Summary
Hemos establecido una técnica para el aislamiento, la caracterización fenotípica y análisis funcional de células inmunes de encía murino.
Introduction
Tejidos gingivales rodean la dentición humana y murina y están constantemente expuestos al complejo biofilm del diente 1. La red de células inmunes la vigilancia de la barrera gingival es vital para mantener la integridad del tejido, asegurando homeostasis con los microbios comensales locales y, al mismo tiempo, proporcionando una inmunidad eficaz contra el desafío patogénico 2. Para lograr la homeostasis, el sistema inmunológico está cuidadosamente adaptada al entorno gingival creación de una red de células inmunes altamente especializado, sin embargo, poco se conoce el detalle de las poblaciones de células inmunes gingivales y su papel en el mantenimiento de la inmunidad tisular 2.
Cuando se interrumpe la homeostasis inmune en la encía, ya sea mediante el aumento de la susceptibilidad y / o presencia de comunidades microbianas dysbiotic, una condición inflamatoria del huésped, surge la periodontitis 3 4. La periodontitis es una enfermedad inflamatoria común, lo que lleva a la pérdida del diente sPOYO estructuras. En sus formas severas se observa en aproximadamente el 10% de la población general 5. La disección de los factores clave implicados en la susceptibilidad periodontitis y la progresión ha sido difícil 6. Sin embargo, los modelos animales han sido extremadamente útiles en la comprensión de los mecanismos de iniciación y progresión periodontitis 7. Los modelos pueden ser empleados para definir las poblaciones de células y mediadores moleculares clave que son vitales para el mantenimiento de la homeostasis inmune y el desarrollo de la unidad de la periodontitis. Tal visión va a transformar nuestra comprensión del control-encía específica de la homeostasis inmune y mejorar nuestra comprensión actual de la patogénesis de la enfermedad.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales descritos en este protocolo siguen las pautas requeridas y fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo, NIDCR / NIH.
1. Prepárese por adelantado
- Preparar medio completo: RPMI suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina y 10% de FBS.
- Preparar medios DNasa: 50 ml de medio RPMI suplementado con 7,5 mg de DNasa (Haga fresco, mantener en hielo en todo momento).
- Preparar los medios de colagenasa-DNasa: 5 ml de medio DNasa más 3,2 mg / ml de colagenasa tipo IV (Haga fresco, mantener en hielo en todo momento).
- Pre-cool tampón FACS: 0,5% de SFB diluido en PBS.
- centrifugadora pre-enfriamiento a 4 ° C.
- agitador incubadora caliente a 37 ° C.
2. El aislamiento, la disección y aislamiento de células gingivales de los bloques
- La eutanasia a los ratones mediante la exposición a CO 2 en una cámara apropiada, según las directrices de ARAC. <li> Abra la cavidad torácica y abdominal para exponer el corazón y los órganos internos. Para perfundir, hacer una incisión en la vena cava inferior y perfundir 3 ml de PBS a través del ventrículo izquierdo con una jeringa de 3 ml con una aguja de 27 G.
- Inmovilizar el cuerpo y la cabeza del ratón sobre un cojín con el estómago hacia arriba.
- Cortar cada comisura del labio hacia el cuello con unas tijeras, separando la piel que cubre la región de la mandíbula y el cuello, la exposición de los tejidos y los músculos subyacentes. Diseccionar el labio inferior para descubrir la mandíbula.
- Corte entre los incisivos inferiores para separar ambos lados de la mandíbula e inmovilizar cada lado para acceder a la cavidad oral.
- Visualizar y analizar el paladar lejos de la cavidad nasal.
- Diseccionar áreas utilizando una cuchilla 10 e incluyen áreas molares maxilares y mandibulares y la zona gingival (Figura 1). Hacen incisiones verticales, justo por delante del primer molar y posterior al tercer molar y una incisión horizontal enel borde de la encía (blanco cuello de los dientes adyacentes de tejido).
- Coloque el maxilar y mandibular bloques en un tubo cónico de 50 ml con 5 ml de colagenasa / DNasa (mantener en hielo).
- Incubar en un incubador agitador a 37 ° C durante 1 hora y durante el último 5 min de incubación se añaden 50 l de 0,5 M EDTA.
- Añadir 5 ml de medio de DNasa frío al tubo de 50 ml con los tejidos y agitar suavemente para mezclar.
- La transferencia de los 4 bloques de tejido en una placa de Petri y cubrir con 500 l de DNasa medios. Eliminar encía de cada bloque de tejido, utilizando una hoja de bisturí y apuntando la hoja en las áreas gingivales y interdentales.
- La transferencia de los tejidos y los medios de comunicación de la placa de Petri, así como los medios de comunicación de DNasa anteriores utilizados durante la disección, a un nuevo tubo de 50 ml a través del filtro de células (70 micras de tamaño). Lavar con medios DNasa (3-5 ml) todos los instrumentos utilizados y filtro.
- Usando el émbolo de una jeringa estéril de 3 ml, triturar el tejido contra el colador,filtración con medios DNasa frío (30 a 35 ml).
- Lavar el filtro de células con DNasa medios frío.
- Centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 6 min.
- Descartar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de medio completo.
- Recuento de células (la cantidad esperada debe oscilar entre 8 x 10 5 a 1,2 x 10 6 células con una viabilidad de> 80%) usando un contador de células automatizado.
3. Estimulación y FACS La tinción de las células de la encía
- Estimular la suspensión de células individuales con PMA (50 ng / ml) e ionomicina (2,5 g / ml) en presencia de 1 l / ml de Brefeldina A.
- Incubar durante 3,5 horas a 37 ° C y 5% de CO2.
- Centrifugar y lavar con PBS y centrifugar a 4 ° C; 314 xg durante 6 minutos.
- Tinción de las células utilizando una mancha viabilidad siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Mancha de marcadores extracelulares (CD45, TCRγδ, TCR, CD4, CD8, TCRγδ o de hormigasibodies de elección) siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Se lavan las células con tampón frío FACS y centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
- vórtice suavemente para perturbar el sedimento celular.
- Fijar las células con 2% de paraformaldehído durante 20 min a temperatura ambiente.
- Se lavan las células con tampón frío FACS, se centrifuga a 4 ° C, 314 xg durante 5 min y las manchas para citoquinas intracelulares.
- Llenar los tubos FACS con una solución de frío saponina 0,5% diluido en tampón de FACS y se centrifuga a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
- Añadir 300 l de solución de saponina 0,5% a los tubos de FACS, se incuba durante 15 min en la oscuridad a 4 ° C y centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
- Teñir las células para marcadores intracelulares (IL-17A y IFN o citocinas de elección) siguiendo las instrucciones del fabricante. Lavar las células con solución de saponina 0,5% y centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
- Lavar a continuación con FACStampón y se centrifuga a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
- Volver a suspender las células en 300 l de tampón FACS.
- Analizar los resultados en un citómetro de flujo.
4. Análisis de Citometría de Flujo
- visualizar las células a analizar en adelante (FSC) y dispersión lateral (SCC) y la puerta para excluir los desechos.
- Seleccionar celdas individuales con área de dispersión frontal (FSC-A) vs. parámetros de altura (FSC-H).
- Células de puertas que son en vivo (como se indica por la tinción de viabilidad) y positivos para el marcador hematopoyéticas CD45 + para el análisis adicional (Figura 2A y 2C).
- Continuar el análisis de marcadores específicos como se muestra en la Figura 2 y la Figura 3.
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Representative Results
Para ilustrar la aplicación del protocolo, mostramos los resultados representativos que examinan la red de células inmunes en la encía de los ratones con y sin periodontitis (WT vs. LFA - / -, Figura 2A - C). FACS representativos gráficos muestran células CD45 + hematopoyéticos vivos en la encía (Figura 2A, 2C). El aislamiento y la transformación de las células inmunes con este protocolo da suficientes células para realizar la estimulación ex vivo y caracterización de los patrones de secreción de citoquinas. Aquí mostramos IL-17 e IFN-γ tinción total de células CD45 + en el estado estacionario (WT) y en ratones que presentan periodontitis (debido a la deficiencia de LFA) (Figura 2B - D). Estos datos revelan el potencial de esta técnica para capturar los perfiles de citoquinas durante el tejido en estado estacionario (WT) y en el contexto de la periodontitis local (LFA - / -). en micrófonoe susceptibles a la periodontitis que caracteriza, además, la composición de células inmunes gingival en particular de la célula T y los compartimentos de células innata linfoide (ILC) (Figura 3A - B). Hemos sido capaces de definir la producción de IL-17 e IFN-γ dentro de la célula T TCR + CD4 +, células T TCR + CD8 +, + T cell TCRγδ, NK y los compartimentos de la CDI (Figura 3C).
Figura 1:. Aislamiento de encía murino Dibujo que demuestra las fronteras de la disección en el maxilar superior y el segmento aislado gingival que debe utilizarse para la disección del tejido gingival. (B) Segmento del maxilar murino (zona molar) con el esquema de bloques para la disección y el bloque aislado. Hematoxilina y eosina (H & E) de un segmento molar superior con la encía l tejidos descritos se muestra en baja (C) y un aumento mayor en (D). Magnificaciones originales indicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los datos de FACS representativos para la producción de citoquinas de células de la encía. (A - C) FACS gráfico que muestra la puerta para Live + células CD45 en preparaciones de células de ratón gingivales siguientes ex vivo re-estimulación con PMA e ionomicina en el documento WT y LFA - / -. (B - D) parcelas FACS representativos que muestran IFN-γ e IL-17 tinción en total ratón células CD45 + de la encía de los ratones con / sin periodontitis (debido a la LFA-deficiencia).iles / ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. La producción de citocinas por las poblaciones inmunes en encía inflamada (A) gráfico representativo que muestra la tinción de FACS TCR frente TCRγδ cerrada en células CD45 +. Active en las células TCR +, la trama central muestra CD4 frente a la tinción TCR (permite el análisis de las células T TCR + CD4 +, células T CD8 + TCR + T y células TCRγδ). Gating en TCR - TCRγδ - células, parcela derecha muestra CD45 frente a la tinción NK1.1 (permite el análisis de las células NK). (B) gráfico representativo que muestra la tinción de FACS CD90.2 cerrada en las células CD45 + negativas de linaje (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCR -) que identifica las células linfoides innatas. (C) parcelas FACS representativo que muestra IFN-γ e IL-17 en la tinción de poblaciones de células identificados. Preparaciones Gingiva son de 20 semanas de edad LFA - / - ratones que desarrollan periodontitis; los datos son representativos de tres experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La técnica actual produce con éxito un gran número de células inmunes (de un solo ratón) adecuado, no sólo para la caracterización fenotípica, sino también para estudios funcionales ex vivo. Otro grupo había publicado previamente un protocolo para aislar y caracterizar células inmunes gingivales murino y se introduce el valor de la utilización de la citometría de flujo multicolor en el estudio de la periodontitis en modelos animales 9. Tras la resolución de problemas considerables la modificación clave en este protocolo fue incluir la disección de bloques enteros de tejido con el fin de incluir las dos áreas de cuello gingivales y encía interdental (Figura 1). Con la disección gingival solo, a menudo no se logran los colgajos de espesor completo y parte de la encía se pierde en particular en las zonas interdentales. Utilizando este enfoque, el número de células inmunes cosechadas se incrementan significativamente. Esta técnica también permite el aislamiento óptimo de los tejidos gingivales, tanto de un maxilard mandíbula.
Los pasos críticos de este protocolo incluyen una disección conservadora de áreas gingivales y una tasa de eficiencia de la disección. En concreto, bloques de tejido deben ser diseccionados para incluir solamente mínima del tejido alrededor de los dientes (encía) y los tejidos bucales no. Los bloques deben ser disecadas de forma rápida y tejidos y células deben permanecer en el hielo para asegurar la viabilidad celular óptima.
Para los fines de la solución de problemas, es importante tener en cuenta que bajo rendimiento de las células puede estar relacionada con la falta de tiempo de incubación con colagenasa, las concentraciones inadecuadas de la colagenasa y / o disección inadecuada de la encía de los bloques de tejido. En ese sentido, la disección de la encía utilizando lupas de aumento (2X-6X) puede ser útil. Low viabilidad de las células se puede relacionar la lentitud en el procedimiento y a los medios de comunicación, tampones y las células no quedan continuamente en hielo.
Las limitaciones de este protocolo, inherentes al tipo de tejido disdiseccionados es el tamaño de los tejidos gingivales, en comparación con otros sitios de barrera anatómica estudiada (ex. Skin o en el tracto gastrointestinal) en el que los tejidos más grandes están disponibles.
No obstante, la técnica presentada aquí nos ha permitido caracterizar las poblaciones de células predominantes en el LFA - / - modelo que desarrolló espontáneamente periodontitis. En LFA - / - ratones que identifica un IL-17 de la firma citoquina dominante durante el desarrollo de la periodontitis 10. Utilizando el análisis de citometría de flujo multicolor hemos sido capaces de definir las fuentes celulares de IL-17 11. En esta configuración, la IL-17 fue la enfermedad producida por las células T, las células TCRγδ T CD4 + y células linfoides innatas (CIT) a nivel local dentro de la encía 10.
Con el número sustancial de células aisladas con esta metodología y la capacidad de identificar incluso las pequeñas subpoblaciones, ahora será posible desarrollar una amplia entiendención de la red de células inmunes especializadas salvaguardar la integridad de la barrera gingival. Esta visión crítica nos permitirá evaluar las respuestas inmunes en el entorno de la encía. Mediante el empleo de esta técnica podemos pasar ahora para aislar los componentes específicos de la red de células inmunes encía por la clasificación de células por citometría de flujo, lo que permite el análisis y caracterizaciones adicionales que deben realizarse.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
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