Abstract
Macrofagen en dendritische cellen (DCs) zijn aangeboren immuuncellen gevonden in weefsels en lymfoïde organen die een belangrijke rol bij de afweer tegen ziekteverwekkers spelen. Ze zijn echter moeilijk te isoleren voldoende aantallen te bestuderen in detail hebben dan ook in vitro modellen ontwikkeld. In vitro kweken van beenmerg afgeleide macrofagen en dendritische cellen zijn duurzaam en waardevolle werkwijzen voor immunologische studies. Hier wordt een werkwijze voor het kweken en identificeren van zowel DCs en macrofagen uit een kweek van primaire beenmergcellen van de muis met het cytokine granulocyt macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF) beschreven. Dit protocol is gebaseerd op de vastgestelde procedure ontwikkeld door Lutz et al. in 1999 voor het beenmerg afgeleide DCs. De cultuur is heterogeen en MHCII en fluoresceïne hyaluronan (HA-FL) worden gebruikt om macrofagen van onrijpe en rijpe DCs onderscheiden. Deze GM-CSF afgeleid macrofagen provide een geschikte bron van in vitro afgeleide macrofagen die lijken alveolaire macrofagen zowel fenotype en functie.
Introduction
Verscheidene in vitro kweekmethoden zijn beschreven beenmerg afgeleide macrofagen (BMDMs) en beenmerg afgeleide DCs (BMDCs) via een of een combinatie van groeifactoren genereren. BMDMs kunnen worden gegenereerd door het kweken van beenmergcellen behulp van macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) of GM-CSF 1,2. Voor BMDCs de toevoeging van FLT3 ligand aan het beenmerg kweek leidt tot niet-hechtende klassieke en plasmacytoïde DCs (CD11c high / MHCII hoog en CD 11 c lo, B220 + respectievelijk) na 9 dagen in kweek 3,4. Daarentegen vereist de niet-hechtende cellen gegenereerd na 7 tot 10 dagen in kweek met GM-CSF alleen 5,6, GM-CSF en IL-4 7 of GM-CSF en FLT3 ligand 8,9 genereren BMDCs meer gelijkenis vertonen inflammatoire DCs (CD 11 c hoog, MHCII hoog CD11b +) 10. Hoewel deze in vitro kweken worden gebruikt voor het maken of macrofagenDCs, het is onduidelijk of elke kweek ontstaat pure populaties. Hoewel bijvoorbeeld hechtende cellen in de GM-CSF kweken worden beschreven macrofagen 5, de niet-hechtende cellen van dezelfde cultuur gebruikt als DCs 6,11-13, met de veronderstelling dat ze homogeen zijn en alle waargenomen variabiliteit is door verschillende ontwikkelingsstadia 14,15. Verder hebben studies GM-CSF blijkt een essentiële groeifactor voor alveolaire macrofaag ontwikkeling in vivo 16,17, en kan worden gebruikt in vitro alveolaire macrofagen-achtige 16,17,18 genereren.
Anders dan hechting, de procedures voor het genereren van macrofagen en DC's van GM-CSF behandelde beenmerg culturen vergelijkbaar suggereren heterogeniteit kunnen bestaan in GM-CSF beenmergkweken. Dit lijkt inderdaad het geval twee papers rapporteren de aanwezigheid van BMDMs in de niet-hechtende fractie van BMDC culturen. In een paper, ze Identificaed een populatie van cellen CD 11 c + CD11b +, MHCII midden, MerTK + en CD115 +, die een gen expressie signatuur die het meest leek op alveolaire macrofagen en had een verminderd vermogen om T-cellen 19 activeren expressie. De tweede papier gebruikt MHCII en FL-HA een alveolaire macrofaag-achtige bevolking te identificeren (CD 11 c +, MHCII mid / laag, FL-HA hoog) die verschilt van onvolwassen was (CD 11 c +, MHCII medio, FL-HA laag) en volwassen DCs (CD 11 c +, MHCII hoog), zowel fenotypisch en functioneel 18. Deze papieren beide illustreren dat GM-CSF BMDC culturen zijn heterogeen, met zowel macrofagen en DC populatie aangeeft dat zorg moet worden genomen bij het interpreteren van gegevens uit BMDC culturen.
Dit protocol beschrijft hoe beenmerg, cultuur beenmergcellen in GM-CSF te isoleren en identificeren van de alveolaire macrofaag-achtigebevolking van de onrijpe en rijpe DCs in het beenmerg cultuur door middel van flowcytometrie met behulp van FL-HA-bindend en MHCII expressie. Deze procedure is gebaseerd op de vastgestelde procedure van Lutz c.s. 6 en kan genereren 5 -. 10 x 10 6 niet-hechtende cellen op dag 7 van 10 ml kweek. De cultuur is bruikbaar vanaf dagen 7-10 en levert een heterogene populatie van macrofagen, onrijpe en rijpe DCs, evenals een aantal voorlopers op dag 7. Dit is een eenvoudige werkwijze om te groeien en te isoleren in vitro alveolaire-achtige macrofagen in grote hoeveelheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De muizen werden gedood in overeenstemming met de Canadese Raad over Animal Care richtlijnen voor ethisch dierlijke onderzoek van procedures die door de University of British Columbia Animal Care Committee goedgekeurd.
1. Het verwerven van een enkele cel Bone Marrow Schorsing van Mouse bovenbeen en onderbeen
- Schakel een biologisch veiligheidskabinet (BSC) 15 minuten voor aanvang van de procedure kabinet lucht zuiveren en vervolgens schoon / spuitnevel BSC oppervlak met 70% ethanol zorgen voor luchtstroom stabilisatie. Houd alles zo steriel mogelijk te maken voor het geheel van het protocol. Knip niet de botten onder niet-steriele omstandigheden.
- Bereid dissectie-instrumenten door het weken in 70% ethanol (1 paar dissectie schaar, 2 paar pincetten), Hank's gebalanceerde zoutoplossing met 5% foetaal kalfsserum (HBSS-FCS), steriele petrischalen (100 mm x 15 mm), 1 ml injectiespuiten, naalden 26½, conische verzamelbuizen (15 ml of 50 ml) en papieren handdoekjes in de BSC.
- Euthanaseren de muis met behulp vanprotocollen door onderzoek dier ethische commissie van de instelling goedgekeurd. Breng in de BSC, bovenop een of twee papieren handdoeken en spuit de muis met 70% ethanol.
- In de BSC, opent een steriele petrischaal aseptisch aliquot 10 ml HBSS-FCS aan de basis en 1-2 ml aan het deksel.
- Plaats de muis in de maag met de rug naar boven en heffen de huid rond de thoracale secties met vingers van de niet-dominante hand. Gebruik de schaar om een incisie waar de huid wordt opgetild maken.
- Vasthouden aan beide uiteinden van de snede, een uiteinde met elke hand en trek elkaar de huid rond de muis van achter naar de maag, verder trekken tot twee uiteinden van de incisie bijeen op de maag.
- Flip de muis buik naar boven, en met één hand trek de onderste helft van de huid naar beneden in de richting van het been, houd het terugtrekken van de huid totdat de benen worden blootgesteld.
- Houd de voet van de muis en snijd de achillespees boven het enkelgewricht ende ligamenten verbinden de spieren aan voet aan de onderzijde van de tibia met een schaar. Dit lost de voet van de botten.
- Terwijl het been van de voet, snijd de spieren en ligamenten met een schaar rondom het kniegewricht aan de onderkant van de femur de dijspieren scheiden van het onderbeen. Gebruik een tang om voorzichtig te trekken losgemaakt spieren weg van de fibular en dijbeen oppervlakken. Zorg ervoor dat u de dijbeenslagader verbreken om zware bloeden te voorkomen.
- Met een hand vast te houden aan de voet, druk geopend schaar aan de bovenkant van het dijbeen in het heupgewricht, draait het been en trek voorzichtig aan het dijbeen te scheiden van het heupgewricht tijdens het gebruik van de schaar om de final cut te bevrijden het been uit het lichaam.
- Vanaf dit punt, alleen houdt het weefsel met een steriel pincet. Houd vast aan het been aan de ene kant en trek de voet op de andere.
NB: Dit moet veel kracht vereisen, zoals het aansluiten van ligamenten in stap worden gesneden1,9. Als alternatief, snijd het scheenbeen net boven de enkel, waar het bot is gefuseerd. - Houd het been door het distale uiteinde van het femur met een set pincet en proximale einde van de tibia en fibula met een andere, buig het scheenbeen en kuitbeen in de tegenovergestelde richting van het kniegewricht te scheiden van het femur en patella.
- Gebruik een tang de resterende banden en spieren nog aan het onderbeen botten naar beneden te trekken. Hier, verwijder de fibula met bindweefsel met tang is te klein om te worden gespoeld beenmergcellen. Plaats de gereinigde tibia op het omgekeerde deksel petrischaal.
- Houd het onderste uiteinde van het femur met een set pincet en de patella met een andere, buig de patella en de omringende weefsels in de tegengestelde richting van de verbinding voor verwijdering. Reinig vervolgens de resterende bindweefsel van het dijbeen; trekken ze weg met een pincet en plaats het op het omgekeerde petrischaal deksel. Gooi de patella.
- Herhaal 1.7- 1,13 voor de andere kant indien nodig. Breng de botten 1,6 ml microcentrifuge buisjes met 1 ml steriele HBSS-FCS transport indien nodig.
- Plaats botten op het omgekeerde deksel petrischaal met 1-2 ml HBSS-FCS, een tang om resterende weefsel nog aan de tibia en femur reinigen, breng de botten van de voet petrischaal met 10 ml HBSS- FCS. Als alternatief, het reinigen van de botten en verwijder bevestigd spierweefsel met behulp van een 70% ethanol doorweekt weefsel.
- Snijd elk van de botten in de helft met een schaar. Gedeeltelijk af te schermen van de petrischaal met een steriele deksel tijdens het snijden om te zorgen voor de botten blijven in de schotel. Als alternatief, snijd het einde van elk bot te spoelen mogelijk te maken in de volgende stap.
- Bevestig de 26½ G naald op de 1 ml spuit, en stelt 1 ml HBSS-FCS van de petrischaal. Steek de punt van de naald in het uiteinde van een beenstuk en spoel de beenmergcellen (zachte rode weefsel in de botten). Steek de naald in de kopvan het bot en het open einde, totdat de rode beenmerg wordt verwijderd. Let op de botten zo wit van kleur.
- Passen zichtbare klonten beenmerg door de spuit een paar keer om een enkele celsuspensie te vormen.
- Gooi de gespoelde botten. Gebruik een 10 ml pipet de celsuspensie goed mengen en overbrengen naar de verzamelbuis. Spoel de petrischaal eenmaal met 5 ml HBSS-FCS om achtergebleven cellen te verzamelen in de schotel. Plaats cellen op ijs.
Opmerking: Het beenmerg celsuspensie nog steeds levensvatbaar indien bewaard 2-3 uur bij 4 ° C.
2. Plating en het kweken van beenmergcellen (BMCS)
- Bereid de volgende reagentia en benodigdheden.
- Bereid rode bloedcel (RBC) lysis buffer door 0,84% ammoniumchloride in een uiteindelijke oplossing van 2 mM Tris pH 7,2, vervolgens steriliseren door filtreren door een 0,2 micron filter.
- Bereid BMC media door het toevoegen van 10% FCS, 20 mM HEPES, 1 x niet-essentiële aminozuren, 55 & #181, M 2-mercaptoethanol, 50 U / ml penicilline en streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutamine aan RPMI medium 1640.
- Verkrijgen commercieel verkrijgbaar recombinant GM-CSF of GM-CSF gebruikt supernatant van Ag8.653 myeloma cellen getransfecteerd met de GM-CSF-gen 20. Bepaal de concentratie van GM-CSF in het supernatant met ELISA en voeg het equivalent van 20 ng / ml aan de BMC media.
- Spin down het beenmerg cellen op 314 xg gedurende 5 minuten. De pellet is rood, door RBCs. In de BSC, zuig het supernatant met behulp van een steriele glazen Pasteur pipet gehecht aan zuigen Vacuum, los de pellet door te tikken, voeg dan 10 ml RBC lysis buffer. Vortex om de cellen opnieuw te suspenderen en incuberen in RBC lysis buffer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Voeg 10 ml HBSS-FCS draai vervolgens cellen bij 314 xg gedurende 5 minuten en zuig de supernatant. Let op de celpellet als witte kleur. Resuspendeer cellen in gewenste volume BMC media.
- Tel de resuspended-cellen met een hemocytometer na kleuren dode cellen met 0,4% trypan blauw.
OPMERKING: Indien beenmerg van één been (één tibia en femur) wordt gebruikt, hersuspenderen in 5 ml BMC media, neem 10 gl celsuspensie en verdun met 70 gl 0,4% trypan blauw, meng en breng 10 pl de 1/8 cel verdunning van de hemocytometer kamer. Tel de levensvatbare cellen in vier kwadranten: het gemiddelde van de vier kwadranten tellingen x verdunningsfactor x 10 4 = aantal cellen per ml. Een femur en tibia van het ene been het algemeen op ongeveer 2-4 x 10 7 cellen na RBC lysis. - Schat het aantal schotels 10 ml van beenmerg culturen nodig voor stroomafwaartse experimenten op basis van het totale aantal cellen nodig voor experimenten aan het eind van de kweek.
OPMERKING: Elk gerecht moet 2 x 10 6 beenmergcellen bij de eerste seeding en rendementen 5-10 x 10 6 cellen op dag 7.- Aliquot het totaal aantal cellen voor uitplaten in een nieuwe buis, het afsluiten bij 314 xg gedurende 5 minuten, zuig de supernatant en resuspendeer cellen op 4 x 10 6 cellen / ml in BMC media.
- Bereid een nieuwe steriele 100 mm x 15 mm petrischaal met 9,5 ml van BMC media met 200 ng van GM-CSF (recombinant of van GM-CSF bevattende supernatant). Voeg 500 ul van de 4 x 10 6 cellen / ml beenmergcellen naar het midden van de petrischaal voor de uiteindelijke concentratie van 2 x 10 5 cellen / ml in 10 ml.
NB: Het is belangrijk om een steriele petrischaal geen weefselkweek schotel gebruiken. Ook bij het toevoegen van de cellen, zorgen cellen geconcentreerd blijven in het midden en het minimaliseren van verstoring van het serviesgoed zaaien en tijdens verandering van medium. Incubeer cellen bij 37 ° C en 5% CO2. Dit is dag 0 in de cultuur. - Op dag 3, voeg 10 ml van verse media met BMC 200 ng GM-CSF elk gerecht cellen. Zorg ervoor dat verstoring o minimaliserenf de cellen in suspensie geconcentreerd. Totale volume van celcultuur nu 20 ml.
- Observeer cellen onder de lichtmicroscoop bij 100X vergroting. Let op talrijke niet-hechtende cellen (rond) en een paar hechtende cellen (flat). Cellen in groepen van drie of vier lijkt op bladeren van een bloem te zien, wat aangeeft proliferatie.
- Op dag 6 uitvoeren van een half media verandering. Verwijder voorzichtig 10 ml van de media in een steriele 50 ml conische buis, spin down bij 314 xg gedurende 5 minuten, aspireren en gooi de supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 10 ml vers BMC media met 20 ng / ml GM-CSF, zacht vortex en toevoegen oorspronkelijke celkweek schotel voor een totaal volume van 20 ml. Acht cellen onder de microscoop.
OPMERKING: Dag 7 cultuur moet op 70% of meer in confluentie met hechtende platte cellen en dichte wolken ronde niet-hechtende cellen.
3. Het verzamelen en voorbereiden van BMDC en BMDMs voor flowcytometrie
- <li> Houd alle buffers bij 4 ° C.
- Oogst de cellen van dag 7 tot dag 10. Om de cellen eerste overdracht 10 ml van de kweek supernatant van een 50 ml conische verzamelbuis oogsten, dan kantelt de schaal verticaal ongeveer 30 ° en was de schaal door pipetteren de resterende 10 ml cultuur vanaf de bovenkant van de schaal. Herhaal dit wassen 5 keer, elke keer draaien van de schotel met een derde.
- Draagt de resterende 10 ml van cellen naar dezelfde verzamelbuis en gooi de plaat en de hechtende cellen.
NB: De wasbeurten zal niet hechtende en losjes hechtende cellen te verwijderen; de platte hechtende cellen zijn bestand tegen de wassingen. Typisch tussen 5-10 x 10 6 niet-hechtende cellen worden verwacht van een plaat op dag 7 en 2-5 x 10 6 cellen op dag 10, maar Lutz et al. meldde 10 x 10 6 cellen op dag 10. De hechtende cellen zijn normaal gesproken niet genomen. Indien deze cellen moeten worden vergeleken met de niet-hechtende cellenZe kunnen als volgt worden verwijderd. Voeg 5 ml 0,7 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4 om de schaal nadat de niet-hechtende cellen verwijderd, incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten, pipet op en neer om de hechtende cellen te verwijderen en te verzamelen in een afzonderlijke buis. - Spin down van de verzamelde cellen op 314 xg gedurende 5 minuten en zuig het supernatant. Hersuspenderen in 5 ml steriele BMC medium bij 4 ° C, wervel voorzichtig te mengen en te tellen met behulp van trypan blauw en hemocytometer.
LET OP: Elk gerecht zal opleveren 5 - 10 x 10 6 niet-hechtende cellen van een dag 7 cultuur. Van nu af aan, voeren alle stappen bij 4 ° C. - Voor flowcytometrische analyse overdracht 2 x 10 5 cellen per monster in 5 ml polystyreen rondbodem buizen wordt 300 pl FACS buffer bij 4 ° C (1x fosfaat gebufferde zoutoplossing, 2 mM EDTA en 2% runderserumalbumine) in elk monster.
- Spin cellen neer op 314 xg gedurende 5 minuten en zuig het supernatant. Let op een zichtbare witte, ondoorzichtige pellet aan debodem van de buis.
- Resuspendeer cellen in 100 gl ongelabeld Fc receptor Ab Fc-receptor binding (Met 1/10 supernatant van 2.4G2 producerende myeloma cellijn) en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Voeg vervolgens 300 gl FACS buffer aan elk monster voorzichtig vortex, dan draaien de cellen neer op 314 xg gedurende 5 minuten en zuig de supernatant.
- Resuspendeer cellen in 100 gl CD11c-PeCy7 bij 0,2 ug / ml, Gr1-Pacific Blue bij 0,25 ug / ml, MHCII-APC bij 0,05 ug / ml en FL-HA bij ongeveer 2 ug / ml macrofagen en DC identificeren.
LET OP: FL-HA werd bereid in huis met behulp van fluoresceïne en de haan kam hyaluronzuur natriumzout zoals eerder beschreven 21. - Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C binding aan het celoppervlak te laten. Voeg 300 gl FACS buffer aan elk monster voorzichtig vortex, dan draaien de cellen neer op 314 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en zuig de supernatant. OPMERKING: als biotinylated antilichamen worden gebruikt in de 3.8, herhaal 3,8-9 met fluorescerende streptavidine.
- Was de cellen met een 300 gl FACS buffer, vortex voorzichtig te mengen en spin down de cellen bij 314 g gedurende 5 min. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 200 ui FACS-buffer bevattende 0,1-0,2 ug per ml propidiumjodide of DAPI om levensvatbare cellen te labelen. De cellen zijn nu klaar voor flowcytometrische analyse 22.
OPMERKING: zie resultaten en Figuur 3 voor de details van de bevolking en de manier waarop de cellen werden afgesloten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een stroomdiagram overzicht van de belangrijkste stappen van deze werkwijze wordt getoond in figuur 1. De dichtheid en de morfologie van het beenmerg kweek op verschillende tijdstippen van kweek worden getoond in Figuur 2. Op dag 1 zijn de cellen klein en dun maar dag 3, er meer cellen, wat groter en een paar begonnen te houden. Overdag 6 is er een duidelijke hechtende en niet-hechtende fractie (Figuur 2A). De kweek kan worden verzameld vanaf dag 7-10 met een hoger percentage CD11c + cellen aanwezig op dag 10. Figuur 2B toont de dag 7 cultuur vóór de oogst en de afgescheiden hechtende en niet-hechtende celfracties. Het hechtende gedeelte bestaat uit de cellen gelaten nadat het licht wast dat de niet-hechtende fractie te verwijderen. De niet-hechtende fractie sterk verrijkt op cellen met een dendritische morfologie, die duidelijker in de digitaal vergrote im zichtbaarleeftijden in de inzetten in figuur 2B. Zodra de niet-hechtende fractie wordt verwijderd (dag 7 of dag 10) werden de cellen geanalyseerd door stromingscytometrie na labeling met fluorescerende antilichamen tegen belangrijke celoppervlak markers, zoals hierboven beschreven. Figuur 3 toont representatieve doorstroomcytometrie plots van de niet-hechtende fractie van de cultuur op dag 7 en dag 10.
Voor de identificatie van zowel macrofagen en DC, hek aan CD 11 c + en Gr1 - cellen na gating eerste maat en levende cellen (Figuur 3A en B). Op dag 7 culturen, de CD11c + Gr1 - bevolking in de niet-hechtende celfractie is typisch 60 tot 70% van de totale levende cellen en dit wordt verhoogd tot 90% of meer op dag 10 (Figuur 3B). De CD 11 c + Gr1 - bevolking op dag 7 en dag 10 kan worden onderverdeeld in drie hoofdcategorieën subsets behulp MHCII en FL-HA Binding: MHCII mid / laag FL-HA binding hoog macrofagen (P1), MHCII mid FL-HA-bindende laag (P2) cellen die onrijpe DC en MHCII high FL-HA-bindende laag mature DC (P3) (figuur 3C en vindplaats 18 ). De FL-HA laag, MHCII lage populatie (P0) waargenomen op dag 7 is aangetoond dat voorlopers voor de P1-P3 cellen 18 bevatten. Deze populatie is niet evident op dag 10 hetgeen impliceert dat verdere rijping van de kweek is opgetreden. Dit wordt ook ondersteund door het hoogste percentage van CD11c cellen in de kweek alsook iets hogere percentages van de P2 en P3 DC populaties op dag 10. Figuur 3D toont MerTK, als een macrofaag marker, wordt sterk tot expressie gebracht zowel macrofagen en onrijpe DC populaties (P1 en P2), maar uitgedrukt in mindere mate op rijpe DCs (P3 cellen). Met name, analyse van de hechtende fractie onthult de aanwezigheid van de P0, P1 enP2 populaties, maar niet de P3 rijpe DC populatie (gegevens niet getoond). Zo zijn macrofagen in de hechtende en niet-hechtende fracties maar rijpe DCs aanwezig in de niet-hechtende fractie zijn.
. Figuur 1: een stroomschema aangeven de belangrijkste stappen van de methode Primaire cellen worden uit het beenmerg, uitgeplaat en in kweek gehouden gedurende 7-10 dagen wanneer zij voor gebruik in verdere experimenten, gezuiverd of gebruikt in FACS-analyse worden geoogst. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: microscopisch onderzoek van GM-CSF Afgeleide Bone Marrow Cells. EEN) het beenmerg kweek op dag 1, 3 en 6 tonen de toename van het aantal cellen, veranderingen in morfologie en opkomst afzonderlijke hechtende en niet-hechtende fracties. B) Linker paneel toont de dag 7 beenmerg cultuur en de typische celdichtheid. Het middenpaneel toont de dag 7 hechtende cellen na de oogst van de niet-hechtende fractie en het rechter paneel toont de niet-hechtende fractie geoogst op dag 7. Insets digitaal vergrote beelden van cellen in deze fractie met dendritische morfologie. De witte schaal balk geeft 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vertegenwoordiger fenotype van de GM-CSF Cultuur op dag 7 en dag 10. Niet-klevendecellen uit de cultuur worden gelabeld met CD 11 c, Gr1, MHCII, FL-HA, en MerTK op dag 7 of dag 10 en geanalyseerd op hun fenotype door flowcytometrie. A) De cellen werden eerst gated op maat dan levende cellen. B) Toont een plot van de gated cellen met CD11c en Gr1 (de neutrofielen / monocyt marker) en identificeert de CD11c + Gr1 - bevolking met de macrofaag en dendritische cellen. Gating op deze populatie, C) toont de flowcytometrie plot van MHCII en FL-HA binding, die de scheiding van de alveolaire-achtige macrofagen (P1) van onrijpe DCs (P2 toont) en rijpe DCs (P3), zoals beschreven in Poon et al. 18. D) Histogrammen vergelijken MerTK uitdrukking tussen de P1 (macrofagen), P2 (onrijpe DC) en P3 populaties (volwassen DC's) op dag 7 en dag 10. klik hier om een grotere versie van deze Figu bekijkenopnieuw.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript, bieden we een werkwijze voor het GM-CSF macrofagen en DCs uit een enkele muis beenmerg cultuur die is aangepast van Lutz et al. 6. MHCII expressie en FL-HA binding maakt onderscheid tussen onrijpe DCs en macrofagen in deze cultuur (zie figuur 3C), die voorheen moeilijk is geweest. Dit, samen met een ander verslag Helft et al. 19, illustratie heterogeniteit in GM-CSF geïnduceerde BMDC culturen die voorheen gedacht alleen DCs zijn. Helft et al. 19 gebruikt heel andere cultuur voorwaarden BMDCs te genereren maar ook vonden een significante macrofaag bevolking. GM-CSF geïnduceerde macrofagen lijken alveolaire macrofagen en GM-CSF geïnduceerde DC's lijken inflammatoire DC's, terwijl FLT3 ligand aangevuld BMDC culturen produceren klassieke en plasmacytoïde DCs 3,4. Verschillende DC en macrofaag populaties zijn ook waargenomen in vivo under homeostatische en ontstekingsaandoeningen, en er is veel discussie in het veld wat een DC en macrofaag 10 definieert. Dit geldt met name wanneer het gaat om inflammatoire monocyten afgeleide DC's en dit is ook relevant in deze BMC. Het is dus belangrijk om verschillende fenotypische markers, functionele gegevens, en eventueel genexpressie gebruiken om een bepaalde populatie karakteriseren. Het is ook mogelijk dat deze in vitro DC en macrofaag populaties verder onderverdeeld als meer functionele en fenotypische merkers ontdekt zijn.
In deze werkwijze wordt de markers CD 11 c, Gr1, MHCII en FL-HA worden gebruikt om macrofagen van onrijpe en rijpe dendritische cellen onderscheiden van de niet-hechtende fractie van de BMC cultuur. Dit is anders dan Helft et al. 19, die de markeringen CD11c gebruikt, CD11b, CD115, CD135, MerTK en MHCII een macrofaag populatie te onderscheiden van volwassen DCs. MerTK expressie niveaus kunnen distinguish tussen macrofagen (P1) en rijpe DCs (P3), maar niet onrijpe DCs (P2) (Figuur 3D). Zo FL-HA en MHCII zijn nuttig markers voor macrofagen van zowel onvolwassen en volwassen DC bevolkingsgroepen discrimineren. Deze macrofagen zijn ook functioneel verschillend van DC's in deze BMC cultuur en dit wordt aangetoond in meer detail elders 18. In het kort, na LPS stimulatie van de BMC macrofagen produceren verschillende cytokines dan mature DCs en geen naïeve T-cellen 18 niet te activeren. Deze macrofagen ook lijken alveolaire macrofagen, zowel fenotypisch en functioneel als zowel bind FL-HA en express CD11c, MerTK, CD200R, CD206 en F4 / 80 en na LPS stimulatie produceren TNF-α nog niet in staat om naïeve T-cellen 18 te activeren zijn. Er zijn echter ook verschillen: BMC macrofagen CD11b + en hebben lagere niveaus van Siglec F vergeleken met ex-vivo alveolaire macrofagen, suggereert deze cellen zijn vergelijkbaar, maar niet identical om alveolaire macrofagen.
Er zijn een aantal belangrijke stappen om het succes van dit protocol te waarborgen. Het is belangrijk om de steriliteit te handhaven met ingang blootstellen het beenmerg. Bij het verplaatsen in en uit de BSC, spray gehandschoende handen en voorwerpen met 70% ethanol. Hoewel het nuttig is om instrumenten te spoelen in 70% ethanol te steriliseren, ethanol is giftig voor beenmergcellen, zodat de lucht drogen de tools en zorgen voor de ethanol heeft alvorens botten of cellen in contact met hen verdampt. Bovendien, vermijd contact opneemt met de muis weefsels of cellen met niet-steriele apparatuur of handen tijdens het beenmerg oogst. Hoewel penicilline en streptomycine suppletie wordt in de media, kan onzorgvuldige behandeling van de cellen tot gist- of fungale besmetting. Bovendien, omdat immuuncellen met fagocytische activiteit gegenereerd in deze cultuur, geringe verontreiniging kan niet door eenvoudig microscopisch waarnemen van de celkweek waargenomen, dus is het belangrijk t identificerenHij tekent voor besmetting. Bijvoorbeeld kan het aantal cellen worden verminderd en de expressie van cel activatie merkers zoals CD40 en CD86 kunnen toenemen bij geanalyseerd door flowcytometrie. Media kleur kan ook geel als gevolg van een pH-verandering als gevolg van vervuiling. Bij besmetting optreedt, wordt de BMC cultuur is onbruikbaar. Experimentele consistentie te behouden, is het belangrijk om een suspensie van losse cellen uit het beenmerg door vortexen genereren en verkrijgen een nauwkeurig celtelling instellen van de BMC culturen. Ook eventuele bindweefsel van het been eindigt in de enkelvoudige celsuspensie, filtreren door een steriel filter 70 micron te verwijderen. Typische opbrengsten cel één plaat van de niet-hechtende fractie op dag 7 zijn tussen 5-10 x 10 6 cellen. Celaantallen zijn meestal een goede indicatie dat het protocol goed werkt. Met deze procedure hebben we meestal krijgen tussen 2-5 x 10 6 cellen op dag 10, terwijl Lutz meldt 10 x 10 6 cellen. Wij voeren RBC lysis op The aanvankelijke beenmergcellen terwijl het protocol door Lutz et al. niet en dus deze stap kan optioneel zijn. Variaties in het percentage cellen CD11c en cijfers en de verhoudingen van macrofagen en DC's kunnen van verschillende bronnen of partijen van FCS en dus is het essentieel om nieuwe batches van FCS testen BMC culturen consistente experimentele resultaten. GM-CSF-concentratie werd gevarieerd van 5 ng / ml tot 40 ng / ml en dit had geen significante invloed op de opbrengst cel. Celdichtheid kan ook invloed op de rijping van de kweek. Bijvoorbeeld Helft et al. geënt 1 x 10 7 cellen in 4 ml medium met een grotere percentage cellen met hoge expressie MHCII 19 geproduceerd. Het tijdstip wanneer de cellen geoogst kan ook invloed het percentage aanwezig is in de niet-hechtende fractie populaties. De cellen worden meestal verzameld tussen dagen 7-10 25-27 maar sommige studies verzamelen BMCS op dag 6 19,23,24. Als er meer cellen nodig, cultuur BMCSin grotere 150 mm x 15 mm petrischalen in 40 ml van dezelfde dichtheid. In dit geval een halve volume media verandering gebeurt op zowel dag 3 en dag 6 (dat wil zeggen, 20 ml medium verwijderd, de cellen afgecentrifugeerd en vervangen door vers 20 ml medium aangevuld met 20 ng / ml rGM-CSF). Deze platen genereren doorgaans 3-6 x 10 7 cellen per schaaltje op dag 7. FL-HA is een belangrijk reagens, samen met MHCII, om macrofagen te onderscheiden van onvolwassen en volwassen DCs in de BMC cultuur. Aldus eenmaal is gemaakt Titreer de FL-HA voor toepassing op cellen waarvan bekend constitutief binden HA zoals alveolaire macrofagen 18 of BW5147 T-cellen en bevestig de specificiteit met behulp van een HA-blokkerende CD44 antilichaam (KM-81, commercieel verkrijgbaar), ongelabeld HA of CD44-deficiënte cellijn. CD11c - Gr1 + cellen in de cultuur kan functioneren als een interne controle voor niet HA-bindende cellen en een fluorescentie-min één controle (FMO) of CD44 deficiënte BMC culturen zijn sterk aanbevolen voor nauwkeurige setting van de FL-HA-bindend gate.
Hoewel experimenten kunnen worden uitgevoerd met een heterogene cultuur, is het raadzaam om te verrijken voor de DC of macrofaag populatie behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering of antilichaam beklede magnetische korrels 18 op basis van de expressie van CD11c, Gr1, MHCII en HA binden. Mogelijke experimenten omvatten stimulatie Toll-like receptor agonisten zoals LPS activering en cytokineproductie, T-celactivering assays of bijkomende karakterisatie door middel van flowcytometrie gemeten. Bijvoorbeeld na 8 en 24 uur stimulatie, kan flowcytometrie worden gebruikt om de intracellulaire kleuring voor cytokinen en / of oppervlak etiketteren van co-stimulerende moleculen zoals CD40 en CD86 te meten, zoals beschreven in 18. Intracellulaire cytokine labelingprocedures vereist voorbehandeling van de cellen met Brefeldine A, die secretie voorkomen en kan de cytokine op te bouwen in de cel. Voor T cel activatie assays waarbij loading van een antigen, zoals de OVA peptide door een antigeen presenterende cel, gezuiverd macrofagen op basis van MHCII en HA binding wordt niet geactiveerd T-cellen, terwijl onvolwassen en volwassen DCs zal 18. Opgemerkt wordt dat de sorteerprocedure alleen de dendritische cellen activeren enigszins, waardoor het belang negatieve controles bij alle experimenten omvatten.
Zoals bij elke in vitro werkwijze, zijn er voordelen en nadelen ten opzichte van het gebruik in vivo of ex vivo cellen. Het nadeel is dat in vitro afgeleide cellen niet precies mimic in vivo cellen, maar ze hebben het voordeel dat ze in voldoende mate kan worden gegenereerd om functionele en biochemische analyse mogelijk, iets dat vaak niet haalbaar ex vivo cellen. Deze methode van macrofagen en DC identificatie zal toekomstig onderzoek om meer homogene celpopulaties uit een cultuur te verkrijgen met eerder ondergewaardeerde heterogeneity. Gezuiverde macrofagen naar het GM-CSF cultuur lijken alveolaire macrofagen van de long 18, biedt een geschikte bron van alveolaire macrofagen-achtige in vitro analyse. Zo kunnen deze HA binding macrofagen worden gebruikt voor het screenen op geneesmiddelen die alveolaire macrofagen wijzigen en mechanismen van Mycobacterium tuberculosis infectie en resistentie te onderzoeken. Gezien de recente ontdekking dat GM-CSF en M-CSF beenmerg afgeleide macrofagen transplantatie in muizen pulmonaire proteïnose 28,29 kan verlichten, kan deze methode macrofagen identificeren GM-CSF culturen helpen om de doeltreffendheid van de voorgestelde behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (Grant MOP-119.503) en het Natural Sciences and Engineering Council van Canada (NSERC). NSERC ook ondersteund zomer studentships te YD en AA YD wordt ondersteund door de Universiteit van British Columbia (UBC) met een 4-jaar Fellowship Award, wordt AA ondersteund door CIHR met een afgestudeerde student Master award (CGS-M). Wij danken Calvin Roskelley voor hulp bij de microscoop gebruikt om de beelden in figuur 2 te genereren. We hebben ook steun van de UBC Animal en flowcytometrie voorzieningen te erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al.
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
