Summary
Nós estabelecemos uma técnica para o isolamento, caracterização fenotípica e análise funcional de células imunes de gengiva murino.
Introduction
Tecidos gengivais rodeiam a dentição humana e de murídeo e são constantemente expostos ao biofilme complexo do dente 1. A rede celular imune policiais a barreira gengival é vital para manter a integridade do tecido, garantindo a homeostase com os micróbios comensais locais e, ao mesmo tempo, proporcionando uma imunidade eficaz contra o desafio patogénico 2. Para alcançar a homeostase, o sistema imunológico é cuidadosamente adaptado ao ambiente gengival criação de uma rede de células imunes altamente especializados, mas poucos detalhes são conhecidos das populações de células imunes gengivais e seu papel na manutenção da imunidade tecido 2.
Quando a homeostase imune é interrompido na gengiva, quer através do aumento da susceptibilidade do hospedeiro e / ou presença de comunidades microbianas dysbiotic, uma condição inflamatória, periodontite surge 3 4. A periodontite é uma doença inflamatória comum, levando à perda do dente sestruturas upporting. Nas suas formas mais graves que é observada em cerca de 10% da população em geral 5. Dissecando os principais fatores envolvidos na susceptibilidade a periodontite e progressão tem sido difícil 6. No entanto, os modelos animais têm sido extremamente útil na compreensão dos mecanismos de iniciação e progressão da periodontite 7. Os modelos podem ser utilizados para definir as populações de células principais e mediadores moleculares que são vitais para a manutenção da homeostase imune e desenvolvimento unidade de periodontite. Essa visão vai transformar a nossa compreensão do controle específico da gengiva da homeostase imunológica e promover nossa compreensão atual da patogênese da doença.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos experimentais descritos neste protocolo seguido orientações necessários e foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use, NIDCR / NIH.
1. preparar com antecedência
- Prepare meio completo: RPMI suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 10% de FBS.
- Prepare a mídia de DNase: 50 ml de meio RPMI suplementado com 7,5 ug DNase (Faça fresco, manter em gelo em todos os momentos).
- Prepare meios colagenase-ADNase: 5 ml de meio de ADNase mais 3,2 mg / mL de colagenase tipo IV (Adicione fresca, manter em gelo em todos os momentos).
- tampão FACS pré-cool: 0,5% FBS diluído em PBS.
- Pré-cool centrífuga a 4 ° C.
- incubador agitador Aquece-se até 37 ° C.
2. Isolamento, Dissecção e isolamento de células a partir gengivais Blocks
- Eutanásia ratos por expondo-os a CO2 numa câmara apropriada, de acordo com orientações de AraC. <li> Abra a cavidade torácica e abdominal para expor o coração e os órgãos internos. Para perfundir, fazer uma incisão na veia cava inferior e perfundir 3 ml de PBS através do ventrículo esquerdo usando uma seringa de 3 ml com uma agulha G 27.
- Imobilizar o corpo ea cabeça do mouse sobre uma almofada com o estômago virado para cima.
- Corte cada comissura do lábio para o pescoço com uma tesoura, que separa a pele que cobre mandíbula e pescoço região, expondo os tecidos e músculos subjacentes. Dissecar o lábio inferior para descobrir a mandíbula.
- Corte entre os incisivos inferiores para separar ambos os lados da mandíbula e imobilizar cada lado para aceder à cavidade oral.
- Visualizar e dissecar o paladar de distância a partir da cavidade nasal.
- Dissecar áreas usando uma lâmina de 10 e incluem áreas molares superiores e inferiores com circundante gengiva (Figura 1). Fazer incisões verticais imediatamente anterior ao primeiro molar e posterior ao terceiro molar e uma incisão horizontal naa borda da gengiva (colarinho branco de tecido dentes adjacentes).
- Coloque o maxilar e mandibular blocos em um tubo de 50 ml com 5 ml de colagenase / DNase (manter em gelo).
- Incubar numa incubadora com agitação a 37 ° C durante 1 hora e durante os últimos 5 minutos de incubação adicionar 50 ul de EDTA 0,5 M.
- Adicionar 5 ml de meio de ADNase frio para o tubo de 50 ml com os tecidos e agitar suavemente para misturar.
- Transferir os 4 blocos de tecidos em uma caixa de Petri e cobrir com 500 ul de meios de DNase. Remover gengiva de cada bloco de tecido, utilizando uma lâmina de bisturi e apontando a lâmina para as áreas gengivais e interdentais.
- Transferir os tecidos e os meios de comunicação a partir do prato de petri, bem como os meios de comunicação de ADNase anteriores utilizados durante a dissecção, para um novo tubo de 50 ml através do filtro de células (70 um de tamanho). Lavar com media DNase (3-5 ml) todos os instrumentos utilizados e filtro.
- Usando o êmbolo estéril de uma seringa de 3 ml, triturar o tecido contra o filtro,filtragem com meios ADNase fria (30 a 35 ml).
- Lave o filtro de células com a mídia DNase frio.
- Centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 6 minutos.
- Descartar o sobrenadante, re-suspender em 1 mL de meio completo.
- Contagem de células (a quantidade esperada deve variar entre 8 x 10 5-1,2 x 10 6 células, com uma viabilidade> 80%), utilizando um contador de células automatizado.
3. Estímulo e FACS coloração de células gengivais
- Estimular a suspensão de célula única com PMA (50 ng / ml) e ionomicina (2,5 fig / ml) na presença de 1 ul / ml de brefeldina A.
- Incubar por 3,5 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Girar para baixo e lava-se com PBS e centrifugação a 4 ° C; 314 g durante 6 min.
- Corar as células utilizando uma mancha de viabilidade seguindo as instruções do fabricante.
- Stain para marcadores extracelulares (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ ou formigaibodies de escolha) seguindo as instruções do fabricante.
- Lavam-se as células com tampão FACS frio e centrifugação a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
- Suavemente vortex para perturbar o sedimento celular.
- Fixar as células com 2% de paraformaldeído durante 20 min à temperatura ambiente.
- Lavam-se as células com tampão FACS frio, centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min e mancha de citocinas intracelulares.
- Encher os tubos de FACS com uma solução fria de saponina a 0,5% diluído em tampão de SCAF e centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
- Adicionar 300 uL de solução de saponina a 0,5% para os tubos de FACS, incubar durante 15 minutos no escuro a 4 ° C e depois centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
- Corar as células de marcadores intracelulares (IL-17A e IFNy ou citocinas de escolha) seguindo as instruções do fabricante. Lavam-se as células com solução de saponina a 0,5% e centrifuga-se a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
- Lave novamente com FACSde tampão e centrifuga-se a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
- Re-suspender as células em 300 ul de tampão de FACS.
- Analisar os resultados em um citômetro de fluxo.
4. Análise por Citometria de Fluxo
- células visualizar a serem analisados na frente (FSC) e dispersão lateral (SCC) e portão para excluir detritos.
- Selecionar células individuais com área de dispersão para a frente (FSC-A) vs. altura parâmetros (FSC-H).
- Células portão que são vivo (como indicado através de coloração de viabilidade) e positiva para o marcador CD45 + hematopoiéticas para posterior análise (Figura 2A e 2C).
- Continue a análise de marcadores específicos, como mostrado na Figura 2 e na Figura 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para ilustrar a aplicação do protocolo, mostramos resultados representativos que examinam a rede de células imunes na gengiva de ratos com e sem periodontite (WT vs. LFA - / -, a Figura 2a - C). Representante FACS gráficos mostram células CD45 + hematopoiéticas ao vivo na gengiva (Figura 2A, 2C). Isolamento e tratamento de células do sistema imunológico com este protocolo produz células suficientes para realizar a estimulação ex vivo e caracterização de padrões de secreção de citocinas. Aqui mostramos IL-17 e IFN-γ coloração no total de células CD45 + no estado estacionário (WT) e em ratinhos exibindo periodontite (devido à deficiência de LFA) (Figura 2B - D). Estes dados revelam o potencial desta técnica para capturar perfis de citoquinas, durante o estado estacionário de tecido (WT) e no contexto da periodontite local (LFA - / -). em mice susceptíveis a periodontite que caracterizado pelo facto adicional da composição de células imunes em particular gengival da célula T e os compartimentos da célula linfóide Inata (CIT) (Figura 3A - B). Fomos capazes de definir a produção de IL-17 e IFN-γ dentro da célula TCRβ + T CD4 +, células TCRβ + T CD8 +, células TCRγδ + T, NK e compartimentos ILC (Figura 3C).
Figura 1:. Isolamento de gengiva murino Ilustração demonstrando as fronteiras de dissecção na maxila e o segmento gengival isolado para ser usado para dissecção do tecido gengival. (B) Segmento da maxila murino (área molar) com esboço para dissecção bloco e bloco isolado. Hematoxilina e eosina (H & E) de um segmento molar superior com gengiva l tecidos descritas é mostrada em baixo (C) e na maior ampliação (D). Ampliações originais indicados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os dados de FACS representativos para a produção de citocinas a partir de células gengivais. (A - C) FACS gráfico que mostra portão de células vivas CD45 + em preparações de células de rato gengivais seguintes ex vivo re-estimulação com PMA e ionomicina no WT e LFA - / -. (B - D) parcelas de FACS representativa mostrando o IFN-γ e IL-17 no total coloração rato células CD45 + a partir de gengiva de ratos com / sem periodontite (devido a deficiência em LFA-).iles / ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. A produção de citocinas pelas populações imunes em gengiva inflamada (A) Representante FACS gráfico que mostra coloração para TCRβ contra TCRγδ fechado em células CD45 +. Gating em células TCRβ +, lote do meio mostra a coloração de células CD4 contra TCRβ (permite a análise de células TCRβ + T CD4 +, células TCRβ + T CD8 + e células TCRγδ + T). Gating em TCRβ - TCRγδ - células, gráfico da direita mostra CD45 contra coloração NK1.1 (permite a análise das células NK). (B) enredo Representante FACS mostrando coloração para CD90.2 fechado em células negativas CD45 + de linhagem (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ -), que identifica células linfóides inatas. (C) parcelas de FACS representativa mostrando o IFN-γ e IL-17 de coloração em populações de células identificadas. Preparações gengiva são de 20 semanas de idade LFA - / - ratos que desenvolvem periodontite; dados são representativos de três experiências independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A técnica actual produz com sucesso um grande número de células do sistema imunológico (a partir de um único rato) apropriado, não só para a caracterização fenotípica, mas também para estudos funcionais ex vivo. Outro grupo havia publicado anteriormente um protocolo para isolar e caracterizar células imunes gengivais murino e introduziu o valor do uso de multicolor citometria de fluxo no estudo da periodontite em modelos animais 9. Na sequência de resolução de problemas consideráveis a modificação fundamental neste protocolo foi incluir dissecação de blocos inteiros de tecido, a fim de incluir ambas as áreas colarinho gengivais e gengiva interdental (Figura 1). Com dissecção gengival sozinho, muitas vezes retalhos de espessura total não são alcançados e parte da gengiva é perdido em particular nas áreas interdentais. Utilizando esta abordagem, os números de células imunitárias colhidas são significativamente aumentadas. Esta técnica também permite o isolamento óptimo dos tecidos gengivais quer a partir de uma maxilad mandíbula.
passos críticos para este protocolo incluem uma dissecção conservadora de áreas gengivais e uma taxa de eficiência de dissecção. Especificamente, os blocos de tecido deve ser dissecado para incluir apenas mínima do tecido ao redor dos dentes (gengiva) e tecidos não bucais. Blocos devem ser dissecados de forma rápida e tecidos e células devem permanecer no gelo para garantir a viabilidade celular ideal.
Para fins de resolução de problemas, é importante notar que o baixo rendimento de células pode ser relacionado com o tempo de incubação inadequada com colagenase, as concentrações inapropriadas de colagenase e / ou dissecção inadequada da gengiva dos blocos de tecido. Na mesma nota, a dissecção da gengiva usando lupas de aumento (2X-6X) pode ser útil. Baixa viabilidade das células pode ser relacionado com atraso no processo e aos meios de comunicação, buffers e células não restantes continuamente no gelo.
As limitações deste protocolo, inerentes ao tipo de dis tecidossected é o tamanho dos tecidos gengivais, em comparação com outros locais de barreira anatómica estudados (ex. pele ou do tracto gastrointestinal) em que os tecidos são maiores disponíveis.
No entanto, a técnica apresentada aqui nos permitiu caracterizar as populações de células dominantes na LFA - / - modelo que desenvolveu espontaneamente periodontite. Em LFA - / - ratos identificamos uma assinatura citocina IL-17 dominante durante o desenvolvimento de periodontite 10. Usando a análise de citometria de fluxo multicolor, fomos capazes de definir as fontes celulares de IL-17 11. Nesta configuração, a IL-17 foi produzido por doença TCRγδ células T, células T CD4 + e células linfóides inatas (ILC) localmente dentro da gengiva 10.
Com o número substancial de células isoladas com esta metodologia e a capacidade de identificar até mesmo pequenas subpopulações, agora será possível desenvolver uma abrangente entendering da rede de células imunitárias especializadas salvaguardar a integridade da barreira gengival. Esta visão crítica nos permitirá avaliar as respostas imunes no ambiente gengival. Empregando esta técnica, podemos agora avançar para isolar componentes específicos da rede de células imunes gengiva por separação de células por citometria de fluxo, permitindo análises e caracterizações adicionais a serem realizadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
