Abstract
Os macrófagos e as células dendríticas (CDs) são células imunes inatas encontradas em tecidos e órgãos linfóides, que desempenham um papel fundamental na defesa contra agentes patogénicos. No entanto, eles são difíceis de isolar em quantidade suficiente para estudá-los em pormenor, por conseguinte, os modelos in vitro têm sido desenvolvidos. Culturas in vitro de osso derivadas de medula macrófagos e células dendríticas são bem estabelecidos e métodos úteis para estudos imunológicos. Aqui, um método para a cultura e identificação de ambas as DCs e macrófagos a partir de uma única cultura de células da medula óssea primário do rato utilizando o factor de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos de citocinas (GM-CSF) é descrita. Este protocolo é baseado no procedimento estabelecido pela primeira vez desenvolvido por Lutz et al. em 1999 para DCs derivadas de medula óssea. A cultura é heterogênea, e MHCII e ácido hialurônico fluoresceína (FL-HA) são usadas para distinguir macrófagos de DCs imaturos e maduros. Estes GM-CSF macrófagos derivados próvide uma fonte conveniente de macrófagos derivados in vitro que se assemelham estreitamente macrófagos alveolares em ambos fenótipo e função.
Introduction
Vários métodos de cultura in vitro foram descritas para gerar macrófagos de osso derivadas de medula (BMDMs) e DCs derivadas da medula óssea (BMDCs) utilizando um ou uma combinação de factores de crescimento. BMDMs pode ser gerado através da cultura de células da medula óssea utilizando um factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF) ou GM-CSF a 1,2. Para BMDCs, a adição de ligando de FLT3 para a cultura de medula óssea dá origem a DCs clássicos e plasmocitoides não aderentes (CD11c alta MHCII alta e CD11c Lo /, B220 +, respectivamente), após 9 dias de cultura em 3,4. Em contraste, células não-aderentes gerado após 7 a 10 dias em cultura com GM-CSF sozinho 5,6, GM-CSF e IL-4 7, ou GM-CSF e o ligando de FLT3 8,9 gerar BMDCs assemelha-se mais estreitamente DCs inflamatórias (alta CD11c, CD11b MHCII alta +) 10. Embora estas culturas in vitro são utilizados para gerar ou macrófagosDCs, não é claro se cada cultura dá origem a populações puras. Por exemplo, embora as células aderentes nas culturas de GM-CSF são descritos para ser macrófagos 5, as células não aderentes a partir da mesma cultura são utilizados como DCs 6,11-13, com o pressuposto de que eles são homogéneos e qualquer variabilidade observada é devido a diferentes fases do desenvolvimento 14,15. Além disso, estudos têm encontrado GM-CSF a ser um factor de crescimento essencial para o desenvolvimento de macrófagos alveolares in vivo 16,17, e pode ser utilizado in vitro para gerar macrófagos alveolares do tipo 16,17,18.
Para além de adesão, os procedimentos para a produção de macrófagos e células dendríticas a partir de GM-CSF tratado culturas de medula óssea são muito semelhantes, sugerindo heterogeneidade pode existir dentro de GM-CSF culturas de medula óssea. Este facto parece ser o caso, como dois trabalhos relatam a presença de BMDMs na fracção não-aderente de culturas BMDC. Em um papel, que identified uma população de células como CD11c +, CD11b +, MHCII mid, MerTK + e CD115 +, que expressa uma assinatura a expressão de genes que se assemelhava mais estreitamente macrófagos alveolares e tinha uma capacidade reduzida de activar células T 19. O segundo papel utilizado MHCII e FL-HA para identificar uma população de macrófagos-like alveolar (CD11c +, MHCII média / baixa, FL-HA alta), que era distinta da imaturo (CD11c +, MHCII mid, FL-HA baixo) e madura DCs (CD11c +, MHCII alta), tanto fenotipicamente e funcionalmente 18. Estes papéis ambos ilustram que as culturas GM-CSF BMDC são heterogêneas, contendo tanto populações DC, indicando que deve ser tomado cuidado ao interpretar os dados a partir de culturas BMDC macrófagos e.
Este protocolo descreve como isolar medula óssea, as células de medula óssea de cultura em GM-CSF, e identificar o macrófago alveolar semelhantepopulação dos DCs imaturos e maduros na cultura de medula óssea por citometria de fluxo utilizando FL-HA de ligação e expressão MHCII. Este procedimento é baseado no procedimento estabelecido de Lutz et ai 6 e é capaz de gerar 5 -. 10 X 10 6 células não aderentes no dia 7 de uma cultura de 10 ml. A cultura é utilizável a partir de 7 a 10 dias e produz uma população heterogénea de macrófagos, DC imaturas e maduras, bem como alguns progenitores no dia 7. Isto proporciona um método simples para isolar e cultivar in vitro macrófagos alveolares semelhantes em grandes quantidades.
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Protocol
Os ratos foram sacrificados de acordo com a Canadian Council on Animal Care diretrizes para pesquisa com animais ética por procedimentos aprovados pela Universidade do Comitê Animal Care Columbia Britânica.
1. Aquisição de uma única célula de Medula Óssea de suspensão de rato fémur e da tíbia
- Ligue uma câmara de segurança biológica (BSC) 15 min antes do início do procedimento para purgar ar do gabinete e permitir a estabilização do fluxo de ar, a superfície BSC, em seguida, limpa / pulverização com 70% de etanol. Manter tudo tão estéril quanto possível para a totalidade do protocolo. Não corte os ossos sob condições não estéreis.
- Preparar as ferramentas de dissecação por imersão em etanol a 70% (um par de tesouras de dissecação, 2 pares de pinças), solução equilibrada de Hank sal com 5% de soro fetal de vitelo (HBSS-FCS), placas de Petri estéreis (100 mm x 15 mm), 1 seringas ml, 26½ agulhas de calibre, tubos de coleta cónicas (15 ml ou 50 ml), e toalhas de papel na BSC.
- Euthanize o mouse usandoprotocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da instituição. Trazer para o BSC, coloque no topo de uma ou duas toalhas de papel e pulverizar o mouse com 70% de etanol.
- No BSC, abrir uma placa de Petri estéril assepticamente, uma alíquota de 10 ml de HBSS-FCS para a base e 1 - 2 ml para a tampa.
- Posicione o mouse em seu estômago com a parte traseira voltada para cima e levantar a pele ao redor das seções torácicas com os dedos da mão não-dominante. Use a tesoura para fazer uma incisão onde a pele é levantada.
- Segure-se em ambas as extremidades do corte, uma extremidade com cada mão e cuidadosamente puxe a pele ao redor o mouse na parte de trás para o estômago, continue a puxar até duas extremidades da incisão se encontram no estômago.
- Virar o mouse para o estômago virado para cima e com uma mão puxar a metade inferior da pele para baixo em direção à perna, manter a puxar para trás a pele até que as pernas estão expostos.
- Segurar o pé do mouse para cima e cortar os tendões de Aquiles acima da articulação do tornozelo eos ligamentos que ligam os músculos de pé na extremidade inferior da tíbia com uma tesoura. Isto solta o pé dos ossos da perna.
- Mantendo-se a perna pelo pé, cortar os músculos e ligamentos com uma tesoura ao redor da articulação do joelho, na extremidade inferior do fémur para cortar os músculos da coxa a partir da parte inferior da perna. Use uma pinça para puxar delicadamente músculos soltos longe da fíbula e superfícies femoral. Tome cuidado para não cortar a artéria femoral para evitar sangramento intenso.
- Com uma mão segurando o pé, imprensa tesouras para baixo abertas na extremidade superior do fêmur na articulação do quadril, girar a perna e puxe para separar o fémur da articulação do quadril, enquanto usando a tesoura para fazer o corte final para livre da perna a partir do corpo.
- Deste ponto em diante, somente prender o tecido com uma pinça estéril. Segurar a perna em uma extremidade e retirar o pé do outro.
Nota: Isto não deve exigir muita força, como ligamentos de ligação são cortadas no passo1.9. Alternativamente, cortar a tibia logo acima do tornozelo, onde o osso é fundida. - Mantenha a perna pela extremidade distai do fémur, com um conjunto de pinças e extremidade proximal da tíbia e fíbula com outro, dobrar cuidadosamente a tíbia e o perónio na direcção oposta à da articulação do joelho a separá-los do fémur e patela.
- Use uma pinça para puxar para baixo os ligamentos remanescentes e os músculos ainda ligados aos ossos inferiores da perna. Aqui, remover o perónio, juntamente com os tecidos conjuntivos com uma pinça, uma vez que é demasiado pequeno para ser liberado por células de medula óssea. Coloque a tíbia feita na tampa invertida placa de Petri.
- Segurar a extremidade inferior do fémur com um conjunto de pinça e a patela com outro, dobrar a patela e tecidos circundantes na direcção oposta da articulação para a remoção. Em seguida, limpar restantes tecidos conjuntivos do fémur; puxando-os com uma pinça, e colocá-lo na tampa invertida placa de Petri. Descarte a patela.
- Repita 1,7- 1.13 com a outra perna se necessário. Transferir os ossos para 1,6 ml tubos de microcentrífuga estéril contendo 1 ml de HBSS-FCS para transporte, se necessário.
- Coloque ossos na tampa invertida placa de Petri, com 1 - 2 ml de HBSS-FCS, utilizar uma pinça para limpar qualquer tecido residual ainda ligado à tíbia e fémur, em seguida, transferir os ossos à base do prato de Petri contendo 10 ml de HBSS- FCS. Alternativamente, limpar os ossos e remover o tecido muscular anexado usando um 70% de etanol tecido encharcado.
- Corte cada um dos ossos ao meio com uma tesoura. Parcialmente proteger a placa de Petri com uma tampa estéril durante o corte para garantir que os ossos ficar no prato. Alternativamente, o corte do lado de cada osso para permitir a lavagem no passo seguinte.
- Fixe a 26½ agulha G para a seringa de 1 ml, e elaborar 1 ml HBSS-FCS a partir da placa de Petri. Inserir a ponta da agulha para dentro da extremidade de um pedaço de osso e lavar as células de medula óssea (tecido vermelho macio dentro dos ossos). Inserir a agulha na cabeçado osso e a extremidade aberta, até que toda a medula de cor vermelha é removido. Observe os ossos, como na cor branca.
- Passar quaisquer aglomerados visíveis de medula óssea através da seringa algumas vezes para formar uma suspensão de células individuais.
- Descarte os ossos coradas. Usar uma pipeta de 10 ml para misturar a suspensão de células bem e transferir para o tubo de recolha. Lavar a placa de Petri uma vez com 5 ml de HBSS-FCS para recolher as células residuais no prato. Coloque as células no gelo.
NOTA: A suspensão de células de medula óssea ainda é viável se for armazenado durante 2-3 h a 4 ° C.
2. Galvanização e Cultivo de Células de Medula Óssea (CMO)
- Prepare os seguintes reagentes e suprimentos.
- Preparar tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC), fazendo 0,84% de cloreto de amónio, em uma solução final de Tris 2 mM, pH 7,2, em seguida esterilizar por filtração através de um filtro de 0,2 mícron.
- Prepare meios BMC pela adição de 10% de FCS, HEPES 20 mM, 1x aminoácido não essencial, 55 & #181; M de 2-mercaptoetanol, 50 U / ml de penicilina e estreptomicina, piruvato de sódio 1 mM e 2 mM de L-glutamina em meio RPMI 1640.
- Obter disponível comercialmente recombinante de GM-CSF ou GM-CSF usar contendo o sobrenadante das células de mieloma Ag8.653 transfectadas com o gene de GM-CSF 20. Determinar a concentração de GM-CSF no sobrenadante por ELISA e adiciona o equivalente a 20 ng / ml para os meios de comunicação a BMC.
- Girar as células da medula óssea a 314 xg durante 5 min. O pellet é vermelho, devido à hemácias. No BSC, aspirar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur de vidro estéril ligada a vácuo de sucção, soltar o pellet tocando, em seguida, adicione 10 ml de tampão de lise RBC. Vortex para ressuspender as células e incuba-se em tampão de lise dos glóbulos vermelhos à temperatura ambiente durante 5 min.
- Adicionar 10 ml de HBSS-FCS então girar as células a 314 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado. Observe o pellet celular como cor branca. Ressuspender as células em volume desejado de meios BMC.
- Contar o resu-spended células utilizando um hemocitómetro após a coloração das células mortas com 0,4% de azul de tripano.
NOTA: Se a medula óssea a partir de uma perna (tíbia único e fémur) é utilizado, ressuspender em 5 ml de meio de BMC, tomar 10 ul de suspensão de células e diluir com 70 ul de 0,4% de azul tripano, misturar bem e transferir 10 ul de a diluição 1/8 de células para a câmara de hemocitómetro. Contar as células viáveis em quatro quadrantes: a média das quatro contagens quadrante x factor de diluição x 10 4 = número de células por ml. A fémur e uma tíbia de uma perna geralmente resultam em cerca de 2-4 x 10 7 células após RBC lise. - Estimar o número de pratos de 10 ml de culturas de medula óssea necessários para as experiências a jusante com base no número total de células necessárias para experiências no final da cultura.
NOTA: Cada prato requer 2 x 10 6 células da medula óssea na propagação inicial e rendimentos de 5 - 10 x 10 6 células no dia 7.- Todosquot o número total de células por plaqueamento em um novo tubo, girar a 314 xg durante 5 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 4 x 10 6 células / ml em meio de BMC.
- Prepara-se uma nova estéril 100 milímetros x 15 mm numa caixa de Petri com 9,5 ml de meio contendo 200 ng BMC de GM-CSF (recombinante ou de GM-CSF contendo sobrenadante). Adicionar 500 ul da / células da medula óssea ml 4 x 10 6 células para o centro do prato de Petri para a concentração final de 2 x 10 5 culas / ml em 10 ml.
NOTA: É importante a utilização de uma placa de Petri estéril e não um prato de cultura de tecidos. Além disso, ao adicionar as células, garantir células continuam concentradas no centro e minimizar a perturbação aos pratos após a semeadura e durante alterações na mídia. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2. Este é o dia 0 em cultura. - No dia 3, adicionar 10 mL de meio fresco contendo BMC de 200 ng de GM-CSF para cada placa de células. Tome cuidado para minimizar a perturbação of as células concentradas em suspensão. O volume total de cultura de células é agora de 20 ml.
- Observar as células ao microscópio óptico uma ampliação de 100X. Observar numerosas células não-aderentes (redondo) e algumas células aderentes (lisos). As células em grupos de três ou quatro pétalas que se assemelham de uma flor pode ser vista, indicando a proliferação.
- No dia 6 de realizar uma mudança metade meios. Remova cuidadosamente 10 ml de mídia em um tubo de 50 ml cônico estéril, girar a 314 g durante 5 min, aspirado e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de meio fresco contendo BMC 20 ng / ml de GM-CSF, suavemente vórtice e adicionar ao prato de cultura de células original para um volume total de 20 ml. Observar as células ao microscópio.
NOTA: Dia 7 cultura deve estar a 70% ou superior em confluência com células aderentes planas e nuvens densas de células não-aderentes redondos.
3. Recolha e Preparação BMDC e BMDMs para citometria de fluxo
- <li> Mantenha todos os buffers a 4 ° C.
- Colheita das células a partir de dia 7 ao dia 10. Para colher as células, em primeiro lugar a transferência de 10 ml do sobrenadante da cultura para um tubo de recolha cónico de 50 ml, em seguida, inclinar o prato verticalmente por aproximadamente 30 graus e lavar o prato pipetando os restantes 10 ml de cultura a partir do topo do prato. Repita esta lavagem 5 vezes, cada vez girar a placa em um terço.
- Transferir os restantes 10 ml de células para o mesmo tubo de recolha e descarte a placa e as células aderentes.
NOTA: As lavagens vai remover as células não-aderentes e fracamente aderentes; as células aderentes planas são resistentes às lavagens. Tipicamente, entre 5 - 10 x 10 6 células não-aderentes são esperados a partir de uma placa no dia sete e 2 - 5 x 10 6 células no dia 10, embora Lutz et ai. relatados 10 X 10 6 células no dia 10. As células aderentes não são normalmente tomadas. No entanto, se essas células devem ser comparadas com as células não-aderentes, Eles podem ser removidos como se segue. Adicionar 5 ml de EDTA 0,7 mM em PBS 1X, pH 7,4 para o prato após as células não-aderentes são removidas, incuba-se a 37 ° C durante 5 min, pipeta cima e para baixo para remover as células aderentes e recolher num tubo separado. - Girar as células coletadas em 314 g durante 5 minutos e aspirar o sobrenadante. Ressuspender em 5 ml de meio estéril BMC a 4 ° C, vortex suavemente para misturar, e contar usando o azul de tripano e um hemocitómetro.
NOTA: Cada prato irá dar origem a 5 - 10 x 10 6 células não aderentes a partir de uma cultura de 7 dias. A partir de agora, realizar todas as etapas, a 4 ° C. - Para a análise de citometria de fluxo, a transferência de 2 x 10 5 células por cada amostra em 5 mL de poliestireno tubos de fundo redondo, adicionar 300 mL de tampão de FACS a 4 ° C (1x salina tamponada com fosfato, EDTA a 2 mM e 2% de albumina de soro de bovino) a cada amostra.
- Girar para baixo células a 314 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado. Observar um sedimento visível branco, opaco nofundo do tubo.
- Ressuspender as células em 100 ul de receptor de Fc não marcado Ab para bloquear o receptor de Fc de ligação (10/01 Uso sobrenadante de 2.4G2 produzir a linha celular de mieloma) e incubar durante 20 min a 4 ° C. Em seguida adicionar 300 uL de tampão de SCAF a cada amostra, com cuidado vórtice, então girar para baixo as células a 314 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado.
- Ressuspender as células em 100 ul de CD11c-PeCy7 a 0,2 ug / ml, azul Gr1-Pacífico a 0,25 ug / ml, MHCII-APC em 0,05 ug / ml, e FL-HA em aproximadamente 2 ug / mL para identificar macrófagos e células dendríticas.
NOTA: FL-HA foi preparado em casa usando fluoresceína e sal de sódio ácido hialurônico galo pente como descrito anteriormente 21. - Incubar durante 20 min a 4 ° C para permitir a ligação à superfície da célula. Adicionar 300 ul de tampão de SCAF a cada amostra, com cuidado vórtice, então girar para baixo as células a 314 xg durante 5 minutos a 4 ° C e o sobrenadante aspirado. NOTA: Se biotinylated anticorpos são utilizados em 3,8, repetir 3,8-9 com estreptavidina fluorescente.
- Lavar as células com 300 uL de um outro tampão de SCAF, suavemente vortex para misturar e girar para baixo as células a 314 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 200 ul de tampão FACS contendo 0,1-0,2 ug por mL de iodeto de propídio ou DAPI para marcar as células não viáveis. As células estão prontas para análise por citometria de fluxo 22.
NOTA: Ver Resultados e Figura 3 para obter detalhes sobre as populações e como as células foram fechado.
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Representative Results
Um fluxograma que resume os passos principais deste método é apresentado na Figura 1. A densidade e morfologia da cultura de medula óssea em alturas diferentes da cultura são mostrados na Figura 2. No dia 1, as células são pequenos e escassas mas por dia 3, há mais células, algumas são maiores e alguns já começaram a aderir. Ao dia 6, há um aderente definitiva e a fracção não-aderente (Figura 2A). A cultura pode ser colhida a partir do dia 7-10, com uma percentagem mais elevada de CD11c + células presentes no dia 10. A Figura 2B mostra a cultura dia 7 antes da colheita, assim como as fracções de células aderentes e não aderentes separadas. A fracção aderente consiste nas células restantes depois as lavagens de luz que removem a fracção não-aderente. A fracção não-aderente é grandemente enriquecidas em células com uma morfologia dendrítica, que pode ser visto mais claramente na im digitalmente ampliadaidades nas inserções na figura 2B. Uma vez que a fracção não-aderente é removido (dia 7 ou dia 10), as células são analisadas por citometria de fluxo após marcação com anticorpos fluorescentes contra marcadores chave de superfície celular, tal como descrito acima. A Figura 3 mostra o fluxo representativo citometria parcelas do não-aderente fracção da cultura no dia 7 e no dia 10.
Para a identificação de ambos os macrófagos e células dendríticas, portão no CD11c + Gr1 e - células após a primeira gating em tamanho e as células vivas (Figura 3A e B). No dia 7 as culturas, a CD11c + Gr1 - população na fracção de células não-aderentes é tipicamente 60 a 70% de células vivas totais, e esta é aumentada para 90% ou mais no dia 10 (Figura 3B). O CD11c + Gr1 - população no dia 7 e no dia 10 pode ser dividido em três subconjuntos principais utilizando MHCII e FL-HA binding: ligação MHCII mid / low FL-HA altas macrófagos (P1), de ligação MHCII meados FL-HA células de baixa (P2) contendo DCs imaturas, e MHCII alta FL-HA ligação DCs baixos maduros (P3) (Figura 3C e referência 18 ). O FL-HA de baixo, MHCII baixo população (P0) observada no dia 7 foi demonstrado que contêm células progenitoras para as células P1-P3 18. Esta população não é evidente no dia 10 o que implica que uma maior maturação da cultura ocorreu. Isto também é suportado pela maior percentagem de células CD11c na cultura, bem como percentagens ligeiramente mais elevados de populações P2 e P3 DC no dia 10. A Figura 3D mostra MerTK, considerado como sendo um marcador de macrófagos, é altamente expresso em macrófagos e tanto populações DC imaturas (P1 e P2), mas é expressa em menor escala em DCs maduras (células P3). Notavelmente, a análise da fracção aderente revela a presença de P0, P1 epopulações de P2, mas não a população P3 DC maduras (dados não mostrados). Assim, os macrófagos estão presentes nas fracções aderentes e não aderentes, mas apenas DCs maduras estão presentes na fracção não-aderente.
. Figura 1: um fluxograma que indique as acções-chave do método primário células são colhidas da medula óssea, banhados e mantidas em cultura durante 7 - 10 dias em que são colhidas para uso em experimentos adicionais, purificados ou utilizados na análise de FACS. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O exame microscópico de GM-CSF derivados de células de medula óssea. A) a cultura de medula óssea no dia 1, 3, e 6, que mostra o aumento do número de células, alterações na morfologia, e aparecimento de fracções aderentes e não aderentes distintas. B) O painel esquerdo mostra a cultura de medula óssea dia 7 e a densidade celular típico. O painel do meio mostra a 7 dias células aderentes após a colheita da fracção não-aderente e o painel direito mostra a fracção não-aderente colhidos no dia 7. As inserções são digitalmente imagens ampliadas de células nesta fracção de morfologia dendrítica. A barra de escala branco representa 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fenótipo representativas da cultura de GM-CSF no dia 7 e no dia 10. não aderentesas células a partir da cultura são marcadas com CD11c, Gr1, MHCII, FL-HA, e MerTK no dia 7 ou no dia 10 e analisados para o seu fenótipo por citometria de fluxo. A) As células foram fechado pela primeira vez em tamanho, em seguida, células vivas. B) mostra um parcela das células fechado com CD11c e Gr1 (neutrófilos / marcador monócitos) e identifica o CD11c + Gr1 - população contendo os macrófagos e células dendríticas. Gating nesta população, C) mostra o gráfico de citometria de fluxo de MHCII e FL-HA de ligação, o que mostra a separação dos macrófagos alveolares-like (P1) a partir de DC imaturas (P2) e amadurecer DCs (P3), tal como descrito em Poon et al. 18. D) histogramas comparando expressão MerTK entre o P1 (macrófagos), P2 (DCs imaturas), e as populações P3 (amadurecer DCs) no dia 7 e no dia 10. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figuré.
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Discussion
Neste artigo, é proporcionado um método para a geração de macrófagos e células dendríticas derivadas de GM-CSF a partir de uma única cultura de medula óssea de ratinho que é adaptado de Lutz et ai. 6. Expressão MHCII e FL-HA distingue entre DC imaturas e macrófagos de ligação nesta cultura (ver Figura 3C), que anteriormente tem sido difícil. Isto, juntamente com outro relatório Helft et al. 19, demonstra a heterogeneidade dentro de GM-CSF induzidas culturas BMDC que foram previamente pensado para ser apenas DCs. Helft et al. 19 usado com bastante diferentes condições de cultivo para gerar BMDCs mas também encontrou uma população de macrófagos significativo. GM-CSF macrófagos induzidos assemelham macrófagos alveolares e GM-CSF DCs induzidas assemelham DC inflamatórias, enquanto que ligando FLT3 suplementado culturas BMDC produzir DCs clássicos e plasmocitoides 3,4. Diferentes populações DC e macrófagos também são observados em un vivoder condições homeostáticas e inflamatórias, e há muita discussão no campo, como o que define um DC e macrófagos 10. Isto é particularmente verdadeiro quando se trata de derivados de monócitos DCs inflamatórios e isso também é relevante neste BMC. Assim, é importante o uso de vários marcadores fenotípicos, dados funcionais e, possivelmente, dados de expressão gênica para caracterizar uma determinada população. É também possível que estas DC in vitro e macrófagos populações podem ser subdivididos como marcadores mais funcionais e fenotípicas são descobertos.
Neste método, o CD11c marcadores, Gr1, MHCII e FL-HA são usadas para distinguir macrófagos de células dendríticas imaturas e maduras na fracção não aderente da cultura BMC. Isso é diferente de Helft et al. 19, que usou o CD11c marcadores, CD11b, CD115, CD135, MerTK e MHCII para distinguir uma população de macrófagos de DCs maduras. Os níveis de expressão MerTK poderia distinguish entre macrófagos (P1) e amadurecer DCs (P3), mas não as DCs imaturas (P2) (Figura 3D). Assim FL-HA e MHCII são marcadores úteis para discriminar macrófagos de ambas as populações DC imaturos e maduros. Estes macrófagos também são funcionalmente distintos dos DCs nesta cultura CMO e isto é demonstrado em mais pormenor noutro local 18. Resumidamente, após a estimulação LPS os macrófagos BMC produzir citocinas diferentes do que DCs maduras e não ativar as células T naive 18. Estes macrófagos também se assemelham macrófagos alveolares, tanto fenotipicamente e funcionalmente como ambos se ligam FL-HA e expressar CD11c, MerTK, CD200R, CD206 e F4 / 80 e depois de LPS estimulação produzir TNF-α ainda não são capazes de ativar as células T naive 18. No entanto, também existem diferenças: os macrófagos são BMC CD11b + e têm níveis inferiores de Siglec F comparação com ex-vivo de macrófagos alveolares, sugerindo estas células são semelhantes, mas não identical para macrófagos alveolares.
Há vários passos importantes para garantir o sucesso deste protocolo. É importante manter a esterilidade de expor a medula óssea em diante. Ao mover-se dentro e fora do BSC, spray mãos e objetos com 70% de etanol enluvadas. Embora seja útil para lavar ferramentas em 70% de etanol para esterilizar, o etanol é tóxico para as células de medula óssea, para que o ar seque-as ferramentas e assegurar o etanol evaporou-se antes de levar ossos ou células em contacto com eles. Além disso, evitar o contato com tecidos ou células de rato com o equipamento ou as mãos não esterilizado durante a colheita de medula óssea. Apesar de penicilina e estreptomicina suplementação é fornecido na mídia, manuseio descuidado das células pode levar a levedura ou contaminação por fungos. Além disso, uma vez que as células imunes com actividade fagocítica são gerados nesta cultura, menor contaminação não pode ser detectado pela simples observação da cultura de células microscopicamente, assim que é importante para identificar tele assina de contaminação. Por exemplo, o número de células pode ser reduzida e a expressão dos marcadores de activação de células tais como CD40 e CD86 pode ser aumentada quando analisados por citometria de fluxo. cor Media também pode girar o amarelo refletindo uma alteração do pH devido à contaminação. Quando a contaminação ocorre, a cultura BMC é inutilizável. Para manter a consistência experimental, é importante para gerar uma suspensão de células isoladas a partir da medula óssea por agitação em vórtex e obter uma contagem de células precisas para configurar as culturas BMC. Além disso, se qualquer tecido conjuntivo a partir do osso acaba na suspensão de células individuais, filtrar através de um filtro de 70 micron estéril para removê-lo. Rendimentos celulares típicas para uma placa da fracção não-aderente no dia 7 estão entre 5 - 10 x 10 6 células. Os números de células são geralmente uma boa indicação de que o protocolo está a funcionar bem. Com este procedimento obtém-se geralmente entre 2 - 5 x 10 6 células no dia 10, enquanto que Lutz refere 10 X 10 6 células. Nós executamos RBC lise em the as células da medula óssea inicial Considerando que o protocolo por Lutz et al. não e assim que esta etapa pode ser opcional. Variações na percentagem de células CD11c, assim como os números e as proporções de macrófagos e células dendríticas pode surgir a partir de fontes diferentes ou de lotes de FCS e por isso é fundamental para testar novos lotes de FCS em culturas BMC para resultados experimentais consistentes. concentração de GM-CSF foi variada desde 5 ng / ml a 40 ng / ml e isto não afecta significativamente o rendimento celular. A densidade celular pode também influenciar a maturação da cultura. Por exemplo, Helft et ai. semeadas 1 x 10 7 células em 4 ml de meio que produziram uma maior percentagem de células com expressão elevada MHCII 19. O ponto de tempo quando as células são colhidas, também pode afectar a percentagem de populações presentes na fracção não-aderente. As células são normalmente coletadas entre os dias 7 - 10 25-27, mas alguns estudos recolher BMCs no dia 6 19,23,24. Se mais células são necessários, cultura BMCsem x 15 mm pratos maiores de Petri de 150 mm em 40 ml com a mesma densidade. Neste caso, a transformação meios metade do volume é feito tanto no dia 3 e no dia 6 (ou seja, 20 ml de meio removido, as células centrifugadas e substituídos com frescos 20 ml de meio suplementado com 20 ng / ml de rGM-CSF). Estas placas normalmente geram 3 - 6 x 10 7 células por prato no dia 7. FL-HA é um reagente importante, juntamente com MHCII, para distinguir os macrófagos de DCs imaturos e maduros na cultura BMC. Assim, uma vez que é feito, titula-se o FL-HA para uso em células que se sabe ligarem constitutivamente HA, tais como os macrófagos alveolares 18 ou de células BW5147 T e confirmar a sua especificidade utilizando quer um anticorpo CD44 HA-bloqueio (KM-81, disponível comercialmente), não marcado HA ou uma célula deficiente CD44. CD11c - Gr1 + células em cultura pode funcionar como um controlo interno para células não HA vinculativos, e uma fluorescência menos um controle (FMO) ou CD44 deficientes culturas BMC são altamente recomendados para settin precisasg da porta de ligação FL-HA.
Embora as experiências podem ser realizadas utilizando uma cultura heterogénea, é aconselhável para enriquecer para o CC ou a população de macrófagos usando activadas por fluorescência separação de células ou anticorpos esferas magnéticas revestidas 18 com base na expressão de CD11c, Gr1 ligação, MHCII, e HA. experimentos possíveis incluem a estimulação com agonistas do receptor de tipo Toll, tais como LPS para medir a activação e a produção de citoquinas, os ensaios de activação das células T, ou caracterização adicional por citometria de fluxo. Por exemplo, após 8 ou 24 h de estimulação, a citometria de fluxo pode ser usado para medir a coloração intracelular para citocinas e / ou a rotulagem de superfície de moléculas co-estimuladoras, tais como CD40 e CD86, tal como descrito em 18. procedimentos de rotulagem de citocinas intracelulares requerem pré-tratamento das células com Brefeldina A, que impede a secreção e permite que a citocina a acumular-se dentro da célula. Para os ensaios de activação de células T que envolvem a loading de um antígeno, como o peptídeo OVA por uma célula apresentadora de antígeno, os macrófagos purificados com base em MHCII e HA ligação não vai ativar as células T, enquanto imaturos e maduros DCS 18. Deve notar-se que o processo de triagem por si só pode activar as células dendríticas, em certa medida, tornando-se importante para incluir controlos negativos em todas as experiências.
Como acontece com qualquer processo in vitro, há vantagens e desvantagens em relação ao uso em células in vivo ou ex-vivo. A desvantagem é que, em células in vitro derivada pode não em células in vivo exactamente imitam mas têm a vantagem de que eles podem ser gerados em números suficientes para permitir a análise funcional e bioquímica, algo que muitas vezes não é possível com células ex-vivo. Este método de macrófagos e identificação DC permitirá que futuras pesquisas para obter populações de células mais homogéneos de uma cultura com hetero anteriormente underappreciatedgeneidade. Como macrófagos purificado a partir desta cultura de GM-CSF assemelham macrófagos alveolares do pulmão de 18, que proporciona uma fonte conveniente de macrófagos alveolares do tipo para análise in vitro. Por exemplo, estes macrófagos ligação a HA pode ser utilizada para o rastreio de fármacos que alteram a função de macrófagos alveolares e investigar os mecanismos de infecção por Mycobacterium tuberculosis e resistência. Dada a recente descoberta de que a GM-CSF e transplante de macrófagos derivados de medula óssea de M-CSF pode aliviar proteinose pulmonar em ratinhos 28,29, este método para identificar macrófagos a partir de culturas de GM-CSF pode ajudar a aumentar a eficácia desta terapia proposta.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) (Grant MOP-119503) e do Conselho Ciências e Engenharia Natural do Canadá (NSERC). NSERC também apoiou studentships de verão para YD e AA YD é apoiado pela Universidade de British Columbia (UBC), com uma bolsa de estudos de 4 anos, AA é suportado por CIHR com a atribuição de um estudante de graduação do Master (CGS-M). Agradecemos Calvin Roskelley para assistência com o microscópio usado para gerar as imagens na Figura 2. Também reconhecemos o apoio dos animais e citometria de fluxo Instalações UBC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
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