Summary
أنشأنا تقنية لعزل وتوصيف المظهري والتحليل الوظيفي للخلايا المناعية من اللثة الفئران.
Introduction
أنسجة اللثة المحيطة البشرية والأسنان الفئران ويتعرضون باستمرار لبيوفيلم معقد من الأسنان 1. شبكة الخلايا المناعية الشرطة على حاجز اللثة أمر حيوي للحفاظ على سلامة الأنسجة، وضمان التوازن مع الميكروبات المتعايشة المحلية و، في نفس الوقت، وتوفير حصانة فعالة ضد التحدي الإمراض 2. لتحقيق التوازن، تم تصميم جهاز المناعة بعناية للبيئة اللثة خلق درجة عالية من التخصص، شبكة الخلايا المناعية، ولكن كما هو معروف التفاصيل الصغيرة من السكان الخلايا المناعية اللثة ودورها في الحفاظ على مناعة الأنسجة 2.
عندما تتعطل توازن المناعة في اللثة، إما من خلال زيادة قابلية المضيف و / أو وجود المجتمعات الميكروبية dysbiotic، وهو حالة التهابية، اللثة تنشأ 3 4. التهاب اللثة هو مرض التهابي المشترك، مما يؤدي إلى فقدان الأسنان الصورةهياكل upporting. وينظر في أشكاله الشديدة في ما يقرب من 10٪ من عموم السكان 5. وقد ثبت تشريح العوامل الرئيسية المشاركة في حساسية اللثة والتقدم الصعب 6. ومع ذلك، فإن نماذج حيوانية مفيدة للغاية في فهم آليات بدء اللثة وتقدم 7. نماذج يمكن استخدامها لتحديد السكان الخلية الرئيسيين والوسطاء الجزيئية التي تعد حيوية للحفاظ على توازن المناعة وتطوير محرك اللثة. وهذه فكرة تحويل فهمنا لضبط اللثة محددة من توازن المناعة وتزيد من فهمنا الحالي للإمراض المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وجاءت جميع الإجراءات التجريبية المبينة في هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية اللازمة وتمت الموافقة من قبل رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام، NIDCR / المعاهد الوطنية للصحة.
1. إعداد مقدما
- إعداد وسائل الاعلام كاملة: RPMI تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، و 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين و 10٪ FBS.
- إعداد وسائل الاعلام الدناز: 50 مل من وسائل الاعلام RPMI تستكمل مع 7.5 ميكروغرام الدناز (جعل الطازجة، والحفاظ على الجليد في جميع الأوقات).
- إعداد وسائل الاعلام كولاجيناز الدناز: 5 مل من وسائل الاعلام الدناز بالإضافة إلى 3.2 ملغ / مل من كولاجيناز النوع الرابع (جعل الطازجة، والحفاظ على الجليد في جميع الأوقات).
- FACS العازلة قبل بارد: 0.5٪ FBS مخففة في برنامج تلفزيوني.
- الطرد المركزي قبل بارد إلى 4 درجات مئوية.
- الدافئة شاكر حاضنة إلى 37 درجة مئوية.
2. عزل، تشريح، وعزل الخلايا من اللثة كتل
- الموت ببطء الفئران عن طريق تعريضها إلى CO 2 في غرفة المناسبة، وفقا للمبادئ التوجيهية أراك. <لى> فتح التجويف الصدري والبطن لفضح القلب والدورة الدموية. ليروي، إجراء شق في الوريد الأجوف السفلي ويروي 3 مل من برنامج تلفزيوني عبر البطين الأيسر باستخدام حقنة 3 مل مع إبرة 27 G.
- لشل حركة الجسم والرأس من الماوس على وسادة مع المعدة مواجهة.
- قطع كل صوار الشفة نحو الرقبة مع مقص، وفصل الجلد الذي يغطي الفك والعنق المنطقة، وفضح الأنسجة والعضلات الأساسية. تشريح الشفة السفلى للكشف عن الفك السفلي.
- قطع ما بين القواطع السفلية لفصل جانبي الفك السفلي وشل كل جانب للوصول إلى تجويف الفم.
- تصور وتشريح الحنك بعيدا عن تجويف الأنف.
- تشريح المناطق باستخدام شفرة 10 وتشمل المناطق الرحى العلوية والسفلية مع توضيح اللثة (الشكل 1). جعل شقوق عمودية فقط الأمامي إلى الضرس الأول والخلفي للالضرس الثالث وشق أفقي فيحدود اللثة (ذوي الياقات البيضاء الأسنان الأنسجة المحيطة).
- وضع الفك العلوي والفك السفلي كتل في 50 مل أنبوب مخروطي مع 5 مل كولاجيناز / الدناز (الحفاظ على الجليد).
- احتضان في حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وخلال 5 دقائق الأخير من الحضانة إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M EDTA.
- إضافة 5 مل من وسائل الاعلام الدناز البارد إلى أنبوب 50 مل مع الأنسجة ودوامة بلطف لمزج.
- نقل 4 كتل من الأنسجة في طبق بتري، وتغطي مع 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام الدناز. إزالة اللثة من كل كتلة من الأنسجة، وذلك باستخدام شفرة مشرط ولافتا نصل إلى المناطق اللثة وبين الأسنان.
- نقل الأنسجة وسائل الإعلام من طبق بتري وكذلك وسائل الإعلام الدناز السابقة التي استخدمت خلال تشريح، إلى أنبوب 50 مل جديد من خلال مصفاة الخلية (70 ميكرومتر حجم). يغسل مع وسائل الإعلام الدناز (3-5 مل) كل من الأدوات المستخدمة والتصفية.
- باستخدام المكبس من العقيمة حقنة 3 مل، هرس الأنسجة ضد مصفاة،تصفية مع وسائل الإعلام الدناز الباردة (30-35 مل).
- غسل مصفاة الخلية مع وسائل الإعلام الدناز البارد.
- أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 6 دقائق.
- تجاهل طاف، وإعادة تعليق في 1 مل من وسائل الإعلام كاملة.
- عدد الخلايا (المبلغ المتوقع أن يتراوح بين 8 × 10 5-1،2 × 10 6 خلايا مع بقاء> 80٪) باستخدام عداد الخلية الآلي.
3. تحفيز وFACS تلون خلايا اللثة
- تحفيز تعليق خلية واحدة مع سلطة النقد الفلسطينية (50 نانوغرام / مل)، وIonomycin (2.5 ميكروغرام / مل) في وجود 1 ميكرولتر / مل من Brefeldin أ.
- احتضان لمدة 3.5 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- تدور باستمرار وتغسل مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية. 314 x ج لمدة 6 دقائق.
- وصمة عار على الخلايا باستخدام وصمة عار الجدوى باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- وصمة عار للعلامات خارج الخلية (CD45، TCRγδ، TCRβ، CD4، CD8، TCRγδ أو نملةibodies الاختيار) باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- غسل الخلايا مع العازلة FACS الباردة وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 5 دقائق.
- دوامة بلطف لعرقلة بيليه الخلية.
- إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 2٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا مع العازلة FACS الباردة، الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 5 دقائق وصمة عار لالسيتوكينات داخل الخلايا.
- ملء أنابيب FACS بمحلول بارد 0.5٪ سابونين المخفف في المخزن FACS وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 5 دقائق.
- إضافة 300 ميكرولتر من 0.5٪ محلول سابونين للأنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية، واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في 4 درجة مئوية ثم الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 5 دقائق.
- وصمة عار على الخلايا لعلامات داخل الخلايا (IL-17A وIFNγ أو السيتوكينات من خيار) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. غسل الخلايا مع 0.5٪ محلول سابونين وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 5 دقائق.
- يغسل مرة أخرى مع نظام مراقبة الأصول الميدانيةالعازلة وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 314 x ج لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من FACS العازلة.
- تحليل النتائج على الكريات التدفق.
4. تحليل التدفق الخلوي
- تصور الخلايا لتحليلها في الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SCC) وبوابة لاستبعاد الحطام.
- حدد الخلايا واحدة مع منطقة مبعثر إلى الأمام (FSC-A) مقابل المعلمات (FSC-H) الارتفاع.
- خلايا البوابة التي يعيش (كما يتضح من تلطيخ الجدوى) وايجابية علامة CD45 + المكونة للدم لمزيد من التحليل (الشكل 2A و 2C).
- مواصلة تحليل علامات محددة كما هو مبين في الشكل (2) والشكل (3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتوضيح تطبيق البروتوكول، وتبين لنا نتائج ممثل فحص شبكة الخلايا المناعية في اللثة من الفئران مع وبدون اللثة (WT مقابل LFA - / -، الشكل 2A - C). FACS تمثيلية المؤامرات تظهر CD45 + لدم الخلايا الحية في اللثة (الشكل 2A، 2C). عزل ومعالجة الخلايا المناعية مع هذا البروتوكول ينتج خلايا كافية لتنفيذ المجراة سابقا التحفيز وتوصيف أنماط خلوى إفراز. هنا نعرض IL-17 و IFN-γ تلطيخ في إجمالي CD45 + الخلايا في حالة مستقرة (WT) وفي الفئران واظهار اللثة (بسبب نقص LFA) (الشكل 2B - D). وتكشف هذه البيانات إمكانيات هذه التقنية على التقاط ملامح خلوى خلال الأنسجة حالة مستقرة (WT) وفي سياق اللثة المحلية (LFA - / -). في هيئة التصنيع العسكريالبريد عرضة لالتهاب اللثة وتتميز نحن كذلك اللثة تكوين الخلايا المناعية وخاصة من الخلايا التائية والخلايا الفطرية اللمفاوية (ILC) المقصورات (الشكل 3A - B). كنا قادرين على تحديد إنتاج IL-17 و IFN-γ داخل الخلية TCRβ + CD4 + T، TCRβ + CD8 + الخلايا التائية، TCRγδ + الخلايا التائية، NK ومقصورات لجنة القانون الدولي (الشكل 3C).
الشكل 1: عزل اللثة الفئران التوضيح مما يدل على الحدود من تشريح في الفك العلوي والجزء اللثة معزولة لاستخدامها في تشريح الأنسجة اللثوية. (ب) الجزء من الفك العلوي الفئران (منطقة المولي) مع الخطوط العريضة لتشريح كتلة وكتلة معزولة. الهيماتوكسيلين وصمة عار يوزين (H & E) من شريحة المولي الفك العلوي مع اللثة الأنسجة ل المبين هو مبين في منخفض (C) وأعلى التكبير في (D). تكبير الأصلية المشار إليها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: FACS ممثل البيانات لإنتاج السيتوكينات من خلايا اللثة. (A - C) FACS مؤامرة تظهر بوابة لحية CD45 + الخلايا في خلية الاستعدادات الماوس اللثة التالية فيفو السابقين إعادة التحفيز مع سلطة النقد الفلسطينية وionomycin في WT وLFA - / -. (B - D) المؤامرات FACS الممثل تظهر IFN-γ و IL-17 تلطيخ في مجموع الماوس CD45 + الخلايا من اللثة من الفئران مع / بدون اللثة (بسبب LFA-نقص).ديزيل / ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): إنتاج السيتوكينات من قبل السكان المناعة في اللثة الملتهبة (A) الممثل FACS مؤامرة تظهر تلطيخ لTCRβ مقابل TCRγδ بوابات على خلايا CD45 +. تبوب على خلايا TCRβ +، تظهر المؤامرة المتوسطة CD4 مقابل TCRβ تلطيخ (يسمح لتحليل الخلايا TCRβ + CD4 + T، خلايا TCRβ + CD8 + T والخلايا TCRγδ + T). تبوب على TCRβ - TCRγδ - الخلايا، تظهر المؤامرة الصحيحة CD45 مقابل NK1.1 تلطيخ (يسمح لتحليل الخلايا القاتلة الطبيعية). (ب) الممثل FACS مؤامرة تبين تلطيخ لCD90.2 بوابات على CD45 + نسب الخلايا السلبية (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c و- CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ -) الذي يحدد الخلايا اللمفاوية الفطرية. (C) المؤامرات FACS الممثل تظهر IFN-γ و IL-17 في تلطيخ السكان الخلية التي تم تحديدها. الاستعدادات اللثة هي من LFA 20 اسبوع - / - الفئران التي تنمي اللثة. البيانات هي ممثل لثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه التقنية الحالية غلة بنجاح عددا كبيرا من الخلايا المناعية (من ماوس واحدة) مناسبة، ليس فقط لتوصيف المظهري، ولكن أيضا للدراسات وظيفية خارج الحي. ان مجموعة اخرى تنطبق على بروتوكول لعزل وتوصيف الخلايا المناعية اللثة الفئران وعرض قيمة استخدام متعدد الألوان التدفق الخلوي في دراسة اللثة في النماذج الحيوانية 9. وبعد استكشاف الأخطاء وإصلاحها كبيرا في تعديل رئيسي في هذا البروتوكول كان لتشمل تشريح كتل كاملة من الأنسجة لتشمل كل من المناطق طوق اللثة واللثة بين الأسنان (الشكل 1). مع تشريح اللثة وحدها، وغالبا ما لا يتحقق اللوحات سمك كامل وغاب عن جزء من اللثة لا سيما في المناطق بين الأسنان. باستخدام هذا النهج، وزيادة كبيرة في أعداد الخلايا المناعية المقطوع. هذا الأسلوب يسمح أيضا لعزل المثلى من أنسجة اللثة كلا من الفك العلويالفك السفلي د.
وتشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول تشريح المحافظ من المناطق اللثة ومعدل كفاءة تشريح. على وجه التحديد، ينبغي أن تشريح كتل من الأنسجة لتشمل الأنسجة الحد الأدنى فقط حول الأسنان (اللثة) والأنسجة لا الشدق. يجب أن تشريح كتل بسرعة ويجب أن تبقى الأنسجة والخلايا على الجليد لضمان بقاء الخلية المثلى.
لأغراض استكشاف الأخطاء وإصلاحها من المهم أن نلاحظ أن العائد المنخفض من الخلايا يمكن أن تكون ذات صلة وقت كاف من الحضانة مع كولاجيناز، تركيزات غير لائقة من كولاجيناز و / أو عدم كفاية تشريح اللثة من كتل الأنسجة. في تلك المذكرة، تشريح اللثة التي تستخدم loupes المكبرة (2X-6X) يمكن أن تكون مفيدة. قابلية منخفضة من الخلايا يمكن أن تكون ذات صلة التأخر في إجراء وسائل الإعلام، ومخازن والخلايا لا تبقى باستمرار على الجليد.
قيود من هذا البروتوكول، الملازمة لنوع من الأنسجة ديسsected هو حجم أنسجة اللثة، مقارنة بالمواقع حاجز تشريحي أخرى درس (مثلا الجلد أو الجهاز الهضمي) التي هي الأنسجة أكبر المتاحة.
ومع ذلك، فقد سمح للتقنية المعروضة هنا لنا لتوصيف السكان الخلية المهيمن في LFA - / - نموذج التي وضعت بشكل عفوي اللثة. في LFA - / - الفئران حددنا المهيمنة IL-17 توقيع خلوى خلال تطوير اللثة 10. استخدام متعدد الألوان تحليل تدفق cytometric كنا قادرين على تحديد مصادر الخلوية من IL-17 11. في هذا المرض وضع IL-17 والتي تنتجها الخلايا TCRγδ T، خلايا CD4 + T والخلايا اللمفاوية الفطرية (ILC) محليا داخل اللثة 10.
مع عدد كبير من خلايا معزولة مع هذه المنهجية والقدرة على تحديد حتى القطعان الصغيرة، سيكون من الممكن الآن لتطوير فهم شاملجي شبكة الخلايا المناعية المتخصصة الحفاظ على سلامة حاجز اللثة. وهذه الرؤية حاسمة تسمح لنا لتقييم الاستجابات المناعية في بيئة اللثة. من خلال استخدام هذه التقنية يمكننا الآن المضي قدما لعزل مكونات محددة من شبكة الخلايا المناعية اللثة عن طريق تدفق cytometric خلية الفرز، مما يسمح للتحليلات والأوصاف الإضافية التي يتعين الاضطلاع بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
