Abstract
Makrophagen und dendritischen Zellen (DCs) sind angeborene Immun in Geweben und lymphatischen Organen gefunden Zellen, die eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern spielen. Sie sind jedoch schwierig in ausreichender Zahl zu isolieren , sie im Detail zu studieren, also in vitro - Modelle entwickelt wurden. In vitro - Kulturen von Knochenmark stammenden Makrophagen und dendritische Zellen sind gut etabliert und wertvolle Methoden zum immunologischen Studien. Hier wird ein Verfahren zur Kultivierung und beide DCs und Makrophagen aus einer einzigen Kultur primärer Maus-Knochenmarkszellen zu identifizieren mit der Cytokin Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) beschrieben. Dieses Protokoll basiert auf dem etablierten Verfahren zuerst von Lutz et al entwickelt. im Jahr 1999 für die Knochenmark abgeleiteten DCs. Die Kultur ist heterogen, und MHCII und fluoresceinierten Hyaluron (FL-HA) verwendet Makrophagen von unreifen und reifen DCs zu unterscheiden. Diese GM-CSF Makrophagen provide eine bequeme Quelle für in - vitro - Makrophagen , die eng Alveolarmakrophagen in beiden Phänotyp und Funktion ähneln.
Introduction
Mehrere in vitro Kulturverfahren beschrieben wurden Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) und Knochenmark stammenden DCs (BMDCs) unter Verwendung eines oder einer Kombination von Wachstumsfaktoren zu erzeugen. BMDMs kann durch Züchten Knochenmarkszellen erzeugt werden unter Verwendung von entweder Makrophagen - Kolonie - stimulierender Faktor (M-CSF) oder GM-CSF 1,2. Für BMDCs gibt die Zugabe von FLT3 - Ligand an der Knochenmarkkultur zu nicht-haft klassischen und plasmazytoiden DCs (CD11c hoch / MHCII hoch und CD11c lo, B220 + beziehungsweise) nach 9 Tagen in Kultur 3,4. Im Gegensatz dazu nicht adhärenten nach 7 bis 10 Tagen in Kultur erzeugt Zellen mit GM-CSF allein 5,6, GM-CSF und IL-4 7 oder GM-CSF und FLT3 - Ligand 8,9 erzeugen BMDCs mehr ähnelt entzündliche DCs (CD11c hoch, MHCII hohe CD11b +) 10. Obwohl diese in vitro Kulturen werden verwendet , Makrophagen zu erzeugen oderDCs, es ist unklar, ob jede Kultur Anlass zu reinen Populationen gibt. Obwohl beispielsweise adhärente Zellen in den GM-CSF - Kulturen beschrieben Makrophagen 5, die nicht-adhärenten Zellen aus der gleichen Kultur zu sein als DCs 6,11-13, mit der Annahme verwendet , dass sie homogen und jede beobachtete Variabilität sind, aufgrund unterschiedlicher Entwicklungsstadien 14,15. Darüber hinaus haben Studien GM-CSF in vivo gefunden 16,17, ein wesentlicher Wachstumsfaktor für Alveolarmakrophagen Entwicklung zu sein und kann in vitro verwendet werden alveolären Makrophagen-ähnliche 16,17,18 zu erzeugen.
Anders als die Einhaltung sind die Verfahren für Makrophagen und DCs von GM-CSF behandelt Knochenmarkkulturen zu erzeugen sehr ähnliche Heterogenität was darauf hindeutet, innerhalb GM-CSF Knochenmarkkulturen existieren können. Dies scheint auch der Fall zu sein, da zwei Papiere des Vorhandenseins von BMDMs in der nicht-haftenden Fraktion von BMDC Kulturen berichten. In einem Papier, sie identified eine Population von Zellen CD11c +, CD11b +, MHCII mid, MerTK + und CD115 +, der eine Genexpression Signatur ausgedrückt, die am ehesten Alveolarmakrophagen und hatte eine reduzierte Fähigkeit glich zu aktivieren 19 T - Zellen. Das zweite Papier verwendet MHCII und FL-HA eine Alveolarmakrophage artigen Population (CD11c +, MHCII mid / niedrig, FL-HA hoch) zu identifizieren , die von unreifen (CD11c +, MHCII Mitte, FL-HA niedrig) und reifen unterschied DCs (CD11c +, MHCII hoch), die beide phänotypisch und funktionell 18. Diese Papiere zeigen beide, dass GM-CSF BMDC Kulturen heterogen sind, sowohl Makrophagen und DC-Populationen enthalten, die Versorgung angibt, sollten getroffen werden, wenn Daten aus BMDC Kulturen zu interpretieren.
Dieses Protokoll beschreibt, wie Knochenmark, Kultur Knochenmarkzellen in-GM-CSF zu isolieren und zu identifizieren, die Alveolarmakrophage artigenBindung und MHCII Ausdruck Bevölkerung aus den unreifen und reifen DCs im Knochenmarkkultur mittels Durchflusszytometrie FL-HA verwenden. Dieses Verfahren wird auf dem etablierten Verfahren von Lutz et al basierend 6 und 5 in der Lage , zu erzeugen -. 10 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen am Tag 7 einer 10 ml Kultur. Die Kultur ist verwendbar von den Tagen 7 bis 10 und ergibt eine heterogene Population von Makrophagen, unreifen und reifen DCs, sowie einige Progenitoren am Tag 7. Dies stellt eine einfache Methode zu wachsen und in vitro alveolären Makrophagen-ähnliche in großen Mengen zu isolieren.
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Protocol
Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care Leitlinien für ethische Tierforschung von Verfahren, die von der University of British Columbia Animal Care Committee genehmigt eingeschläfert.
1. Der Erwerb einer einzelnen Zelle Knochenmark-Suspension von Maus Femur und Tibia
- Schalten Sie einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) 15 Minuten vor dem Beginn des Verfahrens Schrank Luft zu reinigen und ermöglichen eine Luftströmung Stabilisierung, dann reinigen / Spray BSC Oberfläche mit 70% Ethanol. Halten alles so steril wie möglich für die Gesamtheit des Protokolls. Schneiden Sie nicht die Knochen unter nicht sterilen Bedingungen.
- Vorbereitung Dissektionswerkzeuge von in 70% Ethanol (1 Paar Dissektion Schere, 2 Paar Pinzetten) Einweichen Hanks Balanced Salt Solution mit 5% fötalem Kälberserum (HBSS-FCS), sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm), 1 ml Spritzen, 26 ½ Gauge-Nadeln, konischen Sammelröhrchen (15 ml oder 50 ml) und Papiertücher in der BSC.
- Euthanize mit der MausProtokolle, die von der Institution Tierforschung Ethikkommission genehmigt. Bringen Sie in die BSC, legen oben auf ein oder zwei Papiertücher und die Maus mit 70% Ethanol besprühen.
- In der BSC, öffnen Sie eine sterile aseptisch Petrischale, aliquote 10 ml HBSS-FCS mit der Basis und 1 bis 2 ml auf den Deckel.
- Platzieren Sie die Maus auf dem Bauch mit dem Rücken nach oben und heben Sie die Haut um die Brust-Abschnitte mit den Fingern der nicht-dominanten Hand. Verwenden Sie die Schere, um einen Einschnitt zu machen, wo die Haut angehoben wird.
- Halten Sie sich an den beiden Enden des Schnittes, wobei ein Ende mit jeder Hand und vorsichtig auseinander ziehen die Haut um die Maus von der Rückseite in den Magen, fortzusetzen, bis zwei Enden des Einschnitts treffen, der an den Magen.
- Drehen Sie die Maus auf Bauch nach oben und mit einer Hand ziehen Sie die untere Hälfte der Haut nach unten in Richtung Bein, halten die Haut zurückziehen, bis die Beine ausgesetzt sind.
- Halten Sie den Fuß der Maus nach oben und schneiden Sie die Achillessehnen über dem Sprunggelenk unddie Bänder die Muskeln Verbindungs am unteren Ende der Tibia mit einer Schere zu Fuss. Dies lockert den Fuß von den Beinknochen.
- Während das Bein nach oben durch den Fuß, schneiden Sie die Muskeln und Bänder mit einer Schere alle um das Kniegelenk am unteren Ende des Oberschenkels die Oberschenkelmuskulatur aus dem unteren Bein zu trennen. Verwenden einer Pinzette vorsichtig gelockert Muskeln ziehen weg von der Fibula und Oberschenkel Oberflächen. Achten Sie darauf, nicht die Femoralarterie zu durchtrennen, schwere Blutungen zu vermeiden.
- Mit der einen Hand auf den Fuß nach unten drücken offene Schere am oberen Ende des Oberschenkels im Hüftgelenk, drehen Sie das Bein und ziehen Sie vorsichtig den Oberschenkelknochen aus dem Hüftgelenk zu trennen, während die Schere mit dem letzten Schnitt zu frei zu machen das Bein aus dem Körper.
- Von diesem Punkt an, halten nur das Gewebe mit einer sterilen Pinzette. Halten Sie an das Bein an einem Ende an und ziehen Sie den Fuß auf den anderen ab.
HINWEIS: Dies sollte nicht viel Kraft erfordern, als Verbindungsbänder in Schritt geschnitten werden1.9. Alternativ dazu schneiden die Tibia knapp über dem Knöchel, wo der Knochen fusioniert ist. - Halten Sie das Bein durch das distale Ende des Femurs mit einem Satz Zangen und proximalen Ende der Tibia und Fibula mit einem anderen, biegen sorgfältig die Tibia und Fibula in die entgegengesetzte Richtung des Kniegelenks sie von Femur und Patella zu trennen.
- Verwenden einer Pinzette, um die verbleibenden Bänder und Muskeln nach unten ziehen, noch an den Unterschenkelknochen befestigt. Hier, nehmen Sie die Fibel zusammen mit dem Bindegewebe mit einer Pinzette, da es zu klein ist, gespült werden für Knochenmarkzellen. Setzen Sie die gereinigte Tibia auf der invertierten Petrischale Deckel.
- Halten Sie das untere Ende des Oberschenkels mit einem Satz von Zangen und der Patella mit einem anderen, biegen Sie die Patella und das umgebende Gewebe in die entgegengesetzte Richtung des Gelenks zur Entfernung. reinigen Dann Bindegewebe aus dem Oberschenkelknochen verbleibt; Ziehen sie mit einer Pinzette entfernt, und legen Sie es auf dem umgekehrten Schalendeckel Petri. Entsorgen Sie die Patella.
- Wiederholen 1.7- 1.13 mit dem anderen Bein, wenn nötig. Übertragen Sie die Knochen auf 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml sterilem HBSS-FCS für den Transport, falls erforderlich.
- Platzieren Knochen auf das invertierte Petrischale Deckel mit 1 bis 2 ml HBSS-FCS, verwenden Zange restliche Gewebe zu reinigen noch an der Tibia und Femur befestigt, dann übertragen die Knochen an der Basis der Petrischale mit 10 ml HBSS- FCS. Alternativ dazu können die Knochen reinigen und an Muskelgewebe entfernen, um eine 70% Ethanol getränkten Gewebe verwendet wird.
- Schneiden Sie jede der Knochen in der Mitte mit einer Schere. Schild teilweise die Petrischale mit einem sterilen Deckel während des Schneidens die Knochen bleiben in der Schale zu gewährleisten. Alternativ schneiden das Ende jedes Knochenspülung in dem nächsten Schritt zu ermöglichen.
- Bringen Sie die 26 ½ G-Nadel auf die 1-ml-Spritze und ziehen bis 1 ml HBSS-FCS aus der Petrischale. Legen Sie die Spitze der Nadel in das Ende eines Knochenstück und spülen Sie die Knochenmarkzellen (weichen roten Gewebe im Inneren der Knochensubstanz) aus. Führen Sie die Nadel in den Kopfdes Knochens und das offene Ende, bis das gesamte rot gefärbt ist Mark entfernt. Beachten Sie die Knochen, wie in der Farbe weiß.
- Passieren sichtbare Klumpen von Knochenmark durch die Spritze mehrmals eine Einzelzellsuspension zu bilden.
- Entsorgen Sie die gespülten Knochen. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette die Zellsuspension gut und Transfer zum Sammelröhrchen zu mischen. Spülen Sie die Petrischale einmal mit 5 ml HBSS-FCS Restzellen in der Schale zu sammeln. Legen Sie Zellen auf Eis.
HINWEIS: Die Zellsuspension Knochenmark ist noch lebensfähig , wenn für 2 gespeichert - bei 4 ° C 3 Std.
2. Überzug und Kultivierung von Knochenmarkzellen (BMC)
- Bereiten Sie die folgenden Reagenzien und Verbrauchsmaterialien.
- Vorbereitung von roten Blutzellen (RBC) Lysepuffer, indem 0,84% Ammoniumchlorid in einer endgültigen Lösung von 2 mM Tris pH 7,2, sterilisieren dann durch Filtrieren durch einen 0,2-Mikron-Filter.
- Bereiten BMC Medien durch Zugabe von 10% FCS, 20 mM HEPES, 1x nicht-essentielle Aminosäure, 55 & #181; M 2-Mercaptoethanol, 50 U / ml Penicillin und Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, und 2 mM L-Glutamin RPMI Medium 1640.
- Erhalten kommerziell erhältlichen rekombinanten GM-CSF oder verwenden GM-CSF - Überstand aus AG8.653 Myelomzellen enthält , transfiziert mit dem GM-CSF - Gen 20. Bestimmen Sie die Konzentration von GM-CSF in dem Überstand durch ELISA und fügen Sie das Äquivalent von 20 ng / ml auf den BMC-Medien.
- Spin down die Knochenmarkszellen bei 314 × g für 5 min. Das Pellet ist rot, aufgrund RBCs. In der BSC, den Überstand aspirieren einer sterilen Pasteur-Glaspipette angebracht Saugen Vakuum, lösen Sie das Pellet durch Klopfen, dann wurden 10 ml Puffer RBC Lyse hinzufügen. Vortex um die Zellen zu resuspendieren und in RBC-Lyse-Puffer bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert.
- 10 ml HBSS-FCS dann Zellen Spin bei 314 × g für 5 min und den Überstand aspirieren. Beachten Sie die Zellpellet als weiße Farbe. Die Zellen in gewünschte Volumen von BMC Medien.
- Zählen Sie die resuspended-Zellen, die eine Zählkammer nach toten Zellen mit 0,4% Trypan-Blau-Färbung.
HINWEIS: Wenn Knochenmark von einem Bein (Einzel Tibia und Femur) verwendet wird, Resuspendieren in 5 ml BMC Medien, nehmen 10 ul Zellsuspension und verdünnen Sie es mit 70 & mgr; l von 0,4% Trypanblau, gut mischen und Transfer 10 ul die 1/8 Zelle Verdünnung auf die Hemocytometer Kammer. Zählen der lebensfähigen Zellen in vier Quadranten: der Mittelwert der vier Quadranten Zählwerte x Verdünnungsfaktor x 10 4 = Anzahl der Zellen pro ml. 4 x 10 7 Zellen nach dem RBC - Lyse - einem Femur und einer Tibia von einem Bein wird etwa 2 allgemein ergeben. - Schätzung der Anzahl von 10 ml Speisen von Knochenmarkkulturen für nachgelagerte Experimente benötigt basierend auf der Anzahl der insgesamt für die Versuche benötigten Zellen am Ende der Kultur.
HINWEIS: Jedes Gericht benötigt 2 x 10 6 Knochenmarkzellen bei der ersten Aussaat und Ausbeuten von 5 bis 10 x 10 6 Zellen am Tag 7.- Aliquot die Gesamtzahl der Zellen zur Plattierung in ein neues Röhrchen, zentrifugieren bei 314 xg für 5 min, Überstand absaugen und resuspendieren Zellen bei 4 x 10 6 Zellen / ml in BMC Medien.
- Bereiten Sie eine neue sterile 100 mm x 15 mm Petrischale mit 9,5 ml BMC-Medium, das 200 ng GM-CSF (rekombinantes oder von GM-CSF enthaltende Überstand). Hinzufügen 500 ul der 4 x 10 6 Zellen / ml Knochenmarkszellen in die Mitte der Petrischale für die Endkonzentration von 2 x 10 5 Zellen / ml in 10 ml.
HINWEIS: Es ist wichtig , eine sterile Petrischale nicht eine Gewebekulturschale zu verwenden. Auch wenn die Zellen die Zugabe sorgen Zellen in der Mitte konzentriert bleiben und minimieren Störung der Speisen nach dem Aussäen und während der Medienwechsel. Inkubiere Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. Dies ist Tag 0 in der Kultur. - Am Tag 3, 10 ml frischem BMC Medien zu jeder Schale von Zellen, die 200 ng GM-CSF hinzuzufügen. Achten Sie darauf, Störung o zu minimierenf die in Suspension konzentriert Zellen. Das Gesamtvolumen der Zellkultur ist jetzt 20 ml.
- Beobachten Zellen unter dem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Beachten Sie zahlreiche nicht-haftenden Zellen (rund) und ein paar anhaftenden Zellen (flach). Zellen in Gruppen von drei oder vier ähnlich Blütenblätter einer Blume zu sehen ist, die Proliferation anzeigt.
- Am 6. Tag eine halbe Medienwechsel durchführen. Entfernen Sie vorsichtig 10 ml Medium in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen, Spin bei 314 · g nach unten für 5 min, absaugen und den Überstand verwerfen.
- Zellpellet in 10 ml frischem BMC Medien 20 ng / ml GM-CSF enthält, sanft Wirbel und zu der ursprünglichen Zellkulturschale mit einem Gesamtvolumen von 20 ml. Beachten Zellen unter dem Mikroskop.
HINWEIS: Tag 7 Kultur sollte mit anhaftender flachen Zellen und dichte Wolken von runden nicht adhärenten Zellen bei 70% oder mehr in Konfluenz sein.
3. Sammeln und Vorbereiten BMDC und BMDMs für die Durchflusszytometrie
- <li> Halten Sie alle Puffer bei 4 ° C.
- Ernten Sie die Zellen von Tag 7 bis Tag 10. Um die Zellen zu ernten erste Transfer 10 ml des Kulturüberstand zu einem 50 ml konischen Sammelröhrchen, dann kippen die Schale vertikal um ca. 30 Grad und waschen Sie die Schale pipettiert, die restlichen 10 ml der Kultur von der Spitze der Schale. Wiederholen Sie diese Wäsche 5 Mal, jedes Mal Drehen der Schale um ein Drittel.
- Übertragen Sie die restlichen 10 ml der Zellen auf die gleiche Sammelröhrchen und entsorgen Sie die Platte und anhaftenden Zellen.
HINWEIS: Die Waschungen werden entfernen nicht haftenden und lose anhaftenden Zellen; die flachen adhärente Zellen sind resistent gegen den Wäschen. Typischerweise von 5 - 10 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen werden von einer Platte am Tag erwartet 7 und 2 bis 5 x 10 6 Zellen am Tag 10, obwohl Lutz et al. berichtet 10 x 10 6 Zellen am Tag 10. Die anhaftenden Zellen werden nicht aufgenommen. müssen jedoch, wenn diese Zellen auf die nicht-adhärenten Zellen im Vergleich zuKönnen sie wie folgt entfernt werden. 5 ml 0,7 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4 auf die Schale, nachdem die nicht-anhaftenden Zellen entfernt, bei 37 ° C für 5 min, einer Pipette auf und ab um die adhärenten Zellen zu entfernen, und in einem separaten Röhrchen sammeln. - Spin down die gesammelten Zellen bei 314 xg für 5 min und den Überstand aspirieren. Resuspendieren in 5 ml sterile BMC Medien bei 4 ° C, Wirbel sanft zu mischen, und zählen Trypanblau und Zählkammer.
HINWEIS: Jedes Gericht wird 5 ergeben - 10 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen von einem Tag 7 Kultur. Von nun alle Schritte bei 4 ° C durchzuführen. - Für Durchflußzytometrie - Analyse, Übertragung 2 x 10 5 Zellen für jede Probe in 5 ml Polystyrol - Rundbodenröhrchen, fügen 300 ul FACS - Puffer bei 4 ° C (1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 2 mM EDTA und 2% Rinderserumalbumin) zu jedem Sample.
- Spin-Zellen bei 314 xg für 5 min nach unten und den Überstand aspirieren. Beobachten Sie eine sichtbare weiße, undurchsichtige Pellet bei derBoden des Röhrchens.
- Die Zellen in 100 ul unmarkierten Fc-Rezeptor zu blockieren Ab Fc-Rezeptor-Bindung (Verwendung 1/10 Überstand von 2.4G2 produzierenden Myelom-Zelllinie) und bei 4 ° C für 20 min inkubiert. Dann fügen Sie 300 ul FACS-Puffer zu jeder Probe, sanft Wirbel, dann Zellen des Abschaltens bei 314 × g für 5 min und der Überstand absaugen.
- Die Zellen in 100 & mgr; l CD11c-PeCy7 bei 0,2 & mgr; g / ml, Gr1-Pacific Blue bei 0,25 & mgr; g / ml, MHCII-APC bei 0,05 & mgr; g / ml, und FL-HA bei etwa 2 ug / ml Makrophagen und DCs zu identifizieren.
HINWEIS: FL-HA wurde im Haus unter Verwendung von Fluorescein und Hahnenkamm Hyaluronsäure - Natriumsalz hergestellt , wie zuvor beschrieben 21. - Inkubieren für 20 min bei 4 ° C Bindung an die Zelloberfläche zu ermöglichen. In 300 ul FACS - Puffer zu jeder Probe, sanft Wirbel, dann Zellen des Abschaltens bei 314 × g für 5 Minuten bei 4 ° C und den Überstand aspirieren . HINWEIS: Wenn Biotinylated Antikörper in 3.8 verwendet werden, wiederholen 3,8-9 mit fluoreszenz Streptavidin.
- Wash-Zellen mit einem anderen 300 ul FACS-Puffer, sanft Wirbel zu mischen und drehen Sie die Zellen bei 314 xg für 5 min nach unten. Den Überstand aspirieren und Resuspendieren der Zellen in 200 & mgr; l FACS-Puffer, enthaltend von 0,1 bis 0,2 ug pro ml Propidiumiodid oder DAPI nonviable Zellen zu markieren. Die Zellen sind nun bereit für die Durchflusszytometrie - Analyse 22.
HINWEIS: Siehe Ergebnisse und Abbildung 3 für weitere Details der Populationen und wie wurden die Zellen gated.
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Representative Results
Ein Flussdiagramm der wichtigsten Schritte dieses Verfahrens zusammenfassend in 1 dargestellt ist. Die Dichte und die Morphologie der Kultur Knochenmark zu verschiedenen Zeiten der Kultur sind in Abbildung 2 dargestellt. Am Tag 1 werden die Zellen klein und einfach , aber für Tag 3, gibt es mehr Zellen, einige sind größer und einige haben anhaften begonnen. Am Tag 6 gibt es eine eindeutige adhärenten und nicht adhärenten Fraktion (2A). 10. 2B zeigt die Tag 7 Kultur vor der Ernte, sowie die getrennt adhärenten und nicht-adhärenten Zellfraktionen 10 mit einem höheren Anteil an CD11c + Zellen , die an Tag - Die Kultur kann von Tag 7 geerntet werden. Die anhaftende Fraktion besteht aus den nach den Licht wäscht links Zellen, die die nicht-adhärenten Fraktion zu entfernen. Die nicht haftende Fraktion wird für die Zellen mit einem dendritischen Morphologie stark angereichert, die deutlicher in der vergrößerten digital im gesehen werden kannAlter in den Einschüben in 2B. Sobald der nicht-haftenden Fraktion entfernt wird (Tag 7 oder Tag 10) werden analysiert , die Zellen mittels Durchflusszytometrie nach der Markierung mit fluoreszierenden Antikörpern gegen Schlüsselzelloberflächenmarker, wie oben beschrieben. 3 zeigt repräsentative Durchflusscytometrie Plots der nicht-adhärenten Bruchteil der Kultur am Tag 7 und Tag 10.
Für die Identifizierung der beiden Makrophagen und DCs, Tor auf CD11c + und Gr1 - Zellen nach der ersten Gating auf Größe und lebenden Zellen (3A und B). In Tag 7 Kulturen, die CD11c + Gr1 - Bevölkerung in der nicht-adhärenten Zellfraktion ist in der Regel 60 bis 70% der gesamten lebenden Zellen, und dies zu 90% oder mehr am Tag erhöht wird 10 (3B). Die CD11c + Gr1 - Bevölkerung am Tag 7 und Tag 10 kann in drei Hauptuntergruppen unterteilt werden unter Verwendung von MHC - II und FL-HA Binding: MHCII mid / niedrig FL-HA hohe Makrophagen (P1) Bindung, MHCII Mitte FL-HA Bindung niedrig (P2) Zellen unreife DCs enthält, und MHCII hohe FL-HA Bindung niedrig reife DC (P3) (3C und 18 Referenz ). Die FL-HA niedrig, MHCII geringer Bevölkerungs (P0) am Tag beobachtet 7 hat sich gezeigt , 18 Vorläufern für die P1-P3 Zellen enthalten. Diese Bevölkerung ist nicht ersichtlich, am Tag 10 was bedeutet, dass die weitere Reifung der Kultur stattgefunden hat. Dies wird auch durch den größeren Anteil an CD11c - Zellen in der Kultur sowie etwas höhere Prozentsätze der P2 und P3 DC - Populationen an Tag 10 gelagert Figur 3D MerTK zeigt, als ein Makrophagenmarker zu sein, ist hoch sowohl Makrophagen exprimiert und unreife DC-Populationen (P1 und P2), wird aber in einem geringeren Ausmaß auf reifen DCs (P3-Zellen) ausgedrückt. Bemerkenswert ist, die Analyse der adhärenten Fraktion zeigt die Anwesenheit des P0, P1 undP2 Populationen, aber die P3 reifen DC-Population nicht (Daten nicht gezeigt). So sind Makrophagen, die in den adhärenten und nicht adhärenten Fraktionen, sondern nur reife DCs vorhanden sind, in der nicht-haftenden Fraktion.
. Abbildung 1: ein Flussdiagramm , der die Schlüsselschritte des Verfahrens Primärzellen aus dem Knochenmark geerntet, überzogen und in Kultur gehalten für 7 - 10 Tagen , wenn sie für den Einsatz in weiteren Experimenten geerntet, gereinigt oder in FACS - Analyse verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Die mikroskopische Untersuchung von GM-CSF Knochenmarkzellen , abgeleitet. EIN) der Knochenmarkkultur am Tag 1, 3 und 6, um die Zunahme der Zellzahl, Veränderungen in der Morphologie und Entstehung verschieden adhärenten und nicht-adhärenten Fraktionen zeigt. B) Linke Seite zeigt den Tag 7 Knochenmarkkultur und die typische Zelldichte. Das mittlere Feld zeigt den Tag 7 anhaftenden Zellen nach der Ernte der nicht-haftenden Fraktion und der rechten Seite zeigt die nicht-adhärenten Fraktion am Tag geerntet 7. Insets digital Bilder von Zellen in dieser Fraktion mit dendritischen Morphologie vergrößert werden. Der weiße Maßstabsbalken entspricht 50 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Phänotyps der GM-CSF Kultur am Tag 7 und Tag 10. Nicht anhaftendeZellen aus der Kultur , markiert mit CD11c, Gr1, MHCII, FL-HA und MerTK am Tag 7 oder Tag 10 und für ihren Phänotyp durch Durchflusszytometrie analysiert. A) Zellen zuerst auf Größe gated wurden dann Zellen leben. B) zeigt ein Plot der gated Zellen mit CD11c und Gr1 (die Neutrophilen / Monozyten - Marker) und identifiziert die CD11c + Gr1 - Bevölkerung , die Makrophagen und dendritischen Zellen. Gating auf dieser Population, C) zeigt die Durchflusszytometrie Grundstück von MHCII und FL-HA - Bindung, die die Trennung der alveolären artigen Makrophagen zeigt (P1) aus unreifen DCs (P2) und reifen DCs (P3), wie in Poon beschrieben et al. 18. D) Histogramme Vergleich MerTK Ausdruck zwischen dem P1 (Makrophagen), P2 (unreife DCs) und P3 Populationen (reife DCs) am Tag 7 und Tag 10. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieses figu anzuzeigenRe.
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Discussion
In diesem Manuskript, stellen wir ein Verfahren zur Erzeugung von GM-CSF Makrophagen und DCs aus einem einzigen Maus - Knochenmarkkultur , die von Lutz angepasst ist , et al. 6. MHCII Expression und FL-HA unterscheidet zwischen unreifen DCs und Makrophagen in dieser Kultur - Bindung (siehe 3C), die bisher schwierig war. Dies, zusammen mit einem anderen Bericht von Helft et al. 19 zeigt die Heterogenität innerhalb GM-CSF induzierten BMDC Kulturen , die bisher angenommen wurden nur DCs zu sein. Helft et al. 19 verwendet ganz unterschiedliche Kulturbedingungen BMDCs aber auch eine signifikante Makrophagen Bevölkerung gefunden zu erzeugen. GM-CSF induzierten Makrophagen ähneln Alveolarmakrophagen und GM-CSF induzierte DCs ähneln entzündliche DCs, während FLT3 - Ligand ergänzt BMDC Kulturen produzieren klassische und plasmazytoiden DCs 3,4. Verschiedene DC und Makrophagen - Populationen sind auch in vivo un beobachtetder homöostatischen und Entzündungszuständen, und es gibt viel Diskussion in dem Bereich, was 10 eine DC und eine Makrophagen definiert. Dies gilt insbesondere, wenn es monozytenabgeleiteten Entzündungs DCs kommt, und das ist in diesem BMC auch relevant. Es ist daher wichtig, mehrere phänotypische Marker, Funktionsdaten und möglicherweise Genexpressionsdaten zu verwenden, um eine bestimmte Population zu charakterisieren. Es ist auch möglich , dass diese in vitro DC und Makrophagenpopulationen können weiter unterteilt , wie funktioneller und phänotypischen Marker entdeckt werden.
In diesem Verfahren wird der Marker CD11c, Gr1, MHCII und FL-HA verwendet Makrophagen von unreifen und reifen dendritischen Zellen in der nicht-haftenden Bruchteil der BMC Kultur zu unterscheiden. Dies unterscheidet sich von Helft et al. 19, der die Marker CD11c verwendet, CD11b, CD115, CD135, MerTK und MHCII eine Makrophagenpopulation von reifen DCs zu unterscheiden. MerTK Expressionsniveaus könnte distinguish zwischen Makrophagen (P1) und reifen DCs (P3), aber nicht unreifen DCs (P2) (Figur 3D). So FL-HA und MHCII sind nützliche Marker Makrophagen sowohl von unreifen und reifen DC-Populationen zu unterscheiden. Diese Makrophagen werden auch funktionell verschieden von DCs in diesem BMC Kultur und dies wird detaillierter an anderer Stelle 18 gezeigt. Nach LPS - Stimulation Kurz gesagt, produzieren die BMC Makrophagen verschiedene Zytokine als reife DCs und nicht aktivieren naive T - Zellen 18. Diese Makrophagen ähneln auch eng Alveolarmakrophagen, sowohl phänotypisch und funktionell als beide binden FL-HA und Express CD11c, MerTK, CD200R, CD206 und F4 / 80 und nach LPS - Stimulation produzieren TNF-α noch nicht in der Lage sind , 18 naive T - Zellen zu aktivieren. Allerdings gibt es auch Unterschiede: Die BMC Makrophagen CD11b + sind und den unteren Ebenen der Siglec F im Vergleich zu Ex-vivo Alveolarmakrophagen, was darauf hindeutet , diese Zellen sind ähnlich , aber nicht identifiziertcal Alveolarmakrophagen.
Es gibt einige wichtige Schritte, um den Erfolg dieses Protokolls zu gewährleisten. Es ist wichtig, ab Sterilität von Aussetzen des Knochenmarks zu erhalten. Wenn in die und aus der BSC bewegt, Sprüh- behandschuhten Hände und Gegenstände, die mit 70% Ethanol. Obwohl es hilfreich ist Werkzeuge in 70% Ethanol zu spülen zu sterilisieren, ist Ethanol zu Knochenmarkzellen toxisch, so die Werkzeuge-Luft trocknen und sicherzustellen, dass das Ethanol, bevor bringen Knochen oder Zellen in Kontakt mit ihnen verdampft ist. Darüber hinaus vermeiden mit nicht sterilen Ausrüstung oder die Hände während der Knochenmark Ernte Maus Geweben oder Zellen berühren. Obwohl Penicillin und Streptomycin Ergänzung in den Medien zur Verfügung gestellt, unvorsichtige Handhabung der Zellen kann zu Hefe oder Pilzbefall führen. Da zusätzlich immune Zellen mit phagozytischen Aktivität in dieser Kultur erzeugt werden, können geringe Verunreinigung nicht durch einfaches Beobachten der Zellkultur mikroskopisch nachgewiesen werden, so ist es wichtig, t zu identifizierener Anzeichen von Kontamination. Zum Beispiel kann die Zellzahlen und die Expression von Zellaktivierungsmarker, wie CD40 und CD86 verringert werden, kann erhöht werden, wenn mittels Durchflusszytometrie analysiert. Medienfarbe kann auch vergilben eine pH-Änderung aufgrund von Verunreinigungen zurückzuführen ist. Wenn Kontaminierung auftritt, ist das BMC Kultur unbrauchbar. Zur Aufrechterhaltung der experimentellen Konsistenz ist es wichtig, eine Einzelzellsuspension aus dem Knochenmark durch Verwirbelung und erhalten eine genaue Zellzahl zu erzeugen, die BMC-Kulturen einzurichten. Auch wenn jede Bindegewebe aus dem Knochen in der Einzelzellsuspension endet, filtriert durch ein steriles 70-Mikron-Filter, um es zu entfernen. Typische Zellausbeuten für eine Platte des nicht haftenden Fraktion am Tag 7 sind von 5 - 10 x 10 6 Zellen. Die Zellzahlen sind in der Regel ein guter Hinweis darauf, dass das Protokoll gut funktioniert. Mit diesem Verfahren erhält man in der Regel zwischen 2 bis 5 x 10 6 Zellen am Tag 10, wohingegen Lutz 10 x 10 6 Zellen berichtet. Wir führen RBC-Lyse auf the anfänglichen Knochenmarkzellen , während das Protokoll , das von Lutz et al. nicht und so kann dieser Schritt optional sein. Variationen in der prozentualen CD11c-Zellen sowie Zahlen und die Anteile von Makrophagen und DCs können aus verschiedenen Quellen oder Chargen von FCS auftreten und so ist es wichtig, neue Chargen von FCS auf BMC Kulturen für eine konsistente experimentellen Ergebnisse zu testen. GM-CSF-Konzentration wurde von 5 ng / ml bis 40 ng variiert / ml, und dies nicht signifikant die Zellausbeute beeinflussen. Zelldichte kann auch Einfluss auf die Reifung der Kultur. Zum Beispiel Helft et al. ausgesät 1 x 10 7 Zellen in 4 ml Medium , das 19 eine größere Prozent der Zellen mit hoher Expression MHCII hergestellt. Der Zeitpunkt, wenn die Zellen geerntet werden, können auch den Prozentsatz der Bevölkerung betreffen, die in dem nicht haftende Fraktion. Die Zellen werden in der Regel zwischen 7 Tagen gesammelt - 25 bis 27 Oktober, aber einige Studien sammeln -BMCs am Tag 6 19,23,24. Wenn mehr Zellen benötigt werden, Kultur -BMCsin größer 150 mm x 15 mm Petrischalen in 40 ml bei der gleichen Dichte. In diesem Fall wird ein Medienwechsel Halbvolumen wird auf beide Tag getan 3 und Tag 6 (dh 20 ml Medium entfernt, die Zellen abzentrifugiert und ersetzt mit frischen 20 ml Medium mit 20 ng / ml rGM-CSF ergänzt). Diese Platten erzeugen , typischerweise von 3 bis 6 x 10 7 Zellen pro Schale am Tag 7. FL-HA ist ein wichtiges Reagenz zusammen mit MHCII, zu Makrophagen von unreifen und reifen DCs in der BMC Kultur unterscheiden. Somit , sobald es hergestellt ist, titrieren den FL-HA zur Verwendung auf Zellen bekannt konstitutiv HA binden wie Alveolarmakrophagen 18 oder BW5147 T - Zellen und Bestätigung seiner Spezifität entweder eine HA-blockierende CD44 - Antikörper (KM-81, im Handel erhältlich) verwendet, unmarkierten HA oder ein CD44-defizienten Zellen. CD11c - Gr1 + Zellen in der Kultur kann nicht HA-bindenden Zellen als interne Kontrolle funktioniert, und eine Fluoreszenz minus einer Kontrolle (FMO) oder CD44 - defizienten BMC Kulturen sind sehr für eine genaue settin empfohleng des FL-HA-Bindungs Gate.
Obwohl Versuche unter Verwendung eines heterogenen Kultur durchgeführt werden kann, ist es ratsam , für die DC oder Makrophagen - Population unter Verwendung von entweder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder Antikörper - beschichtete magnetische Kügelchen 18 zu bereichern basierend auf der Expression von CD11c, Gr1, MHCII und HA binden. Mögliche Experimente umfassen die Stimulation mit Toll-like-Rezeptor-Agonisten wie LPS-Aktivierung und Zytokin-Produktion, T-Zell-Aktivierung Assays oder zusätzliche Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie zu messen. Beispielsweise nach 8 oder 24 Stunden der Stimulation, Durchflusszytometrie kann verwendet werden , die intrazelluläre Färbung zu messen für Zytokine und / oder Oberflächenmarkierung von kostimulatorischen Molekülen wie CD40 und CD86, wie in 18 beschrieben. Die intrazellulären Zytokin-Markierungsverfahren erfordern eine Vorbehandlung der Zellen mit Brefeldin A, die die Sekretion verhindert und ermöglicht das Zytokin in der Zelle aufzubauen. Für T-Zell-Aktivierung Assays, die die Loa Beteiligungding eines Antigens wie dem OVA - Peptid durch eine Antigen - präsentierende Zellen, gereinigte Makrophagen auf Basis von MHCII und HA - Bindung nicht - T - Zellen , während unreife und reife DCs werden 18 aktivieren. Es sei darauf hingewiesen, dass das Sortierverfahren allein die dendritischen Zellen in einem gewissen Ausmaß aktivieren können, so dass es wichtig Negativkontrollen in allen Experimenten enthalten.
Wie bei jedem in vitro Verfahren, gibt es Vorteile und Nachteile im Vergleich zur Verwendung in vivo oder ex-vivo - Zellen. Nachteilig ist , dass in vitro abgeleitete Zellen nicht genau mimic in vivo - Zellen , aber sie haben den Vorteil, daß sie in ausreichender Anzahl erzeugt werden , um funktionelle und biochemische Analyse zu ermöglichen, etwas , das häufig mit ex-vivo - Zellen nicht möglich ist. Diese Methode der Makrophagen und DC-Identifikation ermöglicht die zukünftige Forschung homogener Zellpopulationen aus einer Kultur mit zuvor underappreciated Hetero zu erhaltenterogenität. Als gereinigte Makrophagen aus dieser GM-CSF Kultur eng Alveolarmakrophagen der Lunge 18 ähneln, stellt es eine bequeme Quelle für alveolare Makrophagen-ähnlichen für in vitro - Analyse. Beispielsweise könnten diese HA - Bindungs Makrophagen für Arzneimittel zu screenen , werden verwendet , die alveoläre Makrophagenfunktion verändern und Mechanismen der Mycobacterium tuberculosis Infektion und Resistenz zu untersuchen. Angesichts der jüngsten Entdeckung , dass GM-CSF und M-CSF aus dem Knochenmark - Makrophagen - Transplantation in Mäusen Lungen Proteinose lindern 28,29, diese Methode Makrophagen von GM-CSF Kulturen zu identifizieren , kann dazu beitragen , die Wirksamkeit der vorgeschlagenen Therapie erhöhen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) (Zuschuss MOP-119503) und der Naturwissenschaften und Engineering Council of Canada (NSERC) gefördert. NSERC unterstützt Sommer studentships auch YD und AA YD wird von der University of British Columbia (UBC) mit einem 4-Jahres-Stipendium Auszeichnung unterstützt, AA durch CIHR mit ein Student Master-Auszeichnung (CGS-M) unterstützt. Wir danken Calvin Roskelley für die Unterstützung mit dem Mikroskop die Bilder in Abbildung 2 zu erzeugen , verwendet. Wir erkennen auch die Unterstützung der UBC Tier- und Durchflusszytometrie Einrichtungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
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