Introduction
Desde o seu desenvolvimento em meados de 1990, o modelo de camundongo transgênico SOD1-G93A tem sido o modelo animal mais utilizado da esclerose lateral amiotrófica (ELA) 1. Este modelo de ratinho transgénico foi geneticamente manipulada para sobre-expressar uma forma mutante do gene de Cu / Zn superóxido dismutase humana 1 (SOD1) portador da ALS-glicina associada a mutação da alanina no aminoácido 93 (G93A). A mutação G93A é uma das muitas mutações no gene SOD1 que colectivamente make-up de cerca de um quinto casos de ALS familiar 2.
O modelo SOD1-G93A tornou-se uma força de trabalho de pesquisa de desenvolvimento de drogas ALS porque, além de sua óbvia ligação genética para ALS, ele recapitula muitas das características patológicas do ALS em seres humanos, como a perda do neurônio motor, fraqueza muscular progressiva e atrofia, com eventual paralisia e morte 3. Embora, como é frequentemente o caso com os modelos animais transgénicos, existe uma bi inerenteological variabilidade associada com os ratos SOD1 G93A-. Scott et ai. ter determinado que as coortes de pelo menos 24 ratinhos com equilíbrio de gênero de correspondência de maca são necessários em projetos de estudo fármaco-eficácia, a fim de superar o ruído criado pela variabilidade biológica 4. O grande número de animais necessários nestes estudos, em combinação com a progressão da doença agressiva e a necessidade de acompanhamento diário proíbe a utilização de, técnicas demoradas e potencialmente estressantes elaboradas para medir força e função neuromuscular (por exemplo, eletromiografia, força de preensão, rotorod , etc). Em vez disso, ele destaca a necessidade de uma ferramenta de triagem in vivo que avalia de forma confiável a função neuromuscular de camundongos SOD1-G93A de uma forma rápida.
No ALS TDI foi desenvolvido um protocolo que permite a avaliação confiável da função neuromuscular de camundongos SOD1 G93A-em menos de 30 segundos por rato em média. Este protocolo encompasses avaliação diária da função dos membros posteriores utilizando um sistema simples de pontuação neurológica (NeuroScore), que é descrita neste relatório na imprensa e em vídeo. NeuroScore está focada em função dos membros posteriores porque os déficits dos membros posteriores são os primeiros relatados sinal neurológico da doença nos ratos SOD1 G93A-5,6. Além disso, o protocolo desenvolvido pela ALS TDI fornece uma avaliação imparcial do início da paresia (paralisia leve ou parcial), progressão e gravidade da paralisia e é sensível o suficiente para identificar as alterações induzidas pela droga na progressão da doença.
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Protocol
Todos os experimentos são conduzidos de acordo com os protocolos descritos pelos Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais e foram aprovados pelo cuidado com os animais institucional e uso comitê do ALS TDI (IACUC).
1. Os animais, habitação e desenho do estudo
Nota: O rato colônia SOD1-G93A foi derivado do elevado número de cópias B6SJLTgN (SOD1G93A) estirpe 1Gur originalmente produzido por Gurney et al 7.. A colónia está actualmente a ser mantido pelo cruzamento de machos transgénicos C57BL / 6-SJL com o tipo selvagem fêmeas C57BL / 6-F1 SJL. Os animais F1 são gerados pelo cruzamento de SJL machos com fêmeas B6. Os ratinhos são enviados para a ALS TDI semanal em 35-45 dias de idade.
- Permitir ratinhos pelo menos uma semana de aclimatação à unidade de animais (12-h luz / escuridão a uma temperatura de 18-23 ° C e 40-60% de humidade) antes de atribuir a um estudo.
- Casa masculino SOD1 G93A-mice um rato por gaiola, desde grupo alojados machos tendem a lutar. Casa ratos fêmea SOD1-G93A até dois por gaiola. Proporcionar um enriquecimento ambiental, na forma de cabanas de plástico. Fornecer alimentos e água ad libitum, a menos que os ratos são parte de um estudo que requer a administração do fármaco em água potável / alimento. Nestes casos, ração e comida registro e água.
- Começar um estudo fármaco-eficácia em torno de 50 dias de idade e incluem 64 camundongos com equilíbrio de gênero de correspondência de maca (32 por coorte). Por fim, garantir que os investigadores realizam os estudos estão cegos para as condições experimentais.
Nota: É recomendado que um estudo típico droga-eficácia começa no dia de idade 50 Contudo, com base no tipo de intervenção terapêutica pode ser preferível começar o estudo mais cedo ou mais tarde.
Nota: Um estudo com 32 ratos por grupo é alimentado para detectar drogas efeitos específicos de cada sexo. Se não forem necessárias comparações específicas de gênero, 24 ratos por grupo deve ser suficiente para detectar drogas efeitos globais.
2. Peso Corporal
- Os pesos corporais para todos os ratinhos a ficha em estudos diariamente com uma precisão de um décimo de um grama. Nota: O peso corporal é um indicador sensível da progressão da doença e de qualquer mal-estar que pode resultar do tratamento crônico de drogas.
- Corpo pesos mouse variar consideravelmente durante o curso de um dia, sendo maior no período da manhã, assim gravá-los em torno do mesmo tempo todos os dias.
3. Neurological Scoring System (NeuroScore)
- Avaliar pontuações neurológicas (NS) para cada rato diariamente, observando o mouse sob as seguintes três condições realizadas sequencialmente: a) o mouse é suspenso pela cauda, b) o mouse é permitido andar, e após o início da paralisia c) a rato é colocado no seu lado.
- Para o teste de suspensão pela cauda, segurar o rato de cerca de 1,5 "a partir da base da cauda sobre a parte superior do fio da sua gaiola durante 1-2 segundos, para longe da bacia de alimentos, enquanto observing membros posteriores. Repita o teste de suspensão 3 vezes e registar o resultado mais consistente.
- Para o teste de caminhada, coloque o mouse sobre uma superfície limpa que fornece alguma tração e uma curta distância de 25 cm (eg., Uma toalha de papel gravada para baixo para evitar o deslize). Permitir que o mouse para andar um total de 75 cm (comprimento 3X da toalha de papel), observando a marcha.
- Para o teste de "reflexo de endireitamento", coloque o mouse sobre o lado esquerdo ou direito e usando um cronômetro medir o tempo que leva para se endireitar-se sem ajuda de ambos os lados. Nota: Apenas um estudo deste teste é necessário.
- Determine o NS de cada membro posterior (esquerda ou direita) de forma independente em uma escala de 0 a 4. Nota: Por exemplo, uma pontuação de 0, 1 indica que o membro esquerdo NS é 0, enquanto o direito dos membros posteriores NS é 1.
- Atribuir pontuações neurológicas (0-4) que correspondem ao seguinte conjunto de observações (resumo no Quadro 1):
- Atribuir NS 0 (pré-sintomático) se o seguinte é observado: Quando o mouse é suspenso pela cauda, o membro posterior apresenta um splay normal, ou seja, ele está totalmente estendido longe da linha média lateral e permanece nessa posição por 2 segundos ou mais longo. Quando o mouse é permitido andar, marcha normal é observado.
- Atribuir NS 1 (primeiros sintomas) se o seguinte é observado: Quando o mouse é suspenso pela cauda, o membro posterior apresenta um splay anormal, ou seja, é recolhido ou ruiu parcialmente em direção a linha média lateral ou ela treme durante a suspensão da cauda ou é retraída / apertou. Quando o mouse é permitido andar, marcha normal ou um pouco lento é observado.
- Atribuir NS 2 (início da paresia) se o seguinte é observado: Quando o mouse é suspenso pela cauda, o membro posterior é parcial ou completamente destruídas, não se estendendo muito. (Há ainda pode ser o movimento articular). Quando o mouse é permitido andar, o membro posterior é usado para mot frenteion no entanto enrolar os dedos dos pés para baixo, pelo menos duas vezes durante a 90 centímetros caminhada ou qualquer parte do pé está se arrastando ao longo fundo da gaiola / table. Quando o mouse é colocado em seu lado esquerdo e direito, ele é capaz de endireitar-se dentro de 10 segundos de ambos os lados.
- Atribuir NS 3 (Paralisia) se o seguinte é observado: Quando o mouse é suspenso pela cauda, há paralisia rígida na hindlimb OU movimento articular mínima. Quando o mouse é permitido andar há movimento para a frente no entanto, o membro posterior não está sendo usado para o movimento para a frente. Quando o mouse é colocado em seu lado esquerdo e direito, ele é capaz de endireitar-se dentro de 10 segundos de ambos os lados. Nota: Raramente, após o início da paralisia, umidade urina pode aparecer nos membros posteriores. Umidade urina não tratada pode resultar em urina "queimadura" e lesões de pele. Trate umidade urina por corte o cabelo, aplique água morna para remover absorve a urina, e secar delicadamente. Se as lesões cutâneas estão presentes aplicar antibioTic pomada.
- Atribuir NS 4 (Humane ponto final) se o seguinte é observado: Quando o mouse é suspenso pela cauda, há paralisia rígida nos membros posteriores. Quando o rato é permitido a andar, não há movimento para a frente. Quando o mouse é colocado sobre a sua esquerda e direita ele não é capaz de endireitar-se dentro de 10 segundos a partir do lado também. Ou seja, ausência de reflexo de endireitamento.
4. Entrada de Dados e Análise
- Durante o curso de um estudo de eficácia da droga, inserir os dados coletados para cada rato em um Sistema de Gerenciamento de Informações de Laboratório (LIMS) ou em um software de planilha disponível no mercado.
Nota: O software LIMS ALS TDI-desenvolvido é um repositório central de todos os dados coletados a partir de estudos internos, tornando estes dados convenientemente acessível ao longo do tempo para os pesquisadores ALS TDI. LIMS rastreia qualquer ratinho individual, com a sua identificação única, de volta à sua linhagem, peso corporal ou pontuação neurológica em todos os dias de estudo,e inclui quaisquer outras observações feitas durante a sua vida. LIMS acaba por gerar uma planilha que é usado para análises posteriores. - Após a conclusão de um estudo de drogas eficácia, ou seja, quando todos os ratos atingir o ponto final mais humano, software uso de planilha (consulte a Tabela de Materiais) para calcular a NS combinado para cada rato, para cada dia pela média do membro posterior esquerda e direita NS . Em seguida, calcular a idade média a cada NS para cada rato e do número de dias de cada rato gasta em um determinado NS.
- Analisar as mudanças globais em NS ao longo do tempo, importando os dados do software de planilha eletrônica para o software estatístico (ver Tabela de Materiais). Caber estes dados utilizando um modelo de regressão logística ordinal que estima o NS esperado, com idade média no NS e de tratamento da toxicodependência como efeitos na regressão. Usando o teste do qui-quadrado de log-rank estimar a probabilidade efeito probabilidade e determinar se o efeito da droga-tratamento sobre a progressão NS é estatísticaly significativa (ver arquivo de código suplementar para obter instruções passo-a-passo).
Nota: Um valor de p <0,05 é considerado estatisticamente significativo.
Nota: Este método de análise estatística respeita a natureza ordinal dos dados NS e à natureza variável das trajetórias NS para ratos individuais. É preferível porque as trajetórias individuais NS pode ser marcadamente diferente resultando em NS médias de grupo associado em tempo que não são suficientemente reflexiva de respostas NS. Além disso, em alguns casos NS pode flutuar, particularmente quando na gama de zero a um. - Finalmente, o uso de software de gráficos (ver Tabela de Materiais) para gerar "ordinal esperado NS vs Idade mediana no NS" gráficos para animais tratados com a droga e controle (Figura 2; consulte Código Suplementar arquivo para obter instruções passo-a-passo). Use estes gráficos para estimar convenientemente deslocamentos entre os grupos tratados com o fármaco e de controlo pela interpolação do eixo-y a idade média de início da doença (i.e., NS 2) no eixo dos x.
Nota: A diferença na idade média entre os dois grupos representa uma mudança induzida por drogas e é considerado como uma medida prática da magnitude do efeito.
Nota: desvios para a direita na curva de NS vs idade mediana esperada indicam retardou a progressão da doença sintomática. Por outro lado, os desvios para a esquerda na NS vs a curva idade mediana esperada acelerado indicam a progressão da doença sintomática.
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Representative Results
Os dados da contagem neurológicos para 90 do sexo masculino e 94 do sexo feminino não-tratados ratos SOD1 G93A-estudou em ALS TDI durante 2014 foram avaliados. Os resultados mostram que os ratos macho têm tipicamente uma progressão da doença mais agressivo do que os ratos do sexo feminino, tal como evidenciado por uma proporção maior da sua vida útil no NS 1 em comparação com as fêmeas. NS 2 e 3 NS ocorrem com praticamente a mesma frequência de diferentes sexos. 0 NS foi excluído da análise, porque é considerado um fenótipo "normal". NS 4 também foi excluído porque, por definição, só pode ocorrer uma vez na vida de um SOD1 G93A-rato (Tabela 2 e Figura 1).
NS dados é apresentada a partir de um estudo de progressão da doença eficácia farmacológica do ALS de teste TDI173 composto em ratos SOD1 G93A-(n = 16 por sexo / tratamento; 64 ratos no total). Na Figura 2, a taxa de progressão da doença neurológica é apresentado como capturado por análise de regressão dos dados de C ordinalaptured utilizando o protocolo NeuroScore aqui detalhado. Ratinhos tratados com TDI173 foram comparados com o controlo tratado com veículo. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas quando os sexos foram analisadas separadamente, mas a significância estatística foi alcançada quando os sexos foram fundidas. A análise Kaplan-Meier da sobrevivência, apesar de mostrar tendências semelhantes, como a análise estatística logística ordinal, não foi sensível o suficiente para revelar diferenças significativas, mesmo quando os sexos foram fundidas (Figura 3).
| NS 1 | O membro posterior apresenta um splay anormal, ou seja, é recolhido ou ruiu parcialmente em direção a linha média lateral ou ela treme durante a suspensão da cauda ou ele é retraído / entrelaçadas. | Marcha normal ou ligeiramente mais lento. | N / D |
| NS 2 | O membro posterior é parcialmente ou completamente em colapso, não se estendendo muito. Pode stmal estar de movimento articular. | O membro posterior é usado para movimento para a frente no entanto enrolar os dedos dos pés para baixo, pelo menos duas vezes durante a 75 centímetros caminhada ou qualquer parte do pé está se arrastando ao longo fundo da gaiola / table. | O mouse é capaz de endireitar-se dentro de 10 segundos de ambos os lados. |
| NS 3 | Paralisia rígida na hindlimb OU movimento articular mínima. | Movimento para a frente no entanto, o membro posterior não está sendo usado para o movimento para a frente. | O mouse é capaz de endireitar-se dentro de 10 segundos de ambos os lados. |
| NS 4 | Rígida paralisia nos membros posteriores. | Nenhum movimento para a frente. | O rato não é capaz de endireitar-se dentro de 10 segundos de um lado quer. |
Tabela 1: Resumo das observações fenotípicas usados para atribuir pontuações neurológicas.
| Frequência de NS1 | Frequência de NS2 | Frequência de NS3 | ||||
| Macho | Feminino | Macho | Feminino | Macho | Feminino | |
| Número de Mice | 90 | 94 | 90 | 94 | 90 | 94 |
| Mínimo | 12 | 5 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 25% | 29 | 16 | 4 | 4 | 0 | 0 |
| Mediano | 37 | 27,5 | 5 | 5 | 1 | 1 |
| 75% | 44 | 37,5 | 7,5 | 6.5 | 2.5 | 3 |
| Máximo | 61 | 60 | 28 | 11 | 8 | 9 |
Tabela 2: Análise da frequência de dados NS a partir de ratinhos não tratados SOD1 G93A-marcados diariamente desde o dia 50 até idade morte. Distribuições foram calculados para NS 1, 2, e 3.
Figura 1. Representação gráfica do número de dias passados em cada NeuroScore anormal para cada rato a partir da população de não tratada ratos SOD1-G93A em nossa colônia durante 2014 (masculino n = 90, do sexo feminino n = 94). As frequências de pontuação para o mesmo camundongos são representados para cada possível NS. NS 4 foi omitido porque o evento só pode ocorrer uma vez na vida de cada rato, por definição. Por favor clique aqui para ver uma maior versio n desta figura.
Figura 2 Um ordinal logística gráfico análise estatística típica comparando a progressão da doença neurológica dos ratos tratados com TDI173 (linha vermelha) para maca pareados ratos controlo tratados com veículo.. (Linha azul; Relatado p-valores representam teste log-rank qui-quadrado) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 3 Um gráfico típico de Kaplan-Meier análise comparando tempo de vida de camundongos tratados com TDI173 (linha vermelha) para maca pareados ratos controlo tratados com veículo (linha azul; p-valores referidos representam teste log-rank)."target =" _ blank jove.com/files/ftp_upload/53257/53257fig3large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste relatório, nós descrevemos um protocolo de vídeo rápido e simples que, se aplicada corretamente, é capaz de avaliar de forma confiável a progressão da doença em camundongos SOD1-G93A e identificar as alterações induzidas pela droga. Embora diferentes grupos desenvolveram sistemas de pontuação fenotípicas para ratos SOD1 G93A-8-10, que muitas vezes não fornecem detalhes suficientes sobre o procedimento e são insuficientes para replicação. Como resultado, sistemas de pontuação são raramente utilizadas fora do grupo específico que os desenvolve. Neste relatório, a combinação de um manuscrito detalhado com vídeo minimiza ambiguidades de pontuação e variabilidade inter-experimentador, permitindo assim o protocolo a ser adotada por outros laboratórios e que permitam comparações entre os estudos que estão ocorrendo em diferentes configurações.
O sistema de pontuação neurológica descritos neste relatório, referido como NeuroScore, gera dados ordinais, onde os valores numéricos exatos atribuídos aos conjuntos de sinais e symptoms não têm nenhum significado além de estabelecer a gravidade da doença classificado. Neste caso, 0 NS é o estado de doença menos grave, e significa um rato com a função dos membros posteriores normal, enquanto NS 4 é o estado de doença mais grave com ratinhos a que se aproxima ou morbidade secundária a uma doença neuromuscular. Mesmo que o sistema de pontuação faz uso de limiares sintomáticos, cada valor NS ordinal abrange um amplo espectro de apresentações clínicas possíveis muitos dos quais foram capturados em vídeo e incluídas neste relatório.
NS 1 engloba o espectro de sintomas precoces da doença em camundongos SOD1-G93A, que podem variar amplamente de mouse para mouse. Alguns ratos apresentam um splay anormal com os membros posteriores colapso direção à linha média enquanto outros mostram tremores dos membros posteriores e algumas até mesmo mostraram retração dos membros posteriores ou clasping. Além disso, nas fases iniciais da doença de NS de alguns ratinhos pode flutuar durante alguns dias entre NS 1 e 0. Invariavelmente, embora, em SOD1 G93A-ratinhos a frequênciade NS 1 aumenta com o tempo e que inclui mais e mais dos diferentes fenótipos descritos. Em média, os ratos do sexo masculino e feminino SOD1 G93A-normalmente gastam 37 e 28 dias, respectivamente, nesta fase.
NS 2 representa o início de paralisia (paralisia ligeira ou parcial) e fornece provas inegáveis para a presença da patologia. Enquanto não é incomum para um rato de tipo selvagem, por vezes, apresentam como NS 1, NS 2 só ocorre em camundongos SOD1-G93A. Da mesma forma a NS 1, NS 2 captura um espectro de sinais e sintomas. Em uma apresentação fase inicial de NS 2 o mouse é ambulatorial e energético. Uma apresentação mais avançado de NS 2 revela um mouse com uma capacidade muito limitada para se mover. Avançada paresia dos membros posteriores podem impedir a ratinhos de atingir a comida e água no topo da gaiola, de modo peletes alimentares deve ser colocado no fundo da gaiola ou alimento hidratado deve ser fornecida. Além disso, os tubos mais longos sipper deve ser colocado em garrafas de água. SOD1 G93A-ratos typically passar 5 dias nesta fase.
NS 3 significa paralisia dos membros posteriores completa, e por todas as contas é o fenótipo mais fácil de identificar e marcar. Os sintomas de paralisia abrangidos pela NS 3 pode ser flácida ou espástica, mas são tipicamente espástica. Por esta altura, os ratos são muito doente e deve ser monitorizada frequentemente. Em média, os ratos SOD1 G93A-gastar 1 a 2 dias nesta fase.
NS 4 denota a ausência de "reflexo correcto" que não dependem exclusivamente função dos membros posteriores como NS 0-3 mas em vez disso ela reflete todo o bem-estar do corpo do rato. A capacidade de um rato para demonstrar um "reflexo de endireitamento" normal requer motivação, a energia, mas também a função de vários grupos musculares, incluindo membros posteriores, membros anteriores e abdômen. É importante notar que a progressão da doença nestes ratos é frequentemente não simétrico e um rato que pode completar com sucesso o reflexo de endireitamento, quando colocado num lado may ser incapazes de fazer isso, quando colocado no outro lado. Portanto, é importante, para o tratamento humano dos animais e para a integridade do estudo, para realizar testes em ambos os lados e eutanásia do rato se não conseguir endireitar-se em ambos os lados.
NS 4 define a data da eutanásia e, por padrão alinha diretamente com dados de sobrevivência. No entanto, a progressão global da doença, tal como definido por análise de regressão ordinal de NS, não pode sobrepor-se completamente com as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e os dados do peso do corpo. Certas intervenções terapêuticas podem influenciar o aparecimento ou sintomas da doença, mas não conseguem impactar a vida útil total.
Embora não seja discutida em profundidade neste relatório, o peso corporal pode ser uma outra medida que pode ser utilizado em combinação com a SN para avaliar o início da doença e progressão em SOD1-G93A no entanto, pode ser enviesada por diferenças nas dietas e por terapêutica que causam edema ou influência o metabolismo da gordura 11,12.
13 e não os défices motores, um fenótipo que não é capturada pela NeuroScore. Outra limitação do presente protocolo é o fato de que ele foi projetado para e se aplica somente a alta de cópia ratos SOD1 G93A-. Em nossa experiência, a apresentação clínica da doença em outros modelos do rato do ALS, como o baixo número de cópias SOD1 G93A-rato 14 ou o TDP-43 do mouse 15,16, é diferente do que no alto cópia ratos SOD1 G93A-e este sistema NS pode ser mal adaptados para esses modelos. Assim, é importante para determinar o número de cópias do transgene de ratinhos antes de atribuir-lhes a estudos e verificar se ele é igual ao elevado número de cópias de ratinhos de controlo positivo. Independentemente disso, os benefícios de nósing este sistema de pontuação neurológica superam suas limitações e este protocolo de vídeo pode servir como uma excelente ferramenta de treinamento para pesquisadores ALS.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 002726 | Strain of mice used in this study |
| Breeders | Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA | Colony maintainance | |
| Scale | Navigator OHAUS, Parsippany, NJ | Model N14120 | Used to weigh mice |
| Nutra-GelH | Bio-Serv, Flemington, NJ | #S4798 | Wet food provided to sick mice |
| Irradiated Lab Animal Diet | Harlan, Indianapolis, IN | 2918-111914M | Chow diet |
| Lab-grade Sani-chips | Harlan Teklad, Indianapolis, IN | 7090 | Bedding |
| JMPH | SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC | v10.0.2 | Statistical software |
| Microsoft Excel | Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA | Excel 2013 (v 15.0) | Spreadsheet software |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad software Inc., La Jolla, CA | v5.4 | Graphing software |
| Mouse Huts | Bio-Serv, Flemington, NJ | K3272 | For environmental enrichment |
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