Abstract
Makrofager och dendritiska celler (DC) är medfödda immunceller som finns i vävnader och lymfoida organ som spelar en viktig roll i försvaret mot patogener. Men de är svåra att isolera i tillräckligt antal för att studera dem i detalj, därför har in vitro-modeller har utvecklats. In vitro kulturer av benmärgsmakrofager och dendritiska celler är väletablerade och värdefulla metoder för immunologiska studier. Här, är en metod för odling och identifiering av både DCS och makrofager från en enda kultur av primär mus benmärgsceller med användning av cytokinen granulocyt makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) som beskrivits. Detta protokoll är baserat på det fastställda förfarandet först utvecklades av Lutz et al. 1999 för benmärgshärledda DC. Kulturen är heterogen, och MHCII och fluoresceinerad hyaluronan (FL-HA) används för att skilja makrofager från omogna och mogna DC: er. Dessa GM-CSF härledda makrofager provide en lämplig källa för in vitro härledda makrofager som nära liknar alveolära makrofager i både fenotyp och funktion.
Introduction
Flera in vitro-odlingsmetoder har beskrivits för att generera benmärgshärledda makrofager (BMDMs) och benmärgshärledda DCs (BMDCs) genom att använda en eller en kombination av tillväxtfaktorer. BMDMs kan genereras genom odling av benmärgsceller med användning av antingen makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) eller GM-CSF 1,2. För BMDCs tillsatsen av FLT3-liganden till benmärgen kultur ger upphov till icke-vidhäftande klassiska och plasmacytoid DC (CD11c hög / MHCII hög och CD11c lo, B220 + respektive) efter 9 dagar i kultur 3,4. I motsats, icke vidhäftande celler genereras efter 7 till 10 dagar i odling med GM-CSF enbart 5,6, GM-CSF och IL-4 7, eller GM-CSF och FLT3-liganden 8,9 generera BMDCs närmare liknar inflammatoriska DCs (CD11c hög, MHCII hög CD11b +) 10. Medan dessa in vitro-kulturer används för att generera makrofager ellerDCs är det oklart om varje kultur ger upphov till rena populationer. Till exempel, även vidhäftande celler i de GM-CSF-odlingar beskrivs att vara makrofager 5, de icke-vidhäftande celler från samma kultur används som DCs 6,11-13, med antagandet att de är homogena och eventuella observerade variabiliteten är på grund av olika utvecklingsstadier 14,15. Vidare har studier fann GM-CSF för att vara en viktig tillväxtfaktor för alveolär makrofag utveckling in vivo 16,17, och kan användas in vitro för att generera alveolära liknande makrofager 16,17,18.
Annat än följsamhet, förfarandena för generering av makrofager och DC från GM-CSF behandlade benmärgskulturer är mycket lika tyder heterogeniteten kan existera inom GM-CSF benmärgsodlingar. Detta verkar faktiskt vara fallet som två artiklar rapporterar förekomsten av BMDMs i den icke-vidhäftande fraktionen av BMDC kulturer. I ett papper, identifi deed en population av celler som CD11c +, CD11b +, MHCII mitten, MerTK +, och CD115 +, som uttryckte en genuttryck signatur som närmast liknade alveolära makrofager och hade en minskad förmåga att aktivera T-celler 19. Den andra papper som används MHCII och FL-HA för att identifiera en alveolär makrofag-liknande population (CD11c +, MHCII mitten / låg, FL-HA hög) som var skild från omogna (CD11c +, MHCII mitten, FL-HA låg) och mogna DCs (CD11c +, MHCII hög), både fenotypiskt och funktionellt 18. Dessa papper båda visar att GM-CSF BMDC kulturer är heterogena, som innehåller både makrofager och DC populationer tyder på att försiktighet bör iakttas vid tolkning av data från BMDC kulturer.
Detta protokoll beskriver hur man isolerar benmärg, odling benmärgsceller i GM-CSF, och identifiera den alveolära makrofag-liknandebefolkningen från de omogna och mogna DC i benmärgen kulturen genom flödescytometri med användning FL-HA-bindning och MHCII uttryck. Detta förfarande är baserat på det fastställda förfarandet av et al Lutz 6 och kan generera 5 -. 10 x 10 6 icke-vidhäftande celler på dag 7 av 10 ml kultur. Kulturen kan användas från dagar 7 till 10 och ger en heterogen population av makrofager, omogna och mogna DC: er, såväl som vissa progenitorer på dag 7. Detta ger en enkel metod för att växa och isolera in vitro alveolar-liknande makrofager i stora mängder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Möss avlivades i enlighet med den kanadensiska rådet om Animal Care riktlinjer för etisk djur forskning förfaranden som godkänts av University of British Columbia Animal Care kommittén.
1. Skaffa en enda cell Benmärgs Suspension från mus lårben och skenben
- Slå på en biologisk säkerhet skåp (BSC) 15 min före start av proceduren för att rensa skåp luft och möjliggöra luftflöde stabilisering, sedan ren / dimma BSC yta med 70% etanol. Hålla allt så sterilt som möjligt för hela protokollet. Klipp inte ben under icke-sterila förhållanden.
- Förbereda dissektion verktyg genom blötläggning i 70% etanol (1 par av dissektion sax, 2 par av tång), Hanks balanserade saltlösning med 5% fetalt kalvserum (HBSS-FCS), sterila petriskålar (100 mm x 15 mm), ett ml sprutor, 26½ gauge nålar, koniska uppsamlingsrör (15 ml eller 50 ml), och pappershanddukar i BSC.
- Euthanize musen med hjälp avprotokoll som godkänts av institutionens djurforskningsetisk kommitté. Sätta i BSC, placera ovanpå en eller två pappershanddukar och spraya musen med 70% etanol.
- I BSC, öppna en steril petriskål aseptiskt, portion 10 ml HBSS-FCS till basen och 1 - 2 ml till locket.
- Placera musen på sin mage med baksidan uppåt och lyfta huden runt bröstkorg delar med fingrarna på icke-dominanta handen. Använd saxen för att göra ett snitt där huden lyfts.
- Håll i båda ändarna av snittet, en ände med varje hand och dra försiktigt isär huden runt musen från tillbaka till magen, fortsätter att dra fram två ändarna av snittet möts på magen.
- Vänd på musen för att magen uppåt, och med en hand dra den nedre halvan av huden ner mot benet, hålla dra tillbaka huden tills benen utsätts för.
- Hålla foten av musen upp och skär akillessenor ovanför fotleden ochligament som förbinder musklerna till foten vid den undre änden av skenbenet med en sax. Detta löser foten från ben ben.
- Håll benet upp av foten, klippa muskler och ligament med en sax runt knäleden vid den nedre änden av lårbenet att bryta lårmusklerna från underbenet. Använd pincett för att försiktigt dra lossade musklerna från fibular och lårbensytor. Se till att inte bryta lårbensartären för att undvika kraftiga blödningar.
- Med en hand som håller på att foten trycker ner öppna sax vid den övre änden av lårbenet i höftleden, rotera benet och dra försiktigt för att separera lårbenet från höftleden när du använder sax för att göra Final Cut till fri benet från kroppen.
- Från denna punkt och framåt, bara hålla vävnaden med steril pincett. Håll i benet i ena änden och dra av foten på den andra.
OBS: Detta bör inte kräva mycket kraft, som anslut ligament skärs i steg1,9. Alternativt, skär tibia strax ovanför vristen där benet är smält. - Hålla benet vid den distala änden av lårbenet med en uppsättning av pincett och proximala änden av skenbenet och vadben med en annan, noggrant böja skenben och vadben i den motsatta riktningen av knäleden för att separera dem från lårbenet och patella.
- Använd pincett för att dra ner de återstående ligament och muskler fortfarande fäst vid den nedre ben ben. Här, ta bort vadben tillsammans med den bindväv med pincett som den är för liten för att spolas för benmärgsceller. Placera den rengjorda tibia på den inverterade petriskål lock.
- Hålla den nedre änden av lårbenet med en uppsättning av pincett och patella med en annan, böj knäskålen och omgivande vävnader i den motsatta riktningen av fogen för avlägsnande. Sedan rensa bort återstående bindväv från lårbenet; dra bort dem med pincett och placera den på den inverterade petriskål lock. Kasta knäskålen.
- Upprepa 1,7- 1,13 med det andra benet vid behov. Överför ben till 1,6 ml mikrocentrifugrör innehållande 1 ml steril HBSS-FCS för transport om det behövs.
- Placera ben på den inverterade petriskål lock, med 1 - 2 ml HBSS-FCS, använder pincett för att rengöra någon vävnadsrester fortfarande sitter i skenbenet och lårbenet, sedan överföra benen till basen av petriskål med 10 ml HBSS- FCS. Alternativt, rengöra benen och ta bort bifogade muskelvävnad med hjälp av en 70% etanol indränkt vävnad.
- Skär varje ben i halv med en sax. Delvis skydda petriskål med en steril lock samtidigt minska för att säkerställa benen stanna i skålen. Alternativt, skär i slutet av varje ben för att möjliggöra spolning i nästa steg.
- Fäst 26½ G nål på en ml sprutan, och upprätta en ml HBSS-FCS från petriskål. Sätt spetsen på nålen i slutet av ett ben bit och spola ut benmärgsceller (mjuk röd vävnad inne ben). Stick in nålen i huvudetav benet och den öppna änden, tills all rödfärgade märgen avlägsnas. Observera ben som vit färg.
- Passera några synliga klumpar av benmärg genom sprutan några gånger för att bilda en enkelcellsuspension.
- Kasta de spolade benen. Använd en 10 ml pipett för att blanda cellsuspensionen väl och överför till provröret. Skölj petriskål en gång med 5 ml HBSS-FCS för att samla in kvarvarande celler i skålen. Placera celler på is.
OBS: benmärgscellsuspension är fortfarande livsdugligt om den förvaras under 2-3 h vid 4 ° C.
2. plätering och odling av benmärgsceller (BMCs)
- Förbered följande reagenser och förnödenheter.
- Förbereda av röda blodkroppar (RBC) lysbuffert genom att göra 0,84% ammoniumklorid i en slutlig lösning av 2 mM Tris, pH 7,2, därefter sterilisera genom filtrering genom ett 0,2 mikron filter.
- Förbereda BMC media genom att tillsätta 10% FCS, 20 mM HEPES, 1x icke-essentiell aminosyra, 55 & #181; M 2-merkaptoetanol, 50 U / ml penicillin och streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, och 2 mM L-glutamin till RPMI-medium 1640.
- Erhålla kommersiellt tillgängligt rekombinant GM-CSF eller använd GM-CSF innehållande supernatanten från Ag8.653 myelomceller som transfekterats med GM-CSF-genen 20. Bestämma koncentrationen av GM-CSF i supernatanten genom ELISA och tillsätt motsvarande 20 ng / ml till BMC media.
- Spinn ner benmärgsceller vid 314 xg under 5 min. Pelleten är röd, på grund av att de röda blodkropparna. I BSC, aspirera supernatanten med en steril glas pasteurpipett ansluten till vakuumsug, lossa pellets genom att trycka, tillsätt sedan 10 ml RBC lyseringsbuffert. Vortex för att återsuspendera cellerna och inkubera i RBC-lys-buffert vid rumstemperatur under 5 min.
- Tillsätt 10 ml HBSS-FCS snurra sedan cellerna vid 314 xg under 5 minuter och aspirera supernatanten. Observera cellpelleten som vit färg. Resuspendera celler i önskad volym av BMC media.
- Räkna Resuspended-celler med användning av en hemocytometer efter färgning döda celler med 0,4% trypanblått.
OBS: Om benmärg från ett ben (enda skenbenet och lårbenet) används, återsuspendera i 5 ml BMC medium, ta 10 pl cellsuspension och späd med 70 pl 0,4% trypanblått, blanda väl och överför 10 pl 1/8 cell utspädning till hemocytometer kammaren. Räkna livskraftiga celler i fyra kvadranter: genomsnittet av de fyra kvadrant räknar x utspädningsfaktor x 10 4 = antalet celler per ml. En lårben och en tibia från ett ben ger i allmänhet ungefär 2-4 x 10 7 celler efter RBC lys. - Uppskatta antalet 10 ml rätter av benmärgsodlingar som behövs för experiment nedströms baserade på det totala antalet celler som behövs för experiment vid slutet av odlingen.
OBS: Varje maträtt kräver 2 x 10 6 benmärgsceller vid initial sådd och ger 5 - 10 x 10 6 celler vid dag 7.- aliquot det totala antalet celler för plätering till ett nytt rör, spinn ner vid 314 xg under 5 min, aspirera supernatanten och återsuspendera celler vid 4 x 10 6 celler / ml i BMC medier.
- Förbereda en ny steril 100 mm x 15 mm petriskål med 9,5 ml BMC media innehållande 200 ng av GM-CSF (rekombinant eller från GM-CSF innehållande supernatanten). Tillsätt 500 | il av de 4 x 10 6 celler / ml benmärgsceller till centrum i petriskålen för den slutliga koncentrationen av 2 x 10 5 celler / ml i 10 ml.
OBS: Det är viktigt att använda en steril petriskål inte en vävnadsodlingsskål. Också, när man lägger till cellerna, se till cellerna förblir koncentrerad i centrum och minimera störningar till skålarna efter sådd och under byte av medium. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2. Detta är dag 0 i kultur. - På dag 3, tillsätt 10 ml av färska BMC medium innehållande 200 ng GM-CSF till varje skål av celler. Var noga med att minimera störningar of cellerna koncentrerade i suspension. Totala volymen av cellkultur är nu 20 ml.
- Observera celler under ljusmikroskop vid 100 gångers förstoring. Observera många icke-vidhäftande celler (runda) och några vidhäftande celler (platta). Celler i grupper om tre eller fyra liknar kronbladen på en blomma kan ses, vilket indikerar spridning.
- På dag 6 utföra en halv media förändring. Försiktigt bort 10 ml av media i en steril 50 ml koniska rör, spinn ner vid 314 xg under 5 minuter, aspirera och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 10 ml färskt BMC medium innehållande 20 ng / ml av GM-CSF, Vortexa försiktigt och tillsätt till den ursprungliga cellkulturskål för en total volym på 20 ml. Observera celler under mikroskop.
OBS: Dag 7 kultur bör vara 70% eller större i konfluens med vidhäftande platta celler och täta moln av runda icke vidhäftande celler.
3. Samla och förbereda BMDC och BMDMs för flödescytometri
- <li> Håll alla buffertar vid 4 ° C.
- Skörda cellerna från dag 7 till dag 10. För att skörda cellerna, första överföring 10 ml av odlings supernatanten till ett 50 ml koniskt provrör, sedan luta skålen vertikalt med cirka 30 grader och tvätta skålen genom att pipettera de återstående 10 ml av kultur från toppen av skålen. Upprepa denna tvätt 5 gånger, varje gång roterande skålen med en tredjedel.
- Överföra de återstående 10 ml av cellerna till samma uppsamlingsröret och kasta plattan och vidhäftande celler.
OBS: De tvättar kommer att ta bort icke-vidhäftande och löst vidhäftande celler; de plana vidhäftande cellerna är resistenta mot de tvättar. Typiskt mellan 5 - 10 x 10 6 icke-vidhäftande celler förväntas från en platta på dag 7 och 2 - 5 x 10 6 celler på dag 10, även om Lutz et al. rapporterade 10 x 10 6 celler på dag 10. De vidhäftande cellerna normalt inte vidtas. Om emellertid dessa celler måste jämföras med de icke-vidhäftande cellerna, Kan de tas bort enligt följande. Tillsätt 5 ml 0,7 mM EDTA i 1 x PBS, pH 7,4 till skålen efter att de icke-adherenta celler avlägsnas, inkubera vid 37 ° C under 5 min, pipettera upp och ner för att avlägsna de adherenta cellerna och samla i ett separat rör. - Centrifugera ner de uppsamlade cellerna vid 314 xg under 5 min och aspirera supernatanten. Resuspendera i 5 ml steril BMC medier vid 4 ° C, vortex försiktigt för att blanda, och räkna med användning av trypanblått och hemocytometer.
OBS: Varje maträtt kommer att ge 5 - 10 x 10 6 icke-vidhäftande celler från en dag 7 kultur. Från och med nu, utföra alla steg vid 4 ° C. - För flödescytometrisk analys, överföring 2 x 10 5 celler för varje prov i 5 ml polystyren med rund botten rör, tillsätt 300 pl FACS-buffert vid 4 ° C (1x fosfatbuffrad saltlösning, 2 mM EDTA och 2% bovint serumalbumin) till varje prov.
- Snurra cellerna ner vid 314 xg under 5 min och aspirera supernatanten. Observera en synlig vit, opak pellet vidbotten av röret.
- Resuspendera cellerna i 100 pl omärkt Fc-receptor Ab för att blockera Fc-receptorbindning (Använd 10/01 supernatanten från 2.4G2 producerande myelomcellinje) och inkubera i 20 min vid 4 ° C. Lägg sedan till 300 pl FACS-buffert till varje prov, försiktigt virvel, sedan snurra celler nedåt vid 314 xg under 5 min och aspirera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 100 pl CD11c-PeCy7 på 0,2 mikrogram / ml, Gr1-Pacific Blue på 0.25 mikrogram / ml, MHCII-APC på 0,05 mikrogram / ml, och FL-HA till cirka 2 mikrogram / ml för att identifiera makrofager och DC.
OBS: FL-HA framställdes i hus med användning av fluorescein och tupp kam hyaluronsyra-natriumsalt som tidigare beskrivits 21. - Inkubera i 20 min vid 4 ° C för att medge bindning till cellytan. Tillsätt 300 pl FACS buffert i varje prov, försiktigt virvel, sedan snurra celler nedåt på 314 xg under 5 minuter vid 4 ° C och aspirera supernatanten. OBS: Om biotinylated antikroppar används i 3,8, upprepa 3,8-9 med fluorescerande streptavidin.
- Tvätta cellerna med en annan 300 pl FACS-buffert, Vortexa försiktigt för att blanda och centrifugera ner cellerna vid 314 xg under 5 min. Aspirera supernatanten och resuspendera cellerna i 200 pl FACS buffert innehållande 0,1-0,2 mikrogram per ml propidiumjodid eller DAPI att märka icke-livsdugliga celler. Cellerna är nu redo för flödescytometrisk analys 22.
OBS: Se resultat och Figur 3 för detaljer om befolkningen och hur cellerna gated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett flödesschema som sammanfattar de viktigaste stegen i denna metod visas i figur 1. Densiteten och morfologin hos benmärgskultur vid olika tider på kultur visas i figur 2. På dag 1, cellerna är små och gles men vid dag 3, det finns fler celler, vissa är större och några har börjat att följa. Vid dag 6 det finns en bestämd vidhäftande och icke vidhäftande fraktionen (Figur 2A). Kulturen kan skördas från dag 7-10 med en högre andel av CD11c + celler som är närvarande vid dag 10. Figur 2B visar den dag 7 kultur före skörd, såväl som de separerade vidhäftande och icke-vidhäftande cellfraktioner. Den vidhäftande fraktionen består av celler kvar efter ljus tvättar som avlägsnar den icke-vidhäftande fraktionen. Den icke-adherenta fraktionen är kraftigt anrikad på celler med en dendritisk morfologi, som kan ses mer tydligt i den digitalt förstoras imåldrar i inläggningar i figur 2B. När väl den icke-vidhäftande fraktionen avlägsnas (dag 7 eller dag 10), är cellerna analyserades med flödescytometri efter märkning med fluorescerande antikroppar mot nyckel cellytemarkörer, såsom beskrivits ovan. Figur 3 visar representativa flödescytometri tomter av den icke-vidhäftande fraktion av kulturen på dag 7 och dag 10.
För identifiering av både makrofager och DC, grind på CD11c + och Gr1 - celler efter första grind på storlek och levande celler (Figur 3A och B). I dag 7 kulturer, den CD11c + Gr1 - är befolkningen i icke vidhäftande cellfraktionen typiskt 60 till 70% av det totala antalet levande celler, och detta ökas till 90% eller mer på dag 10 (Figur 3B). Den CD11c + Gr1 - befolkningen i dag 7 och dag 10 kan delas upp i tre huvudundergrupper med hjälp av MHCII och FL-HA binding: MHCII mitten / låg FL-HA-bindande höga makrofager (P1), MHCII mitten FL-HA bindande låga (P2) -celler innehållande omogna DC, och MHCII hög FL-HA bindande låga mogna DC (P3) (Figur 3C och referens 18 ). FL-HA låg, MHCII låg befolknings (P0) observerades vid dag 7 har visat sig innehålla stamfäder för P1-P3-celler 18. Denna population är inte uppenbart vid dag 10 vilket innebär att ytterligare mognaden av kulturen har inträffat. Detta stöds också av större andel av CD11c celler i kultur samt något högre halter av P2 och P3 DC populationer på dag 10. Figur 3D visar MerTK, anses vara en makrofag markör, uttrycks starkt på både makrofager och omogna DC populationer (P1 och P2), men uttrycks till en lägre utsträckning på mogna DC (P3-celler). Särskilt analys av vidhäftande fraktionen avslöjar närvaron av P0, P1 ochP2 populationer, men inte P3 mogna DC befolkningen (data visas ej). Sålunda makrofager är närvarande i de vidhäftande och icke-vidhäftande fraktioner men bara mogna DC: er är närvarande i den icke vidhäftande fraktionen.
. Figur 1: Ett flödesschema som anger viktiga steg i metoden Primära celler skördas från benmärgen, pläterade och hölls i odling i 7 - 10 dagar när de skördas för användning i ytterligare experiment, renade eller används i FACS-analys. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mikroskopisk undersökning av GM-CSF Derived benmärgsceller. EN) benmärgen kulturen vid dag 1, 3, och 6 visar ökningen i cellantal, förändringar i morfologi och uppkomsten av distinkta vidhäftande och icke-vidhäftande fraktioner. B) Vänster panel visar dag 7 benmärgskultur och den typiska celltätheten. Den mellersta panelen visar dag 7 vidhäftande celler efter skörd av den icke-vidhäftande fraktionen och den högra panelen visar den icke-vidhäftande fraktionen skördades vid dag 7. inläggningar digitalt förstorade bilder av celler i denna fraktion med dendritisk morfologi. Den vita skalan stapel representerar 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representant fenotypen av GM-CSF kultur på dag 7 och dag 10. Icke-vidhäftandeceller från kulturen är märkta med CD11c, Gr1, MHCII, FL-HA, och MerTK på dag 7 eller dag 10 och analyseras för deras fenotyp genom flödescytometri. A) Celler första gated på storlek sedan leva celler. B) visar ett tomt på gated cellerna med CD11c och Gr1 (neutrofila / monocyt markör) och identifierar CD11c + Gr1 - populationen innehåller makrofager och dendritiska celler. Gating på denna population, C) visar flödescytometri tomt på MHCII och FL-HA-bindning, som visar separationen av de alveolära liknande makrofager (P1) från omogna DC (P2) och mogna DC: er (P3), såsom beskrivs i Poon et al. 18. D) Histogram jämför MerTK uttryck mellan P1 (makrofager), P2 (omogna DC), och P3 populationer (mogna DC) vid dag 7 och dag 10. klicka här för att se en större version av denna Figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript, tillhandahåller vi ett förfarande för att generera GM-CSF härledda makrofager och DC: er från en enda mus benmärgskultur som är anpassad från Lutz et al. 6. MHCII uttryck och FL-HA-bindande åtskillnad mellan omogna DC och makrofager i kultur (se figur 3C), som tidigare varit svårt. Detta tillsammans med en annan rapport från Helft et al. 19 visar heterogenitet inom GM-CSF inducerade BMDC kulturer som tidigare ansågs vara endast DC. Et al. Helft 19 används helt olika odlingsbetingelser för att generera BMDCs men också fann en signifikant makrofag befolkning. GM-CSF-inducerade makrofager likna alveolära makrofager och GM-CSF-inducerade DCs likna inflammatoriska DCs, medan FLT3 ligand kompletterat BMDC kulturer producerar klassiska och plasmacytoid DCs 3,4. Olika DC och makrofager populationer också observerats in vivo under homeostatiska och inflammatoriska tillstånd, och det finns mycket diskussion inom vad definierar en DC och makrofager 10. Detta är särskilt sant när det gäller att härstammar från monocyter inflammatoriska DC och detta är också relevant i detta BMC. Det är därför viktigt att använda flera fenotypiska markörer, funktionella data, och eventuellt genexpressionsdata att karakterisera en viss population. Det är också möjligt att dessa in vitro DC och makrofager populationer kan vara ytterligare delas in i följande mer funktionella och fenotypiska markörer upptäcks.
I denna metod, är markörerna CD11c, Gr1, MHCII, och FL-HA används för att skilja makrofager från omogna och mogna dendritceller i den icke-vidhäftande fraktionen av BMC kulturen. Detta skiljer sig från et al. Helft 19, som använde markörer CD11c, CD11b, CD115, CD135, MerTK och MHCII att skilja en makrofag befolkningen från mogna DC. MerTK expressionsnivåer kunde distinguish mellan makrofager (P1) och mogna DC: er (P3), men inte omogna DC (P2) (figur 3D). Således FL-HA och MHCII är användbara markörer för att diskriminera makrofager från både omogna och mogna DC populationer. Dessa makrofager är också funktionellt skiljer sig från DC i BMC kultur och detta framgår mer i detalj på annat håll 18. I korthet, efter LPS-stimulering BMC makrofagerna producerar olika cytokiner än mogna DC och inte aktiverar naiva T-celler 18. Dessa makrofager också liknar alveolära makrofager, både fenotypiskt och funktionellt som både binder FL-HA och uttrycka CD11c, MerTK, CD200R, CD206 och F4 / 80 och efter LPS-stimulering producerar TNF-α ändå inte kan aktivera naiva T-celler 18. Men det finns också skillnader: BMC makrofagerna är CD11b + och har lägre nivåer av Siglec F jämfört med ex vivo alveolar makrofager, vilket tyder på dessa celler är liknande men inte identical till alveolära makrofager.
Det finns flera viktiga åtgärder för att säkerställa framgång för detta protokoll. Det är viktigt att upprätthålla sterilitet från att utsätta benmärgen och framåt. Vid förflyttning in och ut ur BSC, spraya behandskade händer och objekt med 70% etanol. Även om det är bra att skölja verktyg i 70% etanol för att sterilisera, är etanol giftigt för benmärgsceller, så lufttorka verktyg och säkerställa etanolen har avdunstat innan föra ben eller celler i kontakt med dem. Dessutom undvika kontakt mus vävnader eller celler med icke-steril utrustning eller händer under benmärgs skörd. Även om penicillin och streptomycin supplementation är anordnad i media, kan ovarsam hantering av cellerna leda till jäst eller svampkontamination. Eftersom immunceller med fagocytisk aktivitet genereras i denna kultur, mindre kontaminering kan inte detekteras genom att helt enkelt observera cellkulturen mikroskopiskt, är därför det är viktigt att identifiera than skriver för kontaminering. Till exempel kan cellantal minskas och uttrycket av cellaktiveringsmarkörer såsom CD40 och CD86 kan ökas när de analyserades med flödescytometri. Media färg kan också gulna återspeglar en pH-förändring på grund av föroreningar. När kontaminering sker, är BMC kulturen oanvändbar. För att upprätthålla experimentell konsekvens, är det viktigt att skapa en enda cell avstängning från benmärgen genom att vortexa och få en korrekt celltal att ställa in BMC kulturer. Dessutom, om någon bindväv från benet hamnar i en enda cell fjädring, filtrera genom ett sterilt 70 mikron filter för att ta bort den. Typiska cellutbyten för en platta av den icke vidhäftande fraktionen vid dag 7 är mellan 5 - 10 x 10 6 celler. Cellantal är oftast en bra indikation på att protokollet fungerar bra. Med detta förfarande vi brukar få mellan 2-5 x 10 6 celler på dag 10, medan Lutz rapporterar 10 x 10 6 celler. Vi utför RBC lys på the inledande benmärgsceller Protokollet från Lutz et al. inte och så detta steg kan vara frivillig. Variationer i procent av CD11c celler samt siffror och proportionerna av makrofager och DC kan uppstå från olika källor eller partier av FCS och så är det viktigt att testa nya partier av FCS på BMC kulturer konsekventa experimentella resultat. GM-CSF-koncentrationen varierades från 5 ng / ml till 40 ng / ml och detta påverkade inte signifikant cellutbytet. Celltäthet kan också påverka mognaden av kulturen. Exempelvis Helft et al. såddes 1 x 10 7 celler i 4 ml medium som producerade en större andel av celler med hög MHCII uttryck 19. Tidpunkten när celler skördas kan också påverka den procentuella andelen av populationer som finns i den icke-vidhäftande fraktionen. Celler är vanligtvis samlas mellan dagar 7 - 25 till 27 oktober, men vissa studier samla BMCs vid dag 6 19,23,24. Om det behövs fler celler, kultur BMCsi större 150 mm x 15 mm petriskålar i 40 ml vid samma densitet. I detta fall en halv-volym mediaändring görs på både dag 3 och dag 6 (dvs 20 ml medium avlägsnades, celler centrifugerades ner och ersattes med färskt 20 ml medium kompletterat med 20 ng / ml rGM-CSF). Dessa plattor genererar typiskt 3 - 6 x 10 7 celler per skål vid dag 7. FL-HA är en viktig reagens, tillsammans med MHCII, att skilja makrofager från omogna och mogna DC i BMC kulturen. Således när den är gjord, titrera FL-HA för användning på celler är kända för att konstitutivt binda HA såsom alveolära makrofager 18 eller BW5147 T-celler och bekräfta dess specificitet med hjälp av antingen en HA-blockerande CD44 antikropp (KM-81, kommersiellt tillgänglig), omärkt HA eller en CD44 deficient cell. CD11c - GR1 + celler i kulturen kan fungera som en intern kontroll för icke HA-bindande celler, och en fluorescens minus en kontroll (FMO) eller CD44 deficienta BMC kulturer är rekommenderas för noggrann setting av FL-HA-bindande grind.
Även om experiment kan utföras med användning av en heterogen kultur, är det lämpligt att berika för DC eller makrofag population med användning av antingen fluorescensaktiverad cellsortering eller antikroppsbelagda magnetiska pärlor 18 baserat på uttrycket av CD11c, Gr1, MHCII, och HA-bindning. Möjliga försök innefattar stimulering med Toll-liknande receptor agonister såsom LPS för att mäta aktivering och cytokinproduktion, T-cellsaktiveringsanalyser, eller ytterligare karakterisering genom flödescytometri. Till exempel, efter 8 eller 24 h av stimulering, flödescytometri kan användas för att mäta intracellulär färgning för cytokiner och / eller yta märkning av samstimulerande molekyler såsom CD40 och CD86, såsom beskrivs i 18. Intracellulära förfaranden cytokin märknings kräva förbehandling av cellerna med Brefeldin A, som förhindrar utsöndring och tillåter cytokinet för att bygga upp inuti cellen. För T-cellsaktivering analyser involverar loading av ett antigen såsom OVA peptiden genom en antigenpresenterande cell, renade makrofager baserat på MHCII och HA-bindning kommer inte aktivera T-celler medan omogna och mogna DC kommer 18. Det bör noteras att sorteringsförfarandet ensam kan aktivera de dendritiska cellerna i viss utsträckning, vilket gör det viktigt att inkludera negativa kontroller i alla experiment.
Som med alla in vitro-metod, det finns fördelar och nackdelar jämfört med användning av in vivo eller ex-vivo-celler. Nackdelen är att in vitro-härledda celler kanske inte exakt härma in vivo-celler, men de har den fördelen att de kan genereras i tillräckligt antal för att medge funktionell och biokemisk analys, något som ofta inte är möjligt med ex-vivo-celler. Denna metod för makrofager och DC identifiering gör att framtida forskning för att få mer homogena cellpopulationer från en kultur med tidigare underskattad heterogeneity. Som renade makrofager från denna GM-CSF kultur liknar mycket alveolära makrofager från lungan 18, ger det en lämplig källa för alveolära liknande makrofager för in vitro-analys. Till exempel, kan dessa HA-bindande makrofager användas för att screena för läkemedel som modifierar alveolär makrofag funktion och för att undersöka mekanismerna för infektion av Mycobacterium tuberculosis och motstånd. Med tanke på den senaste upptäckten att GM-CSF och M-CSF härledd från benmärg makrofager transplantation kan lindra lung proteinos i möss 28,29, kan denna metod för att identifiera makrofager från GM-CSF kulturer bidra till att öka effektiviteten hos den föreslagna behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) (Grant MOP-119.503) och naturvetenskap och teknik Council of Canada (NSERC). NSERC stödde också sommaranställning till YD och AA YD stöds av University of British Columbia (UBC) med en 4-årig gemenskap utmärkelse, är AA stöds av CIHR med en doktorand magisterexamen award (CGS-M). Vi tackar Calvin Roskelley för hjälp med mikroskop används för att generera bilderna i figur 2. Vi erkänner också stöd från UBC djur och flödescytometri lokaler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al.
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
