Abstract
Макрофаги и дендритные клетки (ДК) являются врожденные иммунные клетки, которые находятся в тканях и органах лимфоидных, которые играют ключевую роль в защите от патогенных микроорганизмов. Тем не менее, их трудно выделить в достаточном количестве , чтобы изучить их подробно, поэтому, модели в пробирке, были разработаны. В пробирке культуры из костного мозга макрофаги и дендритные клетки являются хорошо зарекомендовавшие и ценные методы иммунологических исследований. Здесь описан способ культивирования и идентификации как ДТС и макрофаги от одной культуры клеток костного мозга первичной кости мыши с использованием колониестимулирующий фактор макрофагов гранулоцитов цитокина (GM-CSF) описывается. Этот протокол основан на установленном порядке первой разработанной Лутц и др. в 1999 году из костного мозга РС. Культура неоднородна, и MHCII и fluoresceinated гиалуронана (FL-HA) используются для различения макрофаги от незрелых и зрелых ДК. Эти GM-CSF, полученный макрофаги просмотри удобный источник в пробирке полученных макрофагов , которые близко напоминают альвеолярные макрофаги в обоих фенотипа и функции.
Introduction
Существует несколько методов культурах клеток, были описаны для генерации из костного мозга макрофаги (BMDMs) и из костного мозга (DCS BMDCs) с использованием одного или комбинации факторов роста. BMDMs могут быть получены путем культивирования клеток костного мозга с использованием либо макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) или GM-CSF 1,2. Для BMDCs, добавление лиганда FLT3 к культуре костного мозга приводит к неприлипающими классических и плазмоцитов ГЦ (CD11c высокий / MHCII высокий и CD11c Lo, B220 + соответственно) через 9 дней в культуре 3,4. В отличие от этого , не прилипшие клетки генерироваться после 7 до 10 дней в культуре с использованием только GM-CSF 5,6, GM-CSF , и IL-4 , 7, или GM-CSF , и FLT3 лиганд 8,9 генерировать BMDCs более близко напоминающих воспалительные DCs (CD11c высокий, высокий MHCII CD11b +) 10. В то время как эти культуры в пробирке используются для создания макрофаги илиКонтроллеры домена, неясно, если каждая культура порождает чистых популяций. Например, хотя прилипшие клетки в GM-CSF культур описаны как макрофаги 5, неадгезивные клетки из той же самой культуры используются в качестве контроллеров домена 6,11-13, с предположения , что они являются однородными и любых наблюдаемых изменчивость из - за различных этапах развития 14,15. Кроме того, исследования показали , GM-CSF , чтобы стать существенным фактором роста для развития альвеолярных макрофагов в естественных условиях 16,17, и может быть использовано в пробирке для генерации альвеолярных типа макрофаги 16,17,18.
Кроме соблюдения, процедуры генерации макрофаги и контроллеры домена с GM-CSF, обработанных культурах костного мозга очень похожи предполагает гетерогенность может существовать в GM-CSF культурах костного мозга. Это на самом деле, кажется, так, как две газеты сообщают о присутствии BMDMs в неприлипающими фракции BMDC культур. В одном документе, они Опознавательнаяред популяция клеток как CD11c +, CD11b +, MHCII середине, MerTK + и CD115 +, выразившего экспрессии генов подписи , который наиболее близко напоминающее альвеолярные макрофаги и имели пониженную способность активировать Т - клетки 19. Второй документ используется MHCII и FL-HA для идентификации альвеолярного макрофага типа населения (CD11c +, MHCII средний / низкий, FL-HA высокий) , который был отличен от незрелых (CD11c +, MHCII середина, FL-HA низкий) и пожилые РС (CD11c +, MHCII высокий), как фенотипически и функционально 18. Эти документы показывают, что оба GM-CSF BMDC культуры являются гетерогенными, содержащие как макрофаги и популяции DC, указывающего, что следует проявлять осторожность при интерпретации данных из BMDC культур.
Этот протокол описывает, как изолировать костный мозг, клетки мозга кости в культуре GM-CSF, а также определить альвеолярного микрофагоподобныхнаселение от незрелых и зрелых ДК в культуре костного мозга с помощью проточной цитометрии с использованием связывания и экспрессию MHCII FL-HA. Эта процедура основана на установленном порядке Лутц и др 6 и способен генерировать . 5 - 10 х 10 6 неприкрепленных клеток на 7 -й день в 10 мл культуры. Культура может использоваться от 7 дней до 10 и дает гетерогенную популяцию макрофагов, незрелых и зрелых ДК, а также некоторых клеток - предшественников на 7. Это обеспечивает простой способ , чтобы расти и изолировать в пробирке альвеолярно-как макрофаги в больших количествах день.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мыши были умерщвлены в соответствии с Канадским советом по руководящим принципам ухода за животными для этических исследований животных по методикам, утвержденным в Университете Британской Колумбии Animal Care комитета.
1. Получение единственной клетки костного мозга мышей от подвески бедром и голенью
- Включите шкаф биологической безопасности (BSC) 15 мин до начала процедуры, чтобы очистить воздух кабинета и позволяют для стабилизации потока воздуха, затем чистой / спрей BSC поверхность с 70% -ным этанолом. Держите все как стерильные, насколько это возможно для полноты протокола. Не режьте кости в нестерильных условиях.
- Подготовка рассечение инструментов путем замачивания в 70% этаноле (1 пара рассечение ножницами, 2 пары щипцов), Хэнка сбалансированный солевой раствор с 5% эмбриональной телячьей сыворотки (HBSS-FCS), стерильные чашки Петри (100 мм х 15 мм), 1 шприцы мл, 26½ калиброванными иглами, конические пробирки для сбора (15 мл или 50 мл), и бумажные полотенца в BSC.
- Эвтаназии мышь с помощьюпротоколы, утвержденные комитетом по этике исследований на животных учреждения. Привести в BSC, место на вершине одного или двух бумажных полотенец и распылить мышь с 70% этанола.
- В BSC, открыть стерильную чашку Петри в асептических, аликвоту 10 мл HBSS-FCS к основанию и 1 - 2 мл на крышке.
- Поместите мышь на животе с задней стороной вверх и поднимите кожу вокруг грудных участков с пальцами не доминантной рукой. Используйте ножницы, чтобы сделать надрез, где поднятый кожа.
- Держись к обоим концам разреза, один конец с каждой стороны и аккуратно растащить кожу вокруг мыши со спины на живот, продолжайте тянуть до двух концах разреза встречаются в желудке.
- Переверните мышь к животу лицевой стороной вверх и с одной стороны тянут нижнюю половину кожи вниз к ноге, продолжайте отходили кожу, пока ноги не подвергаются.
- Держите ногу мыши вверх и вырезать ахиллова сухожилия выше голеностопного сустава исвязки, соединяющие мышцы ног в нижней части большеберцовой кости с помощью ножниц. Это ослабляет ногу от костей ног.
- Удерживая ногу на ногу, сократить мышцы и связки ножницами вокруг коленного сустава у нижнего конца бедренной кости, чтобы разъединить мышцы бедра из нижней части ноги. Используйте пинцет, чтобы аккуратно потянуть ослабленные мышцы от малоберцовой кости и бедренной кости поверхностей. Будьте осторожны, чтобы не перерезать бедренную артерию, чтобы избежать сильного кровотечения.
- С одной стороны, держась за ногу, надавите открытые ножницы в верхней части бедренной кости в тазобедренном суставе, повернуть ногу и осторожно потяните, чтобы отделить бедро от тазобедренного сустава при использовании ножниц, чтобы сделать окончательный разрез на бесплатной нога от тела.
- С этого момента, только держать ткани с стерильным пинцетом. Держись к ноге на одном конце и снять ногу с другой.
Примечание: Это не должно требовать больших усилий, так как соединительные связки нарезают на этапе1.9. В качестве альтернативы, сократить берцовую кость чуть выше лодыжки, где слит кость. - Удерживая ногу дистального конца бедренной кости с одним набором щипцов и проксимального конца большеберцовой и малоберцовой костей с другой, осторожно согнуть большеберцовой и малоберцовой костей в противоположном направлении коленного сустава, чтобы отделить их от бедренной кости и коленной чашечки.
- Используйте пинцет, чтобы тянуть вниз остальные связки и мышцы все еще прикрепленные к костей голени. Здесь, удалите малоберцовой кости вместе с соединительной ткани с щипцами, как он слишком мал, чтобы быть промыты в клетках костного мозга. Положите вымытую большеберцовой кости на перевернутой чашки Петри крышкой.
- Держите нижний конец бедренной кости с одним набором щипцов и коленной чашечки с другой, согнуть надколенника и окружающие ткани в направлении, противоположном направлению соединения для удаления. Затем счистить оставшиеся соединительные ткани от бедренной кости; потянув их прочь с пинцета, и поместить его на перевернутую чашку Петри крышкой. Откажитесь коленной чашечки.
- Повторите 1.7- 1.13 с другой ногой, если это необходимо. Перенесите кости до 1,6 мл микроцентрифужных пробирки, содержащие 1 мл стерильной HBSS-FCS для транспортировки в случае необходимости.
- Поместите кости на перевернутой чашки Петри, крышки, с 1 - 2 мл HBSS-FCS, использование щипцов для очистки любых остатков ткани все еще прикрепленные к большеберцовой и бедренной кости, а затем перенести кости к основанию чашки Петри, содержащую 10 мл HBSS- FCS. В качестве альтернативы, очистить кости и удалить прикрепленный мышечную ткань, используя 70% -ный этанол пропитанной ткани.
- Разрежьте каждый из костей пополам с помощью ножниц. Частично щит чашку Петри со стерильной крышкой во время резки, чтобы обеспечить кости остаются в блюде. В качестве альтернативы, отрезать конец каждой кости, чтобы позволить промывку в следующем шаге.
- Прикрепите 26½ G иглу на 1 мл шприца, и составлять 1 мл HBSS-FCS из чашки Петри. Вставьте кончик иглы в конце костной части и вымывать клетки костного мозга (мягкая красная ткань внутри костей). Вставьте иглу в головкукости и открытым концом, пока весь красный цвет мозг не будет удален. Обратите внимание на кости, как белый цвет.
- Передавать любые видимые сгустки костного мозга через шприц несколько раз, чтобы сформировать одноклеточной суспензии.
- Откажитесь промытой кости. С помощью 10 мл пипетки для смешивания суспензии клеток хорошо и передать в пробирку. Ополосните чашку Петри один раз 5 мл HBSS-FCS для сбора остаточных клеток в чашке. Поместите клетки на льду.
Примечание: Суспензию клеток костного мозга все еще жизнеспособна , при хранении в течение 2 - 3 ч при температуре 4 ° С.
2. Покрытие и Культивирование клеток костного мозга (контроллеров BMC)
- Подготовьте следующие реагенты и расходные материалы.
- Подготовка красных кровяных клеток (эритроцитов) буфера для лизиса путем 0,84% хлорида аммония в конечном растворе 2 мМ Трис, рН 7,2, а затем стерилизуют фильтрацией через фильтр 0,2 мкм.
- Подготовка контроллера ВМС носитель путем добавления 10% FCS, 20 мМ HEPES, 1x заменимая аминокислота, 55 & #181; М 2-меркаптоэтанола, 50 ед / мл пенициллина и стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, и 2 мМ L-глутамина в RPMI среде 1640.
- Получают коммерчески доступный рекомбинантный GM-CSF или используют GM-CSF , содержащий супернатант из Ag8.653 клеток миеломы , трансфицированных геном GM-CSF 20. Определить концентрацию GM-CSF в супернатанте с помощью ELISA и добавляют эквивалент 20 нг / мл в средствах массовой информации BMC.
- Спин вниз клеток костного мозга при 314 мкг в течение 5 мин. Осадок красного цвета, из-за эритроцитах. В BSC, аспирация супернатант, используя стерильную стеклянную пипетку Пастера, прикрепленную к вакуумного отсоса, ослабьте осадок, нажав, а затем добавляют 10 мл буфера для лизиса эритроцитов. Вихревой для ресуспендирования клеток и инкубировать в буфере для лизиса эритроцитов при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавьте 10 мл HBSS-FCS затем оплетают клетки при 314 мкг в течение 5 мин и аспирата супернатант. Обратите внимание на клеточный осадок в виде белого цвета. Ресуспендируют клетки в желаемом объеме БМК сред.
- Подсчитайте RESUтовар.Обращайте-клетки с помощью гемоцитометра после окрашивания отмершие клетки с 0,4% трипановым синим.
Примечание: Если костный мозг от одной ноге (одиночный большеберцовой кости и бедренной кости) используется, ресуспендируют в 5 мл БМК сред, принимают по 10 мкл клеточной суспензии и развести его с 70 мкл 0,4% трипанового синего, хорошо перемешать и передать 10 мкл 1/8 ячейки разбавления в камере гемоцитометра. Количество жизнеспособных клеток в четырех квадрантах: среднее из четырех отсчетов квадранте х коэффициент разбавления х 10 4 = количество клеток на мл. Бедренной кости и большеберцовой кости с одной ноги, как правило , получается примерно 2 - 4 × 10 7 клеток после лизиса эритроцитов. - Оценить количество 10 мл блюд культур костного мозга, необходимых для последующих экспериментов, основанных на количестве общего числа клеток, необходимых для проведения экспериментов в конце культуры.
Примечание: Каждое блюдо требует 2 × 10 6 клеток костного мозга при первичном посеве и урожайность 5 - 10 × 10 6 клеток на 7 -й день.- АлиQuot общее количество клеток для металлизации в новую пробирку, спином вниз на 314 мкг в течение 5 мин, аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в 4 - х 10 6 клеток / мл в средах ВМС.
- Подготовьте новый стерильный 100 мм х 15 мм чашки Петри с 9,5 мл БМК среде, содержащей 200 нг GM-CSF (рекомбинантный или из GM-CSF, содержащего супернатант). Добавьте 500 мкл 4 × 10 6 клеток / клеток костного мозга мл в центр чашки Петри для конечной концентрации 2 × 10 5 клеток / мл в 10 мл.
Примечание: Важно использовать стерильную чашку Петри а не блюдо культуры ткани. Кроме того, при добавлении клеток, обеспечить клетки остаются сосредоточены в центре и свести к минимуму помехи для блюд после посева и во время смены носителя. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO 2. Это день 0 в культуре. - На 3-й день, добавляют 10 мл свежей среды, содержащей ВМС 200 нг GM-CSF, в каждую чашку клеток. Позаботьтесь, чтобы свести к минимуму воздействие Oе клеток, сосредоточенных в суспензии. Общий объем клеточной культуры в настоящее время в 20 мл.
- Заметим клетки под световым микроскопом при 100-кратном увеличении. Заметим, многочисленные, не прилипшие клетки (круглый) и несколько прилипших клеток (плоские). Клетки в группах из трех или четырех, напоминающих лепестки цветка можно увидеть, что указывает на пролиферацию.
- На 6-й день выполнить половину смены носителя. Осторожно удалите 10 мл среды в стерильный 50 мл коническую пробирку, спином вниз на 314 мкг в течение 5 мин, аспирация и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл свежей среды, содержащей ВМС 20 нг / мл GM-CSF, мягко вихрем и добавить к исходной клеточной культуры блюдо для общим объемом 20 мл. Обратите внимание клетки под микроскопом.
Примечание: День 7 культура должна быть на уровне 70% или больше , в сплошности с присоединенными плоскими клетками и плотных облаков круглых неслипшихс клеток.
3. Сбор и подготовка BMDC и BMDMs для проточной цитометрии
- <li> Храните все буферы при 4 ° С.
- Сбора клеток с 7-го дня до 10-й день Для сбора клеток сначала перенесите 10 мл надосадочной жидкости культуры в 50 мл коническую пробирку, а затем наклонить антенну вертикально примерно на 30 градусов и мыть посуду с помощью пипетки оставшиеся 10 мл культуры от верхней части блюда. Повторите этой промывки 5 раз, каждый раз поворачивая блюдо на одну треть.
- Перенесите оставшиеся 10 мл клеток в той же пробирку для сбора и выбросить тарелку и прилипшие клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки удалит неадгезированных и свободно прилипшие клетки; плоские прилипшие клетки устойчивы к стирок. Как правило, между 5 - 10 х 10 6 , не прилипшие клетки , как ожидается , с одной пластины на 7 -й день и 2 - 5 х 10 6 клеток на 10 -й день, хотя Лутц и др. сообщили 10 × 10 6 клеток на 10 -й день Адгезивные клетки обычно не принимаются. Однако, если эти клетки должны быть по сравнению с неприлипающими клеток, Они могут быть удалены следующим образом. Добавляют 5 мл 0,7 мМ ЭДТА в 1X PBS, рН 7,4 в чашке после неадгезивные клетки удаляются, инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин, пипеткой вверх и вниз, чтобы удалить прилипшие клетки и собирают в отдельную пробирку. - Спин вниз собранные клетки при 314 мкг в течение 5 мин и аспирата супернатант. Ресуспендируют в 5 мл стерильной БМК среде при температуре 4 ° С, вихревое осторожно перемешать, и рассчитывать с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
Примечание: Каждое блюдо даст 5 - 10 х 10 6 неприкрепленных клеток из культуры , 7 -й день. С этого момента, выполнять все действия при 4 ° С. - Для анализа методом проточной цитометрии, передачи 2 × 10 5 клеток для каждого образца в 5 мл полистирола с круглым дном пробирки, добавляют 300 мкл буфера FACS при температуре 4 ° С (1х забуференный фосфатом физиологический раствор, 2 мМ ЭДТА и 2% бычий сывороточный альбумин) в каждой образец.
- Спин клетки вниз на 314 мкг в течение 5 мин и аспирата супернатант. Обратите внимание видимый белый, непрозрачный осадок в тоДно трубки.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл немеченого рецептора Fc-Ab блокировать рецептор Fc связывания (Use 1/10 супернатант из 2.4G2 продуцирующей клетки миеломной линии) и инкубируют в течение 20 мин при 4 ° C. Затем добавляют 300 мкл буфера FACS для каждого образца, осторожно вихревым, затем оплетают клетки вниз на 314 мкг в течение 5 мин и аспирата супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл CD11c-PeCy7 при 0,2 мкг / мл, Gr1-Pacific Blue при 0,25 мкг / мл, MHCII-АРС в количестве 0,05 мкг / мл, и FL-HA приблизительно 2 мкг / мл для идентификации макрофаги и ДКБ.
Примечание: FL-HA был подготовлен в доме с использованием флуоресцеин и петушиных гребней натриевую соль гиалуроновой кислоты , как описано выше 21. - Инкубировать в течение 20 мин при 4 ° С для обеспечения связывания с клеточной поверхностью. Добавьте 300 мкл буфера FACS для каждого образца, мягко вихрь, затем оплетают клетки вниз на 314 мкг в течение 5 минут при 4 ° С и аспирата супернатант Примечание:. Если биоtinylated антитела используются в 3.8, 3.8 повторить - 9 с люминесцентными-стрептавидина.
- Промыть клетки с еще 300 мкл буфера FACS, осторожно перемешать вихре и спином вниз клетки при 314 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и клетки вновь суспендируют в 200 мкл FACS буфера, содержащего 0,1 - 0,2 мкг на мл пропидийиодидом или DAPI для обозначения нежизнеспособные клетки. Клетки теперь готовы для анализа 22 проточной цитометрии.
ПРИМЕЧАНИЕ: См Результаты и Рисунок 3 Подробную информацию о популяциях и как были закрытого типа клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Блок - схема кратко описываются основные этапы этого способа показана на рисунке 1. Плотность и морфологию культуры костного мозга в разное время культивирования показаны на рисунке 2. В 1 -й день, клетки маленькие и редкие , но с 3 -й день, есть больше клеток, некоторые из них больше, и некоторые из них уже начали придерживаться. К 6 -й день существует определенная приверженцем и не приверженец фракция (рис 2А). Культура может быть собран с первого дня 7 - 10 с более высоким процентом CD11c + клеток , присутствующих в день 10. Рисунок 2B показывает культуру 7 -й день до сбора урожая, а также отделенных прилипшие и неадгезированных фракции клеток. Приверженец фракция состоит из клеток, оставшихся после легких стирок, которые удаляют неприлипающими фракции. Неадгезивные фракция сильно обогащена клеток с дендритной морфологии, которые могут быть более четко видны в цифровом виде увеличенных имвозраст в вставках на рисунке 2B. После того , как не прилегающего фракция удаляется (день 7 или 10 день), клетки анализировали с помощью проточной цитометрии после мечения с флуоресцентными антителами против ключевых маркеров клеточной поверхности, как описано выше. Рисунок 3 показывает репрезентативную проточной цитометрии участков неадгезивные доля культуры в 7-й день и 10-й день.
Для идентификации обоих макрофагов и ДК, ворота на CD11c + и Gr1 - клетки после первого стробирования по размеру и живых клеток (рис 3А и В). В день 7 культурах, CD11c + Gr1 - население во фракции не прилипших клеток , как правило , от 60 до 70% от общего числа живых клеток, и это увеличивается до 90% или более на 10 -й день (рис 3б). CD11c + Gr1 - население в 7 -й день и 10 -й день можно разделить на три основных подмножеств с использованием MHCII и FL-HA биндинг: MHCII средний / низкий FL-HA связующем макрофаги (P1), MHCII середины FL-HA связывания низкие (P2) клетки , содержащие незрелые контроллеры домена, и MHCII высокой FL-HA связывания низкой зрелых DCs (P3) (рис 3C и ссылки 18 ). FL-HA низкий, низкий MHCII популяции (Р0) , наблюдаемые в 7 -й день было показано, содержат клетки - предшественники для клеток P1-P3 18. Это население не бросается в глаза на 10-й день подразумевая, что дальнейшее созревание культуры произошло. Это также поддерживается больший процент CD11c клеток в культуре, а также несколько более высокий процент населения P2 и P3 постоянного тока в день 10. Рисунок 3D показывает MerTK, который считается Фагоцит маркером, высоко экспрессируется как на макрофагах и популяции незрелых DC (P1 и P2), но выражается в меньшей степени, на зрелых DCs (P3 клетки). В частности, анализ показывает, прилегающего фракции присутствие P0, P1 иP2 популяции, но не население P3 зрелые DC (данные не показаны). Таким образом, макрофаги присутствуют в адгезивных и неприлипающими фракций, но только зрелые ДК присутствуют в неприлипающими фракции.
. Рисунок 1: Диаграмма последовательности операций , обозначающая ключевых шагов первичного способа клетки собирают из костного мозга, высевают и выдерживают в культуре в течение 7 - 10 дней , когда они собирают для использования в дальнейших экспериментах, очищенных или используемых при анализе FACS. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: микроскопическое исследование GM-CSF производный клеток костного мозга. А) культуру костного мозга в 1-й день, 3 и 6, показывающий увеличение количества клеток, изменения в морфологии, и появление различных адгезивных и неприлипающими фракций. B) Левая панель показывает 7 -й день культуры костного мозга и типичную плотность клеток. Средняя панель показывает день 7 прилипшие клетки после сбора урожая в неприлипающими фракции и правой панели показывает неприлипающими фракцию собирают в день 7. вставках в цифровом виде увеличенных изображений клеток в этой фракции с дендритной морфологии. Белая шкала полоса представляет 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель фенотип GM-CSF культуры на 7 -й день и 10 день неприлипающимиКлетки из культуры помечены CD11c, Gr1, MHCII, ФЛ-HA, и MerTK на 7 -й день или 10 -й день и анализируют на их фенотипа с помощью проточной цитометрии. A) Сначала клетки закрытого типа от размера затем живые клетки. Б) показывает участок огороженных клеток с CD11c и Gr1 (нейтрофилами / моноцитов маркера) и идентифицирует CD11c + gr1 - популяции , содержащей макрофаги и дендритные клетки. Gating на этой популяции, C) показывает цитометрии участок MHCII и FL-HA связывания, который показывает разделение альвеолярного типа макрофагов (P1) из незрелых ДК (P2) и зрелые РС (Р3), как описано в Пун и др. 18. D) гистограмм , сравнивающих выражение MerTK между P1 (макрофаги), P2 (незрелые DCS) и популяции P3 (зрелые РС) на 7 -й день и день 10. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого FIGUчисло рейнольдса
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи, мы предлагаем способ генерирования GM-CSF , полученных макрофаги и контроллеры домена от одной мыши костного мозга культуры , который заимствован из Лутц и др. 6. Выражение MHCII и FL-HA связывание между незрелых отличает ДК и макрофагов в этой культуре (см Рисунок 3C), который ранее уже был трудным. Это, вместе с другим докладом Helft и др. 19, демонстрирует гетерогенность в GM-CSF индуцированных культур BMDC , которые ранее считались быть только контроллеры домена. Helft и др. 19 использовали совершенно разные условия культивирования для создания BMDCs пока также обнаружили значительное население макрофагами. GM-CSF , индуцированные макрофаги напоминают альвеолярных макрофагах и GM-CSF , индуцированные ДК напоминают воспалительные контроллеры домена, в то время как FLT3 лиганд , дополненной BMDC культуры производят классические и плазмоцитов контроллеры домена 3,4. Различные популяции DC и макрофагов также наблюдаются в естественных условиях ООНдер гомеостатических и воспалительных состояний, и есть много дискуссий в области относительно того , что определяет DC и макрофаги 10. Это особенно верно, когда речь идет о моноцитов полученных воспалительных ГЦ, и это также актуально в этом БМК. Таким образом, важно использовать несколько фенотипических маркеров, функциональные данные, и, возможно, данные экспрессии генов для характеристики конкретной популяции. Также возможно , что эти ин витро популяции DC и макрофаги могут быть дополнительно подразделены , как более функциональных и фенотипических маркеров обнаружены.
В этом методе, маркеры CD11c, Gr1, MHCII и FL-HA используются для различения макрофагами от незрелых и зрелых дендритных клеток в неприлипающими фракции культуры БМК. Это отличается от Helft и др. 19, которые использовали маркеры CD11c, CD11b, CD115, CD135, MerTK и MHCII отличить популяцию макрофагов от зрелых ДК. Уровни экспрессии MerTK может distinguisч между макрофагами (Р1) и зрелые DCs (Р3), но не незрелые РС (P2) (рис. 3D) Таким образом, FL-HA и MHCII являются полезными маркерами для различения макрофаги от обоих незрелых и зрелых популяций DC. Эти макрофаги также функционально отличаются от контроллеров домена в этой культуре , и это БМК демонстрируется более подробно в другом месте 18. Если коротко, то после стимуляции LPS макрофаги БМК производят различные цитокины , чем зрелые DCs и не активируют наивных Т - клеток 18. Эти макрофаги также близко напоминают альвеолярных макрофагах, как фенотипически и функционально и как связывания FL-HA и выразить CD11c, MerTK, CD200R, CD206 и F4 / 80 и после стимуляции LPS продукции TNF-α пока не могут активировать наивные Т - клетки 18. Тем не менее, есть и отличия: макрофаги BMC являются CD11b + и имеют более низкие уровни сиглек F по сравнению с экс-естественных условиях альвеолярных макрофагах, предполагая , эти клетки похожи , но не идентифицированыкал для альвеолярных макрофагов.
Есть несколько важных шагов, чтобы обеспечить успех этого протокола. Важно, чтобы поддерживать стерильность от воздействия на костный мозг и далее. При перемещении в и из КБС, распылять руки в перчатках и объекты с 70% этанола. Несмотря на то, что полезно ополаскивать инструменты в 70% этаноле, чтобы простерилизовать, этанол является токсичным для клеток костного мозга, поэтому Высушите инструменты и обеспечить этанол испарится прежде, чем принести кости или клетки в контакте с ними. Кроме того, избегайте контакта тканей мыши или клеток с нестерильным оборудованием или рук во время сбора костного мозга. Хотя пенициллин и стрептомицин добавок обеспечивается в средствах массовой информации, неосторожное обращение клеток может привести к дрожжам или грибкового заражения. Кроме того, так как иммунные клетки с фагоцитарной активности генерируются в этой культуре, незначительное загрязнение может быть не обнаружен, просто наблюдая культуры клеток микроскопически, таким образом, является важным, чтобы определить тон подписывает загрязнения. Например, число клеток, может быть уменьшено, и экспрессия маркеров активации клеток, таких как CD40 и CD86, могут быть увеличены при анализе с помощью проточной цитометрии. Медиа цвет может также желтеют отражает изменение рН из-за загрязнения. Когда происходит заражение, культура BMC является непригодным для использования. Для поддержания экспериментальной последовательности, важно, чтобы создать клеточную суспензию из костного мозга путем встряхивания и получения точного количества клеток для установки культур контроллера ВМС. Кроме того, если какой-либо соединительной ткани от кости заканчивается в одной клеточной суспензии, фильтруют через стерильный фильтр 70 микрон, чтобы удалить его. Типичные выходы сотой для одной пластины не прилипших фракции в количестве 7 -й день составляет от 5 - 10 х 10 6 клеток. Число клеток, как правило, является хорошим показателем, что протокол работает хорошо. С помощью этой процедуры мы обычно получаем от 2 - 5 × 10 6 клеток на 10 -й день, в то время как Lutz сообщает 10 × 10 6 клеток. Мы проводим РБК лизис на гое клетки костного мозга начальная в то время как протокол по Лутц и др. не так и этот шаг может быть необязательным. Изменения в процентах CD11c клеток, а также цифры и пропорции макрофагов и ДК могут возникать из различных источников или партий FCS и поэтому очень важно, чтобы испытать новые партии FCS на BMC культур для последовательных экспериментальных результатов. концентрация GM-CSF варьировалось от 5 нг / мл до 40 нг / мл, и это существенно не влияет на выход клеток. Плотность клеток может также влиять на созревание культуры. Например, Helft и др. высевают 1 × 10 7 клеток в 4 мл среды , которые произвели больший процент клеток с высокой экспрессии MHCII 19. Момент времени, когда собирают клетки могут также влиять на процент населения, присутствующих в неприлипающими фракции. Клетки обычно собирают между днями 7 - 10 25-27, но некоторые исследования собирают на 6 контроллеров BMC день 19,23,24. Если больше клеток необходимы, культуры контроллеров BMCв больших х 15 мм чашках Петри 150 мм в 40 мл при той же плотности. В этом случае изменение половины объема средств массовой информации производится на обоих 3 -й день и день 6 (то есть, 20 мл среды удалены, клетки осаждали центрифугированием и заменяли свежей 20 мл среды , дополненной 20 нг / мл RGM-CSF). Эти пластины обычно генерируют 3 - 6 х 10 7 клеток на блюдо в день 7. FL-HA является важным реагентом, вместе с MHCII, чтобы отличить макрофаги от незрелых и зрелых ДК в культуре BMC. Таким образом , как только это сделано, титровать FL-HA для использования на клетках , известных конститутивно связываться HA , такие как альвеолярные макрофаги 18 или BW5147 Т - клеток и подтвердить свою специфичность с использованием либо HA-блокирующий CD44 антитело (КМ-81, имеющийся в продаже), непомеченная HA или дефицитных клеток CD44. CD11c - Ш1 + клеток в культуре может функционировать в качестве внутреннего контроля для лиц , не ХА-связывающих клеток, и флуоресценции минус один элемент управления (ФМО) или CD44 дефицитных культур БМК настоятельно рекомендуется для точного Настройг связывания ворот FL-HA.
Хотя эксперименты могут быть выполнены с использованием гетерогенного культуры, то целесообразно , чтобы обогатить для постоянного или макрофагальной популяции с использованием либо с активацией флуоресценции сортировки клеток или покрытые антителом магнитных шариков 18 на основе экспрессии CD11c, Gr1, MHCII, и HA связывания. Возможные эксперименты включают в себя стимуляцию с агонистов Toll-подобных, таких как LPS для измерения активации и продукции цитокинов, T анализов активации клеток, или дополнительную характеристику с помощью проточной цитометрии. Например, после того, как 8 или 24 часов стимуляции, проточной цитометрии могут быть использованы для измерения внутриклеточного окрашивания на цитокины и / или поверхностной маркировки костимуляторных молекул , таких как CD40 и CD86, как описано в разделе 18. Внутриклеточные процедуры маркировки цитокина требуют предварительной обработки клеток с брефелдин А, что предотвращает секрецию и позволяет цитокин скапливаться внутри клетки. Для Т-анализов активации клеток с участием ЛоаDing антигена , такие как OVA пептид антиген - представляющей клетки, очищенные макрофаги основанный на MHCII и HA связывания не активирует Т - клетки , в то время как незрелых и зрелых ДТС 18. Следует отметить, что сортировка процедура сама по себе может активировать дендритные клетки, в некоторой степени, что делает его важным, чтобы включать в себя отрицательный контроль во всех экспериментах.
Как и с любым методом в пробирке, есть свои преимущества и недостатки по сравнению с использованием в естественных условиях или экс-естественных условиях клетки. Недостаток заключается в том, что в пробирке клеток , полученных могут не точно имитируют VIVO клетки , но они имеют то преимущество , что они могут быть получены в достаточном количестве , чтобы обеспечить функциональную и биохимический анализ, то , что часто невозможно с экс-виво клеток. Этот метод макрофагами и идентификации DC позволит дальнейшие исследования для получения более однородной популяции клеток из культуры с ранее недооцененным гетерородность. Как очищенные макрофаги этого GM-CSF культуры близко напоминают альвеолярных макрофагов из легких 18, он обеспечивает удобный источник альвеолярных макрофагов, как и для анализа в лабораторных условиях . Например, эти связывающие макрофаги HA могут быть использованы для скрининга лекарственных средств , которые модифицируют альвеолярного макрофага и исследовать механизмы инфекции микобактерий туберкулеза и резистентности. Учитывая недавнее открытие , что GM-CSF и M-CSF из костного мозга Трансплантация макрофаг может облегчить легочную протеинозе у мышей 28,29, этот метод , чтобы идентифицировать макрофаги из GM-CSF культур может помочь увеличить эффективность предлагаемой терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) (грант СС-119503) и наук и инженерного совета природного Канады (NSERC). NSERC также поддерживает летние studentships с Ю.Д. и А. А. Ю.Д. поддерживается в Университете Британской Колумбии (UBC) с присуждением стипендий 4 года, AA поддерживается CIHR с присуждением аспирантом магистра (РКУ-М). Мы благодарим Кельвин Roskelley за помощью микроскопа , используемого для формирования изображения на рисунке 2. Мы также отмечаем поддержку со стороны UBC животных и проточной цитометрии сооружений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al.
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
