Summary
Vi har etablerat en teknik för isolering, fenotypiska karaktärisering och funktionell analys av immunceller från mus tandkött.
Introduction
Tandköttsvävnader omger humana och murina tänder och utsätts ständigt för komplexa biofilm av tanden 1. Immuncellnätverket polistandkötts barriären är viktigt att upprätthålla vävnadsintegritet, se homeostas med den lokala kommen mikrober och samtidigt ger effektiv immunitet mot patogena utmaning 2. För att uppnå homeostas, är immunsystemet noggrant anpassade till tandkötts miljön skapar en högt specialiserad immunceller nätverk, men ändå liten detalj är känd av tandköttsimmuncellpopulationer och deras roll för att upprätthålla vävnads immunitet 2.
När immun homeostas störs på tandköttet, antingen genom ökad värd känslighet och / eller närvaro av dysbiotic mikrobiella samhällen, ett inflammatoriskt tillstånd, uppstår parodontit 3 4. Parodontit är en vanlig inflammatorisk sjukdom, vilket leder till förlust av tand supporting strukturer. I sina allvarliga former det ses hos cirka 10% av befolkningen 5. Dissekera nyckelfaktorer som är involverade i parodontit känslighet och progression har visat sig svårt sex. Däremot har djurmodeller varit extremt användbar för att förstå mekanismerna bakom parodontit initiering och progression 7. Modeller kan användas för att definiera de viktigaste cellpopulationer och molekylära mediatorer som är avgörande för att upprätthålla immun homeostas och driva utvecklingen av parodontit. En sådan insikt kommer att förändra vår förståelse av tandköttet specifik reglering av immun homeostas och ytterligare vår nuvarande förståelse av sjukdomen patogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer som beskrivs i detta protokoll följde nödvändiga riktlinjer och godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén, NIDCR / NIH.
1. Förbered i förväg
- Förbereda Komplett medium: RPMI kompletterat med 2 mM L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin och 10% FBS.
- Förbered DNas media: 50 ml RPMI-medium kompletterat med 7,5 mikrogram DNas (Se frisk, hålla på is hela tiden).
- Förbered Kollagenas-DNas media: 5 ml DNas medium plus 3,2 mg / ml kollagenas typ IV (Se frisk, hålla på is hela tiden).
- Pre-cool FACS buffert: 0,5% FBS utspätt i PBS.
- Pre-cool centrifug till 4 ° C.
- Varm skakinkubator till 37 ° C.
2. Isolering, Dissection och cellisolering från Gingivala Blocks
- Euthanize möss genom att exponera dem till CO2 i en lämplig kammare, enligt AraC riktlinjer. <li> Öppna bröstkorg och bukhåla att exponera hjärtat och inre organ. Att perfundera, göra ett snitt i den nedre hålvenen och BEGJUTA 3 ml PBS via den vänstra ventrikeln med användning av en 3 ml spruta med en 27 G-nål.
- Immobilisera kroppen och huvudet av musen på ett block med magen uppåt.
- Skär varje commissure av läppen mot halsen med en sax, separera hud som täcker käke och halsregionen, exponera de underliggande vävnader och muskler. Dissekera underläppen för att avslöja underkäken.
- Skära mellan de nedre framtänderna för att separera båda sidorna av underkäken och immobilisera varje sida för att komma åt munhålan.
- Visualisera och dissekera gommen bort från näshålan.
- Dissekera områden med en 10 blad och omfattar käken och mandibulära molära områden med omgivande tandköttet (Figur 1). Gör vertikala snitt bara främre till den första molar och bakre till den tredje molar och en horisontellt snitt pågränsen till tandköttet (vit krage av vävnads omgivande tänder).
- Placera maxillary och mandibulära block i en 50 ml koniska rör med 5 ml kollagenas / DNas (hålla på is).
- Inkubera i en skakinkubator vid 37 ° C under 1 h och under den sista 5 min av inkubation tillsätt 50 pl av 0,5 M EDTA.
- Tillsätt 5 ml kall DNas media till 50 ml rör med vävnader och snurra försiktigt för att blanda.
- Överför 4 block av vävnad på en petriskål och täck med 500 pl DNas medier. Ta bort tandköttet från varje block av vävnad med hjälp av en skalpell blad och pekar bladet i tandkötts och tandområden.
- Överför vävnader och media från petriskålen liksom tidigare DNas media som används under dissektion, till en ny 50 ml tub genom cellfilter (70 um storlek). Tvätta med DNas media (3-5 ml) alla de instrument som används och filter.
- Använda kolven i en steril 3 ml spruta, mosa vävnaden mot silen,filtrering med kall DNas media (30 till 35 ml).
- Tvätta cell sil med kall DNas media.
- Centrifugera vid 4 ° C, 314 x g under 6 min.
- Kassera supernatanten, återsuspendera i 1 ml fullständigt medium.
- Räkna celler (den förväntade mängden bör variera mellan 8 x 10 5 till 1,2 x 10 6 celler med en viabilitet av> 80%) med användning av en automatiserad cellräknare.
3. Stimulering och FACS Färgning av Gingivala celler
- Stimulera enda cellsuspension med PMA (50 ng / ml) och Ionomycin (2,5 | j, g / ml) i närvaro av en | j, l / ml av Brefeldin A.
- Inkubera i 3,5 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Spinn ner och tvätta med PBS och centrifugera vid 4 ° C; 314 xg under 6 min.
- Färga cellerna med användning av en viabilitet fläck enligt tillverkarens instruktioner.
- Fläck för extracellulära markörer (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ eller myraibodies av val) efter tillverkarens instruktioner.
- Tvätta cellerna med kall FACS-buffert och centrifugera vid 4 ° C, 314 x g under 5 min.
- Vortexa försiktigt för att störa cellpelleten.
- Fixera cellerna med 2% paraformaldehyd under 20 min vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna med kall FACS-buffert, centrifugera vid 4 ° C, 314 x g under 5 min och fläcken för intracellulära cytokiner.
- Fylla FACS rör med en lösning av kall 0,5% saponin utspädd i FACS-buffert och centrifugera vid 4 ° C, 314 x g under 5 min.
- Tillsätt 300 pl av 0,5% saponin lösning på FACS rör, inkubera under 15 min i mörker vid 4 ° C och centrifugera sedan vid 4 ° C, 314 x g under 5 min.
- Färga cellerna för intracellulära markörer (IL-17A och IFNy eller cytokiner av val) efter tillverkarens instruktioner. Tvätta cellerna med 0,5% saponin lösning och centrifugera vid 4 ° C, 314 x g under 5 min.
- Tvätta igen med FACSbuffert och centrifugera vid 4 ° C, 314 x g under 5 min.
- Återsuspendera cellerna i 300 pl FACS-buffert.
- Analysera resultat på en flödescytometer.
4. flödescytometrianalys
- Visualisera celler som skall analyseras på framåt (FSC) och sidospridning (SCC) och grind för att utesluta skräp.
- Välj enskilda celler med Forward Scatter område (FSC-A) jämfört med höjd (FSC-H) parametrar.
- Gate-celler som är levande (såsom indikeras med viabilitetsfärgning) och positiva för det hematopoietiska markör CD45 + för vidare analys (fig 2A och 2C).
- Fortsätta analys av specifika markörer såsom visas i figur 2 och figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att åskådliggöra tillämpning av protokollet visar vi representativa resultat undersöker immunceller nätverk i tandköttet hos möss med och utan parodontit (WT kontra LFA - / -, figur 2A - C). Representativa FACS tomter visar levande CD45 + hematopoetiska celler i tandköttet (Figur 2A, 2C). Isolering och bearbetning av immunceller med detta protokoll ger tillräckligt många celler för att utföra ex vivo stimulering och karakterisering av cytokinutsöndring mönster. Här visar vi IL-17 och IFN-γ-färgning i de totala CD45 + celler i stabilt tillstånd (WT) och i möss som uppvisar parodontit (på grund av LFA-brist) (Figur 2B - D). Dessa data visar potentialen för denna teknik för att fånga cytokinprofiler under vävnads steady state (WT) och inom ramen för lokala parodontit (LFA - / -). mikrofone mottagliga för parodontit vi vidare kännetecknas den gingivala immuncellkomposition särskilt för T-cellen och Medfödd lymfoid cell (ILC) fack (Figur 3A - B). Vi skulle kunna definiera produktionen av IL-17 och IFN-γ inom TCRβ + CD4 + T-cell, TCRβ + CD8 + T-cell, TCRγδ + T-cell, NK och ILC fack (Figur 3C).
Figur 1:. Isolering av murin gingiva illustration som visar de inneboende av dissektion i maxilla och det isolerade gingival segmentet som skall användas för tandköttsvävnad dissektion. (B) Segment av murin käke (molar område) med utkast till blocket dissekering och isolerade kvarter. Hematoxylin och eosin stain (H & E) av en maxillary molar segment med gingiva l vävnader som beskrivs visas i låg (C) och högre förstoring i (D). Ursprungliga förstoringar angivna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representant FACS data för cytokinproduktion från tandkötts celler. (A - C) FACS diagram som visar grind för levande CD45 + celler i mus tandköttscellpreparat efter ex vivo återstimulering med PMA och jonomycin i WT och LFA - / -. (B - D) Representativa FACS diagram som visar IFN-γ och IL-17-färgning i total CD45 + celler musen från gingiva av möss med / utan parodontit (på grund av LFA-brist).iles / ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Cytokinproduktion av immun populationer i inflammerat tandkött (A) representant FACS diagram som visar färgning för TCRβ kontra TCRγδ gated på CD45 + celler. Gating på TCRβ + celler, visar mitten plot CD4 kontra TCRβ färgning (möjliggör analys av TCRβ + CD4 + T-celler, TCRβ + CD8 + T-celler och TCRγδ + T-celler). Gating på TCRβ - TCRγδ - celler, visar rätt tomt CD45 kontra NK1.1 färgning (möjliggör analys av NK-celler). (B) representant FACS diagram som visar färgning för CD90.2 gated på CD45 + härstamning negativa celler (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ -) som identifierar medfödda lymfoidceller. (C) Representativa FACS diagram som visar IFN-γ och IL-17-färgning i cellpopulationer som identifieras. Gingiva preparat är från 20 veckor gamla LFA - / - möss som utvecklar parodontit; uppgifter är representativa för tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuvarande tekniken med framgång ger ett stort antal immunceller (från en enda mus) lämplig, inte bara för fenotypisk karakterisering, men även för funktionella studier ex vivo. En annan grupp hade tidigare publicerat ett protokoll för att isolera och karaktärisera murin tandköttsimmunceller och introducerade värdet av att använda multi flödescytometri i studiet av parodontit i djurmodeller 9. Efter avsevärd felsökning nyckeln ändring i detta protokoll var att inkludera dissektion av hela block av vävnad för att inkludera både gingival krage områden och mellanrumstandköttet (Figur 1). Med tandkötts dissektion ensam, ofta full tjocklek klaffar inte uppnås och en del av tandköttet missas särskilt i de interdentala områdena. Med hjälp av denna metod, är antalet immunceller skördade avsevärt. Denna teknik gör det också möjligt för optimal isolering av tandköttsvävnad från både överkäken end käken.
Kritiska steg för detta protokoll inkluderar en konservativ dissektion av tandkötts områden och en effektiv hastighet av dissekering. Specifikt bör block av vävnad dissekeras att endast minimal vävnaden runt tänderna (tandköttet) och inte buckala vävnaderna. Block bör dissekeras snabbt och vävnader och celler bör förbli på is för att säkerställa optimal cellviabilitet.
I syfte att felsökning är det viktigt att notera att lågt utbyte av celler kan relateras till otillräcklig tid för inkubering med kollagenas, olämpliga koncentrationer av kollagenas och / eller otillräcklig dissektion av gingivan från vävnadsblock. Alltså kan dissektion av tandkött med hjälp av förstorande luppar (2X-6X) vara till hjälp. Låg livskraft celler kan relateras till tröghet i förfarandet och i media, buffertar och celler inte kontinuerligt kvar på isen.
Begränsningar i detta protokoll, inneboende typ av vävnad dissected är storleken på de gingivala vävnaderna, jämfört med andra anatomiska barriärsajter studerats (ex. Hud eller mag-tarmkanalen), i vilka större vävnader finns tillgängliga.
Icke desto mindre har den teknik som presenteras här tillät oss att karakterisera den dominerande cellpopulationer i LFA - / - modell som spontant utvecklat parodontit. I LFA - / - möss vi identifierat en dominerande IL-17 cytokin signatur under utvecklingen av parodontit 10. Använda multi flödescytometrisk analys kunde vi definiera de cellulära källorna till IL-17 11. Vid denna sjukdom inställning IL-17 producerades av TCRγδ T-celler, CD4 + T-celler och medfödda lymfoidceller (ILC) lokalt inom tandköttet 10.
Med det stora antalet celler som isolerats med denna metod och förmågan att identifiera även små subpopulationer, blir det nu möjligt att utveckla en omfattande förståIng av specialiserad immunceller nätverk skydda tandkötts barriär integritet. Denna kritiska insikt gör det möjligt för oss att utvärdera immunsvar i tandkötts miljön. Genom att använda denna teknik kan vi nu gå vidare till isolera specifika beståndsdelar i gingiva immuncellnätet genom flödescytometrisk cellsortering, vilket gör att ytterligare analyser och karakteriseringar som skall genomföras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
