Introduction
yöntem tarif amaçları adrenal aktivite non-invaziv bir değerlendirme sağlamak amacıyla at dışkısı kortikosteron konsantrasyonları analiz etmek. hipotalamus-hipofiz-adrenal (HPA) eksen aktivitesinin ölçülmesi esir ve yerli türler hem potansiyel caydırıcı durumlara tepki incelemek için kabul edilmiş bir yaklaşımdır. Referans tekniği ve en yaygın olarak kullanılan yöntem, ancak bu tür dışkı analizi gibi alternatif yöntemler bilgilerini kadar tür izleme olanağı kan örneği kendisinin neden olduğu stres üstesinden gelmek ve sağlamak amacıyla geliştirilmiştir kan plazması 1 'in kullanımı olup.
caydırıcı bir durum sırasında, fizyolojik homeostasis bozulur. ön hipofiz bezi üzerinde hareket eder ve adrenokortikotropik hormon (ACTH) salınımını uyarır salgılatıcı hormon (CRH) kortikotropin beyin sürümlerde hipotalamus. ACTH kan dolaşımına girer ve türünden salgılaması için adrenal korteksi uyarırs, belirli glukokortikoidler (GC). Glukokortikoidler yakından oldukça tutarlı nedenle genellikle diğer stres bağlantılı hormonların üzerinde 2 tercih ölçülen tüm enerji artan devletler üretilen daha stresli olaylarla bağlantılıdır. Glukokortikoidler atların birçok adaptif etkileri sorumludur. Enerji hızlı yağlı asitler ve glukoz şeklinde vücuda depolama sitelerinden mobilize, oksijen alımı sensör fonksiyonu 3 geliştirilmiş ve kan akımı hareket 4 için gerekli olmayan alanlara azaltılır, artar. Yanı sıra bir başa çıkma mekanizması olarak hareket olarak, Glukokortikoid stres kaynaklı artış da sonraki stresör 5 için hayvan hazırlamak için yardımcı olabilir.
Hormon plazmadaki düzeyleri ve tükürük değerlendirilmesi gaita önlemler hormon metabolik son ürünü metabolitleri ölçmek, ancak gerçek dolaşan hormonu ölçüm içerir. Sirkülasyon steroid l katabolize edilenonlar bağırsak parça 6 içinde bakteri florasının enzimatik faaliyetleri kolaylaştırdı ileri değişikliklere uğrarlar safra için atılımı önce Iver. Bu nedenle, kan glukokortikoid yönelik bağışıklık dışkı glukokortikoid metabolitlerin 7 analizi için uygun olmayabilir.
Dışkı toplanması, at için bir rahatsızlık ile gerçekleştirilebilir gibi, kortikosteron için dışkı analizi, koşullar, bir dizi HPA etkinliğini izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Atların dışkı içinde yükseltilmiş kortikosteron ameliyat sonrası tedavisi için veteriner hekimliğinde 8 boyunca ve kısıtlayıcı yuva 9 da dahil olmak üzere, potansiyel olarak caydırıcı durumlara cevap olarak bildirilmiştir. Fekal örnekleme zamanla toplanmış glukokortikoid düzeyi ziyade uzun vadeli, kronik veya mevsimsel desenleri 10 izlenmesi için uygun hale plazma ve tükürük tarafından sunulan zaman örnekleme noktasını yansıtır. Nedeniyle non-invaziv içinYöntemin niteliği, numuneler yakalama veya bağlama 11 gerek kalmadan bir birey için, art arda toplanabilir. Bir numune alma protokolü planlama Ancak, türe özgü bağırsaktan geçiş süresi dikkate alınmalıdır. Atlarda, bağırsaktan geçiş süresi bu • durumda, böbrek üstü tepkisi ve daha sonra kortikosteron metabolitleri HPA ekseninin ilk aktivasyon bir gün sonra dışkı ile saptanabilir yaklaşık 18 saat 12'dir.
Non-invaziv immunoassay teknikleri kullanılarak zaman araştırılan türler için dikkatli bir doğrulama 13 esastır. Buna ek olarak, hormon metabolit boşaltım cinsiyet farkları nedeniyle metabolizma hızı ve fareler 14. ve tavuk 15 de dahil olmak üzere çeşitli türlerin atılır kortikosteron metaboliti türü farklılıkları muhtemelen bildirilmiştir. th ayrıntılı gibi deney erkek ve dişi, evcil atlar uygulamalarında kullanmak için geçerli olan bu yöntemin bir parçası olarak, bu nedenle önemlie protokolü. Cinsiyetler arasındaki hormon metabolizmasında Bu fark ele alınması ve tahlil doğrulama parçası olarak dahil nadiren edilir henüz veri kalitesi için sonuçları vardır.
Bu non-invaziv yöntem yerli atlar adrenal aktivitenin uzun süreli değerlendirmesini sağlar. protokol ayrıntıları testin geçerliliği ve tahlil tekniği kendisi hem de.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik açıklama: Alan örnekleme ve hayvan denekleri prosedürleri Nottingham Trent Üniversitesi'nde Animal, Kır ve Çevre Bilimi (ARES) Okulu tarafından onaylanmıştır.
Dışkı Örneklerinde 1. Koleksiyonu
NOT: Dışkı örnekleri ve metanol tutarken eldiven giyilmelidir. Bir hayvan gibi de giyilmelidir bir laboratuvar önlüğü gibi zoonotik hastalık, koruyucu giysiler muzdarip olabileceğini güçlü bir şüphe varsa.
- dışkılama aşağıdaki (birkaç saat için dakika içinde) en kısa sürede dışkı örnekleri toplamak ve örnek bir torbaya koyun. yaklaşık 10 g toplam ağırlığa sahip bir defecated numunenin üç ila beş Alt-numûnelerin al. zaman ve toplama, bireysel kimlik tarihi ile çanta Etiket ve analize kadar -20 ° C'de örnek dondurmak.
- tüm örnekleri dondurmak, hatayı en aza indirmek için -20 ° C kadar çalışma tamamlandığında sonra tek bir toplu olarak analiz için bir araya örnekleri toplamak. </ Li>
2. Dışkı Hormon Ekstraksiyon
- Oda sıcaklığında çözülmeye dışkı örnekleri bırakın.
- Numuneler el ile kendi örnek torba içinde her numune karıştırılarak homojenize emin olun.
- Her bir numune, ağırlığa tekne bir mikro 0.50 dışkı maddesi (g 0.003 ±) ağırlığında için daha sonra bir 8 ml bir cam şişeye dışkı aktarın. Her bir numune için yeni bir ağırlık teknesi kullanın ve her bir numune arasında% 30 metanol ile cımbız temizleyin.
- 5% 90 ml metanol ile, dışkı maddesinin 0.5 g 'ını: su, ve oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıda O / N sallayın.
- Ertesi sabah, örnek karıştırın ve daha sonra 600 g'de 20 dakika boyunca santrifüj.
- 37 ° C lik bir sıcaklığa ayarlanmış bir su banyosu içinde rafa 16 x 125 mm cam tüpe 2 ve yerine metanol fraksiyonu süzün. Bir çeker ocak içinde hava ile kuruyana kadar buharlaştırın. ekstraksiyon şişeyi yıkayın ve bertaraf için bir klinik atık torbasına kalan dışkı pelet yerleştirin.
- % 100 1 ml metanol dışkı özü yeniden askıya ve 12 x 75 mm2 bir polipropilen tüpü içine transfer. Hemen analiz edilinceye kadar -20 ° C'de kap saklayın.
3. Hormon Analizleri
- poliklonal kortikosteron CJM006 antiserum kullanarak bir enzim bağlantılı-immunoassay (EIA) ile analizi yürütmek.
NOT:. İkinci ÇED (Kortizol R4866 antiserum test edilmiştir, fakat bu (Bölüm 4.1 bakınız) poliklonal kortikosteron CJM006 antiserum ve kortizol R4866 antiserum ve ilgili HRP en CJ Munro, California Üniversitesi tarafından sağlanan biyokimyasal doğrulama adımı gerçekleştirmek için başarısız, Davis, CA - 1 ile antiserumun seyreltilir: kaplama tamponu (0.05 M NaHCO3, pH 9.6) 'de 15,000 tekrar pipet ve 50 ul bir pipet kullanarak, / göz 50 ul, 96 oyuklu bir mikrotitre plakası yükleyin. Bir plaka kapatıcı ile örtün ve plaka, 4 ° C'de O / N inkübe edin. (N, spesifik olmayan bağlayıcı gözenekler temsil kaplanmamış iki kuyu boşSB).
- Kullanımdan hemen önce, bir otomatik mikrotitre plaka yıkayıcısı (0.15 M NaCl,% 0.05 Tween 20 yıkama çözeltisi) kullanılarak, mikro ölçüm levhaları, beş kez yıkayın.
- 1000 ug / - NSB en için oyuk başına 50 ul ve 'sıfır' kuyu [EIA tampon maddesi (0.1 M napo 4, 0.149 M NaCl,% 0.1 sığır serum albümini, pH 7.0) içinde, sadece] standartları (kortikosteron, 3.9 plakaları yük kuyu) veya uygun 01:20 ÇED tamponu seyreltilmiş dışkı özü numuneleri (,) bölüm 4.1'e bakınız. Standartlar ve sıfır sırasıyla üç kez ve dört nüsha olarak çalıştırılmalıdır. Sulandırılmış dışkı özü örnekleri ve NSB en nüsha halinde çalıştırılmalıdır.
- 70.000: 50 ul / oyuk ile 1 EIA tamponu içinde seyreltilmiş etiket yaban turpu peroksidaz bağı ᵻ hemen takip etmektedir.
- Oda sıcaklığında 2 saat boyunca karanlıkta mikrotitre inkübe edin.
- 100 ul ile karanlıkta, oda sıcaklığında plakalar yıkama çözeltisi ile 5 kez mikrotitre plakalar, yıkama ve inkübe / welRT substrat [0.4 mM 2,2'-azino-di- (3-etilbenztiyazolin-sülfonik asit) diamonyum tuzu, 1.6 mM H2O 2, 0.05 M sitrat, pH 4.0] l. kullanımdan hemen önce alt-tabakanın hazırlanması.
- mikrotitre plakaları okumak için 405 nm bir dalga boyunda bir spectrophometer kullanın. Sıfır kuyu optik yoğunluk ile 1.0 0.8 ulaştığında levha kuluçka tamamlandıktan olarak kabul edilir.
- Tekrarlanabilirlik sağlamak için, yaklaşık% 30 (EIA standardı),% 50 (biyolojik numune örneğin, yerli at dışkı ekstresinin havuz) ve% 70 (EIA standardı) bağlamak için ÇED tamponunda seyreltilmiş kontrolleri [ÇED standartları ya da biyolojik bir örnek kullanınız ] sırasıyla <% 10 değişim ve <% 15 oranında bir içi ve inter-analiz katsayılarını göstermek için.
4. Enzim Linked-immunoassay: Çalışma Tür ve Sex Doğrulama
- Biyokimyasal Doğrulama (Paralellik)
- ÇED tampon kullanarak, toplanmış fekal ekstra bir seri seyreltme gerçekleştirmekct, ideal olarak birkaç bireylerden şüphelenilen yüksek ve düşük hormon konsantrasyonu örneklerinden alınan (aralık: temiz, 1: 8192: 2 ile 1) ve 3. bölümde açıklandığı gibi ÇED çalıştırın.
NOT: Dışkı özler seri seyreltme standart eğri ve lineer regresyon sonuçlarına bir deplasman eğrisi paralel verim BIR paralellik sağlanmıştır kabul edilir R2> 0.90, bir yamaç> 0.50 ve p <0.05 göstermektedir. Standart eğri üzerinde% 50 civarında bağlayan seri seyreltilmiş dışkı özü tüm dışkı özler çalıştırmak için ideal bir seyreltme düşünülmelidir (örneğin, 1:20). lineer regresyon sonuçları R2> 0.90 ve p <0.05 göstermek zaman tahlil üzerinde düşünülen hiçbir girişim yoktur.
- ÇED tampon kullanarak, toplanmış fekal ekstra bir seri seyreltme gerçekleştirmekct, ideal olarak birkaç bireylerden şüphelenilen yüksek ve düşük hormon konsantrasyonu örneklerinden alınan (aralık: temiz, 1: 8192: 2 ile 1) ve 3. bölümde açıklandığı gibi ÇED çalıştırın.
- Biyokimyasal Doğrulama (Girişim)
- % 50 sulandırılmış uygun toplanmış seyreltilmiş dışkı ekstresi [200 ul paralleli tarafından belirlenen bağlanma ile (3.9 1000 ng / çukur kortikosteron sıfır) seri olarak seyreltilmiş standartların 200 ul Spikesm (1:20)] ve ÇED analiz arsa ardından bölüm 3'teki gibi ÇED üzerinde çalışan gözlenen konsantrasyon eksi beklenen konsantrasyonuna karşı arka plan (sıfır numunenin konsantrasyonu).
NOT: standartlara seyreltilmiş toplanmış fekal ekstresinin eklenmesi önemli ölçüde miktarı beklenen ve lineer regresyon sonuçlarını değiştirmez vermezse R 2> 0.90, 1.0 ve p <0.05 yakın bir eğim verir. EIA ile hiçbir girişim elde edilmiştir.
- % 50 sulandırılmış uygun toplanmış seyreltilmiş dışkı ekstresi [200 ul paralleli tarafından belirlenen bağlanma ile (3.9 1000 ng / çukur kortikosteron sıfır) seri olarak seyreltilmiş standartların 200 ul Spikesm (1:20)] ve ÇED analiz arsa ardından bölüm 3'teki gibi ÇED üzerinde çalışan gözlenen konsantrasyon eksi beklenen konsantrasyonuna karşı arka plan (sıfır numunenin konsantrasyonu).
- Biyolojik Doğrulama:
NOT: Seçilen ÇED ilgi hormon biyolojik ilgili değişiklikleri ölçmek yeteneğine sahip bir gösteri [örneğin, bir farmakolojik aşağıdaki glukokortikoid konsantrasyonlarda artış ya da biyolojik bir meydan okuma (ACTH genellikle lisanslı bir işlemdir) (örneğin, psikolojik ve / veya çevre; bir fırsatçı düzensiz olay olması daha muhtemeldir)].- Seçin, özü ve glukokortikoid metabolit konsantrasyonları için dışkı örnekleri analizönce ve zorlu bir olaydan sonra 3 - bölümlerde 1 detaylı süreci kullanarak.
NOT: zorlu bir olay özgü türler olacaktır. Bir örnek yöntemi yerli at için aşağıda verilmiştir. Atlar için zorlu olaylarla dolu örnekler yönetimi 9 ve hayvancılık prosedürleri 16 kullanımı dahil, daha önce yayınlanmıştır. zorlu olayın ardından glukokortikoid metabolit konsantrasyonlarında anlamlı bir artış gözlendi ve istatistiksel analiz kullanılarak onaylanmalıdır. Bu, tekrarlı ölçümlerde, örnek tarih ve bireysel etkisini uygun olan yerlerde içermelidir. Biyolojik doğrulama sonra elde sayılır.
- Seçin, özü ve glukokortikoid metabolit konsantrasyonları için dışkı örnekleri analizönce ve zorlu bir olaydan sonra 3 - bölümlerde 1 detaylı süreci kullanarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yurtiçi atları (n = 16, 8 kısrak, 8 geldings) 15 yıl (± 3) yaş ortalaması ile cinsiyete ve sosyal izolasyon (n = 4 at / tedavi) artan seviyeleri ile dört konut tasarımları tabi göre gruplandırıldı. yakından doğal yaşam simülasyonu, bir sürü ortamında yaşayan Konut 1. katılan atlar. kapalı ahırda çiftler yaşayan Konut 2 dahil atlar. Konut 3 tutulan atlar ahırlarda ancak diğer atlar ve atlar konut 4 dahil toplam izolasyon görsel temas yalnız ev sahipliği yapmıştır.
her bir tedaviye maruz kalma, beş günlük bir süre için rastgele bir blok tasarımı oldu. Aşağıda bu atlar sonraki konut tedaviye maruz kalmadan önce iki gün boyunca kendi deney gruplarında çimenlik içine çevrildi. Dışkı örnekleri günlerde 1, 2 günde bir kez toplandı ve 3 n = 8 atları her konut tedavisi (içinde harcananHer tedavi içinde n = 2 atlar). Dışkı numuneleri mümkün olduğu ve dışkılama sonrası 1 saat içinde en kısa sürede toplandı. At konut tedavisine başlanan gün sonra bir ilk örnek en az 20 saat toplandı Bütün numuneler ahır anlam ilk tam gününde 1.200 saat sonra toplandı. Günde bir, iki ve üç (konut tasarım başına 24 numune total) Örnekler nedeniyle digesta 12 geçiş oranı geçmiş 18 saat yansıtıcı dışkı kortikosteron seviyeleri açısından değerlendirildi. aynı birey atlar çalışma boyunca dışkı analizi için kullanılmıştır. Ek ölçülen parametreler yerli atlar için zorlu olayların yayınlanan eser 9 Alternatif örneklere bakın da dahil olmak üzere, bu biyolojik meydan dolu ayrıntılar için de literatürde 16 bulunabilir.
Bu bölümde, her iki cor için bir biyokimyasal doğrulama (paralellik) örnek sonuçlar sağlarerkek ve kadın iç atı dışkısı ticosterone ve kortizol. Bu bölümde ayrıca dışkı çıkarma ve ÇED analizinden elde edilen temsili verileri sağlar. Sonuçlar at davranış ve fizyolojisi 9 üzerine, konut tasarımına yol açtığı sosyal izolasyon etkisini araştırdık daha büyük bir çalışmanın parçası olarak elde edilmiştir.
Biyokimyasal doğrulama sonuçları kortikosteron EIA, R2 = 0,9545, F [Şekil 1A erkek örnek% = bağlayıcı 25,349 + 0,729 (standart% bağlanma) adrenal aktiviteyi ölçmek için uygun olduğunu gösterdi (1, 7) daha = 146,710, p az 0.001); Şekil 1B kadın numune% bağlayıcı = 29,989 + 0,7198 (standart%) R2 = 0,95594, F (1 bağlayıcı, 7) = 151,865, 0.001 az] ancak kortizol ÇED [Şekil 1C erkek örnek% bağlanma p = 79,089 + 0,0629 R2 = 0.175, K, (standart% bağlanma) (1, 7) = 1.485, p = 0.262), Şekil 1B dişi örneği% Bağlanma = 81,652 + 0,0772 (standart% bağlanma), R2 = 0.257, F (1, 7) = 2,422, p = 0.164]. kortikosteron ÇED kortikosteron üzerine kortizol ÇED ve parazit testi aksine paralellik gösterdiği gibi ÇED beklenen miktarını değiştirmemiştir kortikosteron standartlarına seyreltilmiş fekal ekstresinin eklenmesi gibi, matris müdahale bulgusuna rastlanmadı (erkek: Gözlenen = + 1.017 1.302 (Beklenen) R2 = 0,9972, F1, 7 = 1287,128, p <0.001; kadın: Gözlenen = (Beklenen) 0,3169 + 1,0931 R2 = 0,9972, F1, 7 = 2432,65, p <0.001).
ÇED sonuçları erkek atları (M = 37.7, SS = 14.1) ve dişi atlar arasında kortikosteron düzeylerinde anlamlı bir fark olmadığını ortaya koymuştur (M = 33.8, SD = 12.7; t (70) = 1.23, p = 0.22) . yalıtım düzeyi arttıkça dışkı kortikosteron düzeyi arttı. İzole atları (konut tasarımı 4) anlamlı derecede yüksek vardıer dışkı kortikosteron düzeyleri diğer konut tasarımları (p ≤0.02 Wilks Lambda = 0.58, F (3, 18) = 4.29, p = 0.01, çok değişkenli kısmi eta kare = 0.42) ile karşılaştırıldığında. diğer konut tedavilere kıyasla fekal kortikosteron düzeyi en izole konut sırasında her üç numune gün tüm atlar için yüksek oldu. Her bir gün için, her yuva tasarımı için ortalama dışkı kortikosteron konsantrasyonları, Tablo 1 'de sunulmaktadır.
Kadın ve Erkek Atlar için Kortikosteron ve kortizol Enzyme Linked-Immunoassay Şekil 1. Biyokimyasal Doğrulama (paralellik). Bu rakam üzerinde kortikosteron ve kortizol standart eğrisi artan konsantrasyonlarda karşı kadın ve erkek iç atı dışkı özler seri seyreltilmiş havuzların bağlayıcı yüzde detayları ÇED. Sonuçlar göstermektedirkortikosteron (A, erkek, B, bayan) ve kortizol ÇED (C, erkek; D, dişi). kortikosteron EIA standart eğri ile başarılı bir deplasman eğrisi paralel vermiştir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| HER KONUT TEDAVİSİNDE ORTALAMA (± SD) FEKAL kortikosteron (ng / g) | ||||
| KONUT TEDAVİSİ | 1.gün | 2. gün | gün 3 | GENEL |
| 1 | 31,73 ± 10.2 | 32,18 ± 8,0 | 29.22 ± 5.9 | 31.05 ± 7.8 |
| 2 | 32.75 ± 10.0 | 33.66 ± 12.9 | 34,67 ± 9,3 | 33,69 ± 10.3 |
| 3 | 35.06 ± 14.6 | 35.14 ± 15.9 | 33.13 ± 12.5 | 34.44 ± 13.6 |
| </ Td> | * | |||
| 4 | 38.16 ± 17.8 | 42.00 ± 16.7 | 41,52 ± 17.6 | 40,56 ± 16.5 |
Tablo 1. Ortalama her Konut Tedavisinde tüm Üç Gün Gün One, İki ve Üç ve Ortalama Fekal kortikosteron (ng / g) Her Konut Tedavisi (Genel). Bu tablo gösterileri için Fekal kortikosteron (ng / g) (± SD) dışkı kortikosteron (ng / g) için ortalama değerler günde bir, iki, üç boyunca muhafaza işlemin her biri için, standart sapma ±. Atlar konut girdikten sonra numuneler en az 20 saat toplanmıştır. Ayrıca, ortalama dışkı kortikosteron (ng / g) her bir muhafaza tedavisinde üç gün boyunca (genel) standart sapma ± gösterir. dışkı kortikosteron concentratiyon izole konut tasarımı sırasında (*) anlamlı olarak daha yüksekti. Tüm gün boyunca dışkı kortikosteron en düşük konsantrasyon grubu yerleştirilmiş tedavi (tedavi 1) tespit edildi. Yarnell ark uyarlanmıştır. (2015), Fizyoloji ve Davranış Journal izni ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dışkı kortikosteron analizi atlarda adrenal aktivitenin uzun süreli desen değerlendirmek için bir araç sağlar. Yöntemin non-invaziv doğa tükürük ve plazma analizi 9 olmak üzere adrenal aktivitesini değerlendirmek için kullanılan diğer örnekleme yöntemleri karıştırıcı etkilerini ortadan kaldırmaktadır. Buna ek olarak teknik ücretsiz değişen atları okuyan eğer net bir non-invaziv bir avantaja sahiptir.
Bu yöntemle ve uygun kullanımıyla ilgili görüşmek üzere çeşitli kilit nokta vardır. protokolde kritik bir adım soru ve uygun antikor seçiminde türler için tahlilin doğrulama olduğunu. Kullanılan antikor yapısal olarak benzer ancak işlevsel olarak farklı glukokortikoid metabolitleri ile çapraz reaksiyona Eğer bu sonuçlar 17 bulandırabilir olabilir. Bu nedenle, tahliller hormon metabolitleri dikkatli fizyolojik veya biyolojik doğrulama gerektiren ölçmek için, detayları literatürde 18,19 ve protokol descr içinde varIBED.
Dışkı örneğinin durumu hem hormonal metabolit düzeylerini 20 etkilediği gösterilmiştir numune ve çevresel maruziyet tazeliği de dahil olmak üzere dikkate alınması gerekmektedir. Aşırı yağmur veya güneş maruziyeti nedeniyle bakteriyel metabolleştirme 21 artışa neden olduğu bilinen ya da metabolit konsantrasyonları azalmaktadır. tazelik değişen derecelerde örnekleri toplamak isteyen araştırmacılar çevresel etkisine ek olarak numune bütünlüğü zamanın etkilerini araştırmak gerekir. Bu iklimsel değişkenlere tazelik ve maruz kalma değişen derecelerde ile küçük bir deney kurma ve periyodik olarak erkek ve kadın bireylerin dışkı örnekleme yoluyla önce çalışmaya yapılabilir.
Çoğu araştırma senaryolarda, bilinen kişilerden örnekler yararlı ya da 10 gerekli olacaktır. yerli atlar bu id yutulur gıda işaretlerini defekasyon için bir grup izleme veya kullanılarak elde edilebilirDaha büyük gruplar 12 bireylerden dışkı entify. ücretsiz değişen türlerde bu bireysel izleme gerekecektir olarak zaman alıcı ispat edebilir.
glukokortikoid analizi yöntemi seçerken dışkı kortikosteron testinin sonuçları oldukça zaman ölçü bir noktaya daha zamanla bir havuza örnek temsil o kabul edilmelidir; Bu nedenle, verilerin daha az bir dalgalanma olacaktır. Araştırmacı bir durumun uzun vadeli etkileri ile ilgilenen varsa, hayvancılık tekniği veya yönetim uygulaması daha sonra dışkı analizi uygun bir teknik sunmaktadır. Hormon konsantrasyon kısa vadeli desen değerlendirilmesi gerekiyorsa o zaman plazma veya tükürük analizi tercih edilen yöntem olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules - pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules - pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules - pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette - 1,000 µl | VWR | ||
| Pipette - 200 µl | VWR | ||
| Pipette - 20 µl | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals? Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T.
- Nelson, R. J. An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , Sinaur associates Inc. Ohio, USA. 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H.
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
