e significa un mouse con funzione hindlimb normale mentre NS 4 è lo stato di malattia più grave con topi in avvicinamento o morbosità secondaria a malattia neuromuscolare. Anche se il sistema di punteggio si avvale di soglie sintomatici, ogni valore ordinale NS comprende un ampio spettro di possibili presentazioni cliniche, molti dei quali sono stati catturati su video e incluse in questo rapporto.
NS 1 comprende lo spettro dei primi sintomi della malattia nei topi SOD1-G93A, che possono variare ampiamente da mouse per il mouse. Alcuni topi mostrano una strombatura anormale con le zampe posteriori collasso verso la linea mediana, mentre altri mostrano tremori arti posteriori e alcuni mostrano anche degli arti posteriori retrazione o stringendo. Inoltre, nelle fasi iniziali della malattia NS di alcuni topi possono fluttuare per diversi giorni tra NS 1 e 0. Invariabilmente però, in SOD1-G93A topi frequenzadi NS 1 aumenta con il tempo e comprende più dei diversi fenotipi descritti. In media, maschile e femminile SOD1-G93A topi spendono rispettivamente 37 e 28 giorni in questa fase.
NS 2 rappresenta l'insorgenza di paralisi (leggera o parziale paralisi) e fornisce la prova innegabile la presenza di patologia. Anche se non è raro che un topo wild-type a volte presenti come NS 1, NS 2 si verifica solo nei topi SOD1-G93A. Analogamente al NS 1, NS 2 cattura uno spettro di segni e sintomi. In una presentazione fase iniziale di NS 2 il mouse è ambulatoriale ed energico. Una presentazione più avanzata di NS 2 rivela un mouse con una capacità molto limitata di muoversi. Paresi avanzata nelle arti posteriori può impedire i topi di raggiungere il cibo e acqua nella parte superiore della gabbia, in modo pellets alimentari devono essere collocati nella parte inferiore della gabbia o dovrebbero essere forniti cibo idratata. Inoltre, i tubi sipper più lunghi dovrebbero essere immessi sul bottiglie d'acqua. SOD1-G93A topi typically trascorrere 5 giorni in questa fase.
NS 3 significa la paralisi completa degli arti posteriori, e da tutti i conti è il fenotipo più facile da identificare e punteggio. I sintomi di paralisi previsti dai NS 3 possono essere sia flaccido o spastica, ma sono in genere spastica. A questo punto, i topi sono molto malato e devono essere monitorati frequentemente. In media, i topi SOD1-G93A spendere 1 o 2 giorni in questa fase.
NS 4 indica l'assenza di "riflesso di raddrizzamento" che non dipende esclusivamente funzione hindlimb come NS 0-3 ma riflette l'intero benessere corpo del mouse. La capacità di un mouse per dare prova di una normale "riflesso di raddrizzamento" richiede motivazione, energia, ma anche la funzione di più gruppi muscolari tra cui arti posteriori, arti anteriori, e l'addome. È importante notare che la progressione della malattia in questi topi spesso non è simmetrico ed un mouse che può completare con successo il riflesso di raddrizzamento quando posto su un lato may essere incapace di fare in modo che quando posizionato sull'altro lato. È quindi importante, per il trattamento umano degli animali e per l'integrità dello studio, per effettuare test su entrambi i lati e eutanasia il mouse se non riesce a raddrizzarsi su entrambi i lati.
NS 4 definisce la data di eutanasia e di default si allinea direttamente con i dati di sopravvivenza. Tuttavia, la progressione complessiva della malattia, come definito da analisi di regressione ordinale di NS, potrebbe non completamente sovrapporsi di Kaplan-Meier curve di sopravvivenza e dati di peso corporeo. Alcuni interventi terapeutici possono influenzare l'insorgenza della malattia o sintomi, ma non riescono a impattare la durata della vita in generale.
Mentre non discusso in profondità in questa relazione, il peso corporeo può essere un'altra misura che può essere utilizzato in combinazione per NS per valutare l'insorgenza della malattia e la progressione in SOD1-G93A tuttavia può essere distorta da differenze nelle diete e terapie che causano edema o influenza metabolismo dei grassi 11,12.
13 e non degli arti posteriori deficit motori, un fenotipo che non viene catturato dai NeuroScore. Un altro limite di questo protocollo è il fatto che è stato progettato per e si applica solo alle alte copia topi SOD1-G93A. Nella nostra esperienza, la presentazione clinica della malattia in altri modelli murini di SLA, come il low copy SOD1-G93A del mouse 14 o il TDP-43 del mouse 15,16, è diverso da quello in alta copia topi SOD1-G93A e questo sistema NS potrebbe essere poco adatta per i modelli. Pertanto, è importante determinare il numero di copie di transgene topi prima di assegnare loro studi e verificare che è uguale a quella di alta copia topi controllo positivo. Indipendentemente da ciò, i benefici di noiing questo sistema di punteggio neurologico superano i suoi limiti e questo protocollo video può servire come un eccellente strumento di formazione per i ricercatori SLA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 002726 | Strain of mice used in this study |
| Breeders | Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA | Colony maintainance | |
| Scale | Navigator OHAUS, Parsippany, NJ | Model N14120 | Used to weigh mice |
| Nutra-GelH | Bio-Serv, Flemington, NJ | #S4798 | Wet food provided to sick mice |
| Irradiated Lab Animal Diet | Harlan, Indianapolis, IN | 2918-111914M | Chow diet |
| Lab-grade Sani-chips | Harlan Teklad, Indianapolis, IN | 7090 | Bedding |
| JMPH | SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC | v10.0.2 | Statistical software |
| Microsoft Excel | Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA | Excel 2013 (v 15.0) | Spreadsheet software |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad software Inc., La Jolla, CA | v5.4 | Graphing software |
| Mouse Huts | Bio-Serv, Flemington, NJ | K3272 | For environmental enrichment |
References
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