Summary
Vi har etablert en teknikk for isolering, fenotypiske karakterisering og funksjonell analyse av immunceller fra mus gingiva.
Introduction
Gingivalt vev omgir den humane og murine tannsett og er stadig utsatt for det komplekse biofilm av tannen 1. Den immuncellenettverket politi gingival barrieren er viktig å opprettholde vev integritet, noe som sikrer homeostase med de lokale kommensale mikroorganismer og, på samme tid, noe som gir effektiv immunitet mot sykdomsfremkallende utfordring 2. For å oppnå homeostase, immunsystemet nøye skreddersydd til gingival miljøet skape et høyt spesialisert immun celle nettverk, men liten detalj er kjent av tannkjøttimmuncellepopulasjoner og deres rolle i å opprettholde vev immunitet to.
Når immun homeostase blir forstyrret på gingiva, enten gjennom økt vert mottakelighet og / eller tilstedeværelse av dysbiotic mikrobielle samfunn, en betennelsestilstand, oppstår periodontitt 3 4. Periodontitt er en vanlig inflammatorisk sykdom, som fører til tap av tann supporting strukturer. I sin alvorlige former er det sett hos ca. 10% av befolkningen fem. Dissekere de viktigste faktorene som er involvert i periodontitt mottakelighet og progresjon har vist seg vanskelig seks. Imidlertid har dyremodeller vært svært nyttig for å forstå mekanismene for periodontitt initiering og progresjon 7. Modeller kan benyttes for å definere de viktigste cellepopulasjoner og molekylære meklere som er avgjørende for å opprettholde immun homeostase og drive utvikling av periodontitt. En slik innsikt vil forandre vår forståelse av gingiva spesifikk kontroll av immun homeostase og videreutvikle vår nåværende forståelse av sykdom patogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer som er beskrevet i denne protokollen følges nødvendige retningslinjer og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité, NIDCR / NIH.
1. Forbered på forhånd
- Forbered Komplett media: RPMI supplert med 2 mM L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 10% FBS.
- Forbered DNase media: 50 ml RPMI media supplert med 7,5 mikrogram DNase (Gjør frisk, holde på is til alle tider).
- Forbered Collage-DNase media: 5 ml DNase media pluss 3,2 mg / ml Collage Type IV (Gjør frisk, holde på is til alle tider).
- Pre-kule FACS-buffer: 0,5% FBS fortynnet i PBS.
- Pre-kule sentrifuge til 4 ° C.
- Varm shaker inkubator til 37 ° C.
2. Isolasjon, Dissection, og Cell Isolasjon fra gingival Blocks
- Avlive mus ved å utsette dem til CO 2 i et passende kammer, i henhold til retningslinjene AraC. <li> Åpne thorax og bukhulen for å avdekke hjerte og indre organer. For å perfuse, lage et snitt i nedre vena cava og perfuse 3 ml PBS via venstre ventrikkel ved hjelp av en 3 ml sprøyte med en 27 G nål.
- Immobilisere kroppen og hodet av musen på en pute med magen vendt opp.
- Skjær hver commissure av leppen mot halsen med en saks, skiller huden som dekker kjeven og nakkeregionen, utsette de underliggende vev og muskler. Dissekere underleppen å avdekke kjeven.
- Skjær mellom de nedre fortennene for å skille begge sider av kjeven og immobilisere hver side for å få tilgang til munnhulen.
- Visualiser og dissekere ganen bort fra nesehulen.
- Dissekere områder ved hjelp av en 10 blad og inkluderer overkjevens og underkjevens mold områder med rundt gingiva (figur 1). Lage vertikale innsnitt bare fremre til den første molar og posterior til den tredje molar og et horisontalt innsnitt igrensen av gingiva (hvit krage av vev som omgir tennene).
- Plasser overkjevens og underkjevens blokker i en 50 ml konisk rør med 5 ml Collage / DNase (holde på is).
- Inkuber i en risteinkubator ved 37 ° C i 1 time og i løpet av de siste 5 minutter av inkubering tilsett 50 ul 0,5 M EDTA.
- Tilsett 5 ml kald DNase media til 50 ml tube med vev og virvle å blande.
- Overfør 4 blokker av vev på en petriskål og dekk med 500 mL av DNase medier. Fjern gingiva fra hver blokk av vev, ved hjelp av et skalpellblad, og peker bladet inn i de gingivale og interdentale områder.
- Overfør vev og media fra petriskål, samt de tidligere DNase media brukes under disseksjon, til en ny 50 ml tube gjennom celle sil (70 mikrometer størrelse). Vask med DNase media (3-5 ml) alle de instrumenter som brukes og filter.
- Ved hjelp av stempelet av en steril 3 ml sprøyte, mos vevet mot silen,filtrering med kaldt DNase media (30 til 35 ml).
- Vask celle sil med kaldt DNase media.
- Sentrifuge ved 4 ° C, 314 x g i 6 min.
- Kast supernatanten, re-suspendere i 1 ml komplett medium.
- Tell cellene (den forventede mengden bør ligge i området mellom 8 x 10 5 til 1,2 x 10 6 celler med en levedyktighet på> 80%) ved anvendelse av en automatisert celleteller.
3. Stimulering og FACS Farging av gingival Cells
- Stimulere den eneste cellesuspensjon med PMA (50 ng / ml) og Ionomycin (2,5 ug / ml) i nærvær av 1 pl / ml av Brefeldin A.
- Inkuber i 3,5 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Spinne ned og vaske med PBS og sentrifuge ved 4 ° C; 314 x g i 6 min.
- Flekk cellene ved hjelp av en levedyktighet flekk å følge produsentens instruksjoner.
- Stain for ekstracellulære markører (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ eller mauribodies av valg) etter produsentens anvisninger.
- Vask cellene med kald FACS-buffer og sentrifuger ved 4 ° C, 314 xg i 5 minutter.
- Forsiktig vortex å forstyrre cellepelleten.
- Fiksere cellene med 2% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur.
- Vask cellene med kald FACS-buffer, sentrifuge ved 4 ° C, 314 xg i 5 minutter og beis for intracellulære cytokiner.
- Fylle FACS rør med en oppløsning av kald 0,5% saponin fortynnet i FACS-buffer og sentrifuger ved 4 ° C, 314 xg i 5 minutter.
- Tilsett 300 ul av 0,5% saponin løsning på FACS rør, inkuber i 15 min i mørke ved 4 ° C og deretter sentrifuger ved 4 ° C, 314 xg i 5 minutter.
- Flekk cellene for intracellulære markører (IL-17A og IFNy eller cytokiner valg) etter produsentens anvisninger. Vask cellene med 0,5% saponin oppløsning og sentrifuger ved 4 ° C, 314 xg i 5 minutter.
- Vask igjen med FACSbuffer og sentrifuger ved 4 ° C, 314 xg i 5 minutter.
- Re-suspendere cellene i 300 ul FACS buffer.
- Analyser resultater på en strømningscytometer.
4. flowcytometrisystemer Analysis
- Visual celler som skal analyseres på fremover (FSC) og side scatter (SCC) og gate for å utelukke rusk.
- Velg enkeltceller med fremover scatter område (FSC-A) vs. høyde (FSC-H) parametere.
- Gate celler som er direkte (som indikert ved levedyktighet farging) og positiv for det hematopoetiske markør CD45 + for videre analyse (figur 2A og 2C).
- Fortsett analyse av spesifikke markører som vist i Figur 2 og Figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å illustrere anvendelsen av protokollen, viser vi representative resultater undersøke immuncellenettverket i gingiva hos mus med og uten periodontitt (WT vs. LFA - / -, Figur 2A - C). Representative FACS tomter vise live-CD45 + hematopoetiske celler i gingiva (figur 2A, 2C). Isolering og behandling av immunceller med denne protokollen gir tilstrekkelig antall celler for å utføre ex vivo stimulering og karakterisering av cytokin sekresjon mønstre. Her viser vi IL-17 og IFN-γ farging i totalt CD45 + celler i den stabile tilstanden (WT) og i mus oppviser periodontitt (på grunn av LFA-mangel) (figur 2B - D). Disse data indikerer potensialet av denne teknikken for å fange opp cytokin-profiler i løpet av vev steady state (WT) og i sammenheng med lokal periodontitt (LFA - / -). i mice utsatt for periodontitt vi videre karakterisert gingival immunceller sammensetning spesielt i T-celle og Medfødt lymfoide celle (ILC) kamre (figur 3A - B). Vi var i stand til å definere produksjonen av IL-17 og IFN-γ innenfor TCRβ + CD4 + T-celle, TCRβ + CD8 + T-celle, TCRγδ + T-celler, NK og ILC kamrene (figur 3C).
Fig. 1: Isolering av muse-gingiva illustrasjon som viser de grenser av disseksjon i kjeve og den isolerte gingival-segmentet som skal brukes til tannkjøttvevet disseksjon. (B) Segment av murine kjeve (molar område) med omriss for blokk disseksjon og isolert blokk. Hematoxylin og Eosin flekk (H & E) av en overkjevens molar segment med gingiva l vev er beskrevet er vist i lav (C) og høyere forstørrelse i (D). Originale forstørrelser angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative FACS data for cytokinproduksjon fra gingivale celler. (A - C) FACS plott som viser gate for live CD45 + celler i mus gingivale cellepreparater følgende ex vivo re-stimulering med PMA og ionomycin i WT og LFA - / -. (B - D) Representative FACS-plott som viser IFN-γ og IL-17 farging i total CD45 + celler fra mus gingiva av mus med / uten periodontitt (på grunn av LFA-mangel).iles / ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Cytokinproduksjon av immun populasjoner i betent gingiva (A) Representant FACS plott som viser farging for TCRβ versus TCRγδ inngjerdet på CD45 + celler. Gating på TCRβ + celler, viser midterste plottet versus CD4 TCRβ farging (muliggjør analyse av TCRβ + CD4 + -T-celler, TCRβ + CD8 + T-celler og TCRγδ + T-celler). Gating på TCRβ - TCRγδ - celler, viser riktig tomt CD45 versus NK1.1 farging (åpner for analyse av NK-celler). (B) Representant FACS plott som viser farging for CD90.2 inngjerdet på CD45 + avstamning negative celler (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ -) som identifiserer medfødte lymfoide celler. (C) Representative FACS-plott som viser IFN-γ og IL-17 farging i cellepopulasjoner identifisert. Gingiva preparater er fra 20 uker gamle LFA - / - mus som utvikler periodontitt; data er representative for tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende teknikk med hell gir et stort antall av immunceller (fra en enkelt mus) passende, ikke bare for fenotypisk karakterisering, men også for funksjonelle studier ex vivo. En annen gruppe hadde tidligere publisert en protokoll for å isolere og karakterisere murine gingivale immunceller og innføres verdien av å bruke flerfarget flowcytometri i studiet av periodontitt i dyremodeller 9. Etter betydelig feilsøking nøkkelen endring i denne protokollen var å inkludere disseksjon av hele blokker av vev for å inkludere begge gingival krage områder og interdentale gingiva (figur 1). Med gingival disseksjon alene, ofte full tykkelse klaffene er ikke oppnådd, og en del av gingiva er savnet særlig i de interdentale områder. Ved hjelp av denne tilnærmingen, er antallet immunceller høstet betydelig økt. Denne teknikken gir også mulighet for optimal isolering av gingival vev både fra kjeve end kjeven.
Kritiske trinn for denne protokollen omfatter en konservativ disseksjon av gingival områder og en effektiv rente på disseksjon. Spesielt bør blokker av vev bli dissekert for å inkludere bare minimal vevet rundt tennene (gingiva) og ikke kinn vev. Blokker skal dissekert raskt og vev og celler skal være på isen for å sikre optimal celle levedyktighet.
I forbindelse med feilsøking er det viktig å merke seg at lavt utbytte av celler kan være relatert til utilstrekkelig tid for inkubering med collagenase, upassende konsentrasjoner av collagenase og / eller utilstrekkelig disseksjon av gingiva fra vevsblokker. På dette notatet, kan disseksjon av gingiva ved hjelp av forstørrelses luper (2X-6X) være nyttig. Lav levedyktighet av celler kan være relatert til Tardiness i fremgangsmåten og for å medier, buffere og celler som ikke gjenværende kontinuerlig på is.
Begrensninger av denne protokollen, som ligger til den type vev dissected er størrelsen av gingival vev, sammenlignet med andre anatomiske steder barriere studert (f.eks. folie eller magetarmkanalen), hvor større vev er tilgjengelige.
Likevel har den teknikken som presenteres her tillatt oss å karakterisere de dominerende cellepopulasjoner i LFA - / - modell som spontant utviklet periodontitt. I LFA - / - mus vi identifisert en dominerende IL-17 cytokin signatur under utviklingen av periodontitt 10. Bruke flerfarget flowcytometrisk analyse vi var i stand til å definere de cellulære kilder til IL-17 11. I denne sykdommen sette IL-17 ble fremstilt ved å TCRγδ T-celler, CD4 + T-celler og medfødt lymfoide celler (ILC) lokalt inne i gingiva 10.
Med betydelig antall celler isolert med denne metoden, og evnen til å identifisere selv små delpopulasjoner, vil det nå være mulig å utvikle en helhetlig forståelseing av de spesialiserte immunceller nettverk ivaretakelse gingival barriereintegritet. Denne kritiske innsikten vil gi oss mulighet til å vurdere immunresponser i gingival miljø. Med denne teknikken kan vi nå fortsette å isolere bestemte bestanddeler av gingiva immunceller nettverket ved flowcytometrisk cellesortering, slik at ytterligere analyser og karakteristikker som skal gjennomføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
