Produktion og administration af terapeutiske mesenchymstamceller / Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed i 3-D kulturer Under Xeno-frie betingelser

Abstract

Mesenkymale stamceller / stromale celler (MSC) lover godt i bioteknologi og regenerativ medicin. MSC'er kan isoleres fra flere voksne væv via deres stærke tilslutning til vævsdyrkningsplastic og derefter yderligere ekspanderes in vitro, mest almindeligt ved hjælp af føtalt bovint serum (FBS). Da FBS kan forårsage MSC'er bliver immunogene, dets tilstedeværelse i MSC-kulturer begrænser både kliniske og eksperimentelle anvendelser af cellerne. Derfor beskæftiger undersøgelser kemisk definerede xeno-fri (XF) medier for MSC kulturer er yderst værdifuld. Mange gavnlige virkninger af MSC'er er blevet tilskrevet deres evne til at regulere inflammation og immunitet, hovedsagelig gennem sekretion af immunmodulerende faktorer såsom tumornekrosefaktor-stimuleret gen 6 (TSG6) og prostaglandin E2 (PGE2). Men MSC kræver aktivering for at producere disse faktorer og da effekten af ​​MSC er ofte forbigående, har stor interesse opstået for at finde måder af præ-aktivering cellerne prior deres anvendelse, og dermed fjerne latenstiden for aktivering in vivo. Her præsenterer vi protokoller til effektivt aktivere eller prime MSC i tre-dimensionelle (3D) kulturer under kemisk definerede XF forhold og til at administrere disse præ-aktiverede MSC'er in vivo. Konkret har vi først beskrive metoder til at generere sfæriske MSC mikro-væv eller "sphæroider« i hængende dråber bruger XF mellemstore og vise, hvordan de kugler og konditioneret medium (CM) kan høstes til forskellige applikationer. For det andet beskriver vi genekspression skærme og in vitro funktionelle assays til hurtigt at vurdere niveauet af MSC aktivering i sfæroider, understreger den antiinflammatoriske og anti-cancer potentiale af cellerne. Tredje beskriver vi en hidtil ukendt fremgangsmåde til at injicere intakte MSC sfæroider i musen peritoneale hulrum til in vivo-effektivitet test. Samlet set protokollerne heri overvinde store udfordringer for at opnå præ-aktiverede MSC'er under kemisk defineret XF conbetingelser og giver et fleksibelt system til at administrere MSC sfæroider for behandlinger.

Introduction

Mesenkymale stamceller / stromaceller (MSC'er) har vist stort potentiale for forskellige regenerativ medicin tilgange. MSC'er blev indledningsvis isoleret som et stromal bestanddel af knoglemarv, men er siden blevet opnået fra talrige andre voksne væv, herunder fedtvæv ^{1, 2, 3.} Interessant, den vigtigste isoleringsmetode omfavner den bemærkelsesværdige egenskab af MSC'er til at klæbe fast på vævskulturplast i nærværelse af føtalt bovint serum (FBS). Mens dette traditionelle isolation teknik tillader nem og hurtig ekspansion af MSC'er i todimensionale (2D) kultur, er det også meget kunstige og ignorerer betydningen af det native tredimensionale (3D) miljø, der fører til potentielle tab af vigtige cellulære karakteristika ^{4, 5 6.} Derfor studiet af MSC'er i 3D-kulturer, somer mere fysiologisk end traditionelle 2D kulturer, er opstået i søgning efter "tabte / formindsket" MSC egenskaber. Endvidere har stor interesse steget til identificere xeno-fri (XF) kemisk definerede betingelser for MSC kultur og aktivering, og således gøre cellerne mere medgørlige til kliniske anvendelser.

Mange undersøgelser er blevet offentliggjort viser 3D-kultur af MSC'er både biomaterialer og som sfæriske aggregater eller sphæroider. MSC'er i biomaterialer blev oprindeligt udviklet til væv tekniske tiltag til at erstatte beskadigede væv med celle-seedede stilladser, mens kugleformede kulturer af MSC'er ses som en måde at forstå MSC adfærd in vivo efter administration af cellerne for behandlinger i prækliniske eller kliniske forsøg ^{4, 5, 7.} Interessant, MSC danner sfæroider spontant, når tilslutning til vævskultur plast er ikke tilladt^{8, 9, 10.} Traditionelt blev celle aggregering lettes ved spinner kolbe metoder eller flydende overlay teknikker, metoder oprindeligt anvendt i cancer biologi i bestræbelserne på at forsøge at efterligne tumor mikromiljø. For nylig er yderligere fremgangsmåder dukket at demonstrere celleaggregering i dyrkningsskåle præ-overtrukket med specifikke kemikalier for at forhindre celle-til-plast vedhæftning ^{4, 5, 6.} En af de enkleste og mest økonomiske metoder til at generere MSC sfæroider er at kulturen dem i hængende dråber, en teknik, der ofte blev anvendt til fremstilling embryoide legemer fra embryonale stamceller. Med hængende dråbe dyrkningsteknik, er cellevedhæftning til vævsdyrkningsplastic forhindres ved at suspendere cellerne i en dråbe medium på undersiden af ​​en vævskulturskål låg og tillader tyngdekraften til at lette celle AGGREGation i spidsen af ​​dråben. Sfæroiden størrelse kan let manipuleres ved at ændre cellekoncentration eller drop volumen, hvilket gør hængende dråbe kulturer særlig let at kontrollere.

Tidlige undersøgelser af 3D kultur af MSC'er demonstrerede radikale forskelle i karakteristika for cellerne i 3D sammenlignet med deres 2D modstykker ^{6, 8, 9.} Samtidig, rapporter vist, at de gavnlige virkninger af MSC'er in vivo påberåbes deres evne til at blive aktiveret af mikro-miljømæssige påvirkninger, og som svar, til at producere anti-inflammatoriske og immunmodulerende faktorer ^11. Interessant, mange af disse faktorer, såsom prostaglandin E2 (PGE2), tumornekrosefaktor-stimuleret gen 6 (TSG6), og hepatocytvækstfaktor (HGF) blev produceret i meget større mængder af MSC sfæroider end traditionelle 2D MSC'er baner vejen for den ide omved hjælp af 3D-kulturer for at aktivere cellerne ^{8, 12, 13.} Desuden genaktivering i 3D-kulturer syntes at rekapitulere mekanismer, i det mindste delvist, af celleaktivering efter injektion i mus ^12. Ved at aktivere MSC'er forud for deres anvendelse i eksperimenter, kan virkningerne af cellerne blive forlænget og mere fremtrædende som den traditionelle MSC effekt in vivo ofte er forsinket og forbigående, og kan beskrives som "hit og køre". I løbet af de sidste mange år har vigtige funktionelle undersøgelser under anvendelse af MSC sfæroider vist, at de kan undertrykke inflammatoriske responser og modulerer immunitet in vivo ved at påvirke effektorceller såsom makrofager, dendritiske celler, neutrofiler, og T-celler gør sfæroider en attraktiv form for primede MSC'er ^{2 3.} Desuden produktion af anti-cancer molekyler, såsom interleukin-24 (IL-24) og tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL), forhøjes i 3D kulturer af MSC'er i forhold til monolag MSC'er, et fænomen, der kan udnyttes til målrettede behandlinger mod kræft ^{8, 10, 14.}

Som den traditionelle MSC kultur ikke blot krævede anvendelse af vævskultur plast, men også FBS, til en anden hurdle gøre MSC sfæroider mere medgørlige til klinisk anvendelse skulle overvindes. For at løse dette hurdle, vi for nylig viste dannelse af MSC spheroids under specifikke kemisk definerede XF forhold og konstateret, at de resulterende MSC sfæroiderne blev aktiveret til at producere de samme anti-inflammatoriske og anti-cancer molekyler som sfæroiderne genereret i forhold med FBS ^14. Her er disse resultater præsenteres i flere detaljerede protokoller, der viser dannelsen af ​​præ-aktiverede MSC'er i 3D kulturer bruger XFmedier. Desuden er protokoller præsenteret som beskriver effektive måder til at vurdere aktivering niveauer af MSC'erne i forhold til deres anti-inflammatoriske, immunmodulerende og anti-cancer effekt, sammen med en praktisk metode til at levere de intakte sfæroider i mus.

Protocol

1. MSC Isolering og Udvidelse

1. Opnå tidlige passage MSC fra center for udarbejdelse og distribution af voksne stamceller ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~number=plural ) ¹⁵ som frosne hætteglas. Alternativt isolere MSC fra knoglemarvsaspirater efter en rutinemæssig protokol ¹⁴ og gemme så frosne hætteglas.
2. Forbered komplet dyrkningsmedium (CCM), der er minimalt essentielt medium alfa (aMEM) suppleret med 15-20% præmie vælge FBS, 2 mM L-glutamin og 1 x penicillin-streptomycin. Sterilisere mediet ved filtrering.
3. Anbringes 30 ml CCM i et 150 mm cellekultur skål og inkuberes skålen i 30 minutter ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende _5% CO2.
4. Inkubér den frosne hætteglas indeholdende ca. 10 ⁶ MSC'er i 2 min i et 37 ° C vandbad.
5. Overfør indholdet af hætteglasset til dyrkningsskålen ved anvendelse af en 5 ml serologisk pipette og vaske hætteglasset flere gange med 1-2 ml CCM fra skålen for at fange resterende celler. Sæt fadet natten over i en passende inkubator.
6. Vask omhyggeligt kultur to gange med stuetemperatur phosphatbufret saltvand (PBS) og tag MSC'erne med 3 ml forvarmet 0,25% trypsin / ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opløsning. Detachment tager normalt ca. 3-4 min i inkubatoren.
7. Neutralisere trypsin i skålen med 6 ml CCM præ-opvarmet til 37 ° C, og overføre cellesuspensionen i en 50 ml konisk rør. Kombiner med vaske med PBS for at maksimere celleudbytte.
8. Centrifugeres cellerne (450 xg) i 10 minutter ved stuetemperatur og aspirere supernatanten.
9. Resuspender cellerne i et lille volumen CCM og tælle de levedygtige celler under anvendelse af et hæmocytometer og trypanblåt.
10. Seed et passende antal 150 mm skåle på 100 celler / cm ²
11. Cellerne høstes som ovenfor med trypsin / EDTA og kombinere alle cellerne i en enkelt konisk rør med det passende medium. Centrifuge igen og re-suspendere cellerne i et lille volumen af ​​det samme medium for celletal. Brug standard CCM (indeholdende FBS) eller forskellige kommercielt tilgængelige XF medieformuleringer, her benævnt XF medium-1 (XFM-1) og XF-medium-2 (XFM-2), både med og uden human serum albumin (HSA, 13 mg / ml) tilskud.

2. Udarbejdelse af Aktiveret MSC Spheroids i 3-D Hanging Drop kulturer under XF Betingelser

1. For at generere sfæroider af ca. 25.000 celler fortyndes de høstede MSC'er i CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2, eller XFM-2 + HSA (13 mg / ml) ved 714 celler / pl.
2. Pipette 35 pl / dråber af celler påundersiden af ​​en 150 mm inverteret dyrkningsskål låg. Flere dråber kan let pipetteres ved anvendelse af en multikanalpipette.
   BEMÆRK: Hvis der ønskes større eller mindre sfæroider, ændre celle koncentration eller drop volumen (25-45 pi) korrekt.
3. Overfør 20 ml stuetemperatur PBS i bunden af ​​skålen og i en kontinuerlig og stabil bevægelse flip låget, der indeholder dråberne, så drop spidser vender nedad. Sæt låget forsigtigt på bunden af ​​dyrkningsskålen.
4. Overfør fadet ind i kuvøse i 3 dage uden at forstyrre det at tillade passende sfære forsamling.
5. Efter 72 timer, begynder klumpformet høst ved at fjerne låget omhyggeligt og vende den, så dråberne igen, vender opad.
6. Vinkel låget til ca. 10-20 ° og skub dråberne, indeholdende sfæroiderne, til pladen kanten med en celle løfteren.
7. Overfør kugler og medium i en 15 ml konisk rør med en 1.000 pi rørtte. Brug stuetemperatur PBS og pipetten med den samme spids til vask af pladen og sikre maksimal genvinding af sfæroider.
8. For real-time PCR assays (protokol 3), centrifugeres sfære suspensionen ved 450 xg i 5 minutter ved stuetemperatur og aspirere supernatanten. Vask sfæroiderne med PBS og gentag både centrifugering og aspiration trin. For levering til dyr (protokol 8), tillader kugler til afvikling i bunden af ​​røret (~ 3-4 min) uden centrifugering.

3. Real-time PCR af anti-inflammatoriske og anti-cancer Markers

1. Brug RNA-ekstraktion kit med homogenisator søjler og RNase-Free DNase sæt til isolering DNA-fri totalt RNA fra monolag MSC'er (protokol 1), og MSC sfæroider (protokol 2), der blev vasket med PBS og centrifugeret.
2. Lyse mindst 100.000 monolag MSC'er og 20 sfæroider fra hver tilstand i separate 15 ml koniske rør med RLT buffer indeholdende β-mercaptoethanol (1: 100).
3. Transfer de grundigt blandede lysater i 1,5 ml RNase-fri rør og anbringes i en fryser (-80 ° C) i mindst 3 timer til støtte i klumpformet lyse.
4. Optø cellelysater på is, vortex kortvarigt, og følg producentens anvisninger til RNA isolering ved hjælp af en kommercielt tilgængelig pattedyr total RNA isolation kit.
5. Kvantificere og vurdere kvaliteten af ​​det isolerede RNA ved anvendelse af et spektrofotometer.
6. Brug High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit eller tilsvarende i henhold til producentens anvisninger til at generere cDNA for real-time PCR.
7. Placer cDNA prøver, kommercielt designet real-time PCR-primere / prober (Gene Expression assays), og PCR Master Mix på is. Brug primere / prober til GAPDH (kontrol), PTGS2 (COX-2, anti-inflammatorisk), TNFAIP6 (TSG6, anti-inflammatorisk), TRAIL (anti-cancer), og IL-24 (anti-cancer).
8. Forbered real-time PCR-reaktioner ifølge producentens instruktioner til genekspression assays og Fast UniveRsaI Master Mix.
9. Følg retningslinjerne for real-time PCR instrument til at skabe eksperiment-dokumenter og udføre kørslen.
10. Analyser data ved hjælp af metode ΔΔC _T ved at beregne de relative ændringer (relativ mængde, RQ) i genekspression ved hjælp GAPDH som de endogene kontrol og monolag MSC som en baseline ^{8, 14.}

4. Indsamling af CM for Analyser af immunmodulatorisk og Anti-cancer Potential

1. Høst sfæroiderne og CM, som beskrevet ovenfor i en 15 ml konisk rør, ved hjælp af en celle løfteren og en pipette, dog ikke vaske fad låg med PBS, da dette vil udvande CM.
2. Centrifuger ved 450 xg i 5 minutter ved stuetemperatur, omhyggeligt indsamle den cellefrie supernatant med en pipette, og overfør supernatant i 1,5 ml rør.
3. Centrifuger ved 10.000 xg i 5-10 min ved stuetemperatur, omhyggeligt indsamle clarified CM med en pipette, og overføre CM i nye 1,5 ml rør til opbevaring i en fryser (-80 ° C). Forbered portioner af CM før frysning, når du bruger det for flere analyser.
   BEMÆRK: Før udførelse downstream assays, PGE2-koncentration, en god indikator for antiinflammatorisk potentiale CM, kan bestemmes ved anvendelse af et kommercielt ELISA kit ifølge producentens instruktioner. TSG6 koncentration kan bestemmes ved anvendelse af en offentliggjort protokol ^14.

5. makrofag Assay at Vurdere Anti-inflammatoriske potentiale MSC-CM

1. Forbered makrofag medium, som består af Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende L-alanyl-L-glutamin og suppleret med 10% præmie vælge FBS og 1 x penicillin-streptomycin. Filter-sterilisere mediet.
2. Opnå en frossen hætteglas med ca. 10 ⁶ J774 musemakrofager og inkuber hætteglasset i 2 minutter i et 37 ° C vandbad.
3. Aspirer supernatanten, suspendere makrofagerne i 1 ml makrofag medium, og overfør makrofager i en 150 mm petriskål indeholdende 30 ml makrofag medium.
4. Skift medium hver 2 dage og inkuber cellerne i inkubatoren indtil ca. 70-80% sammenflydende.
   BEMÆRK: makrofager ikke klæber tæt til petriskålen, således bør det sikres ikke at miste celler med medium forandring.
5. Høst makrofagerne ved sprøjtning af makrofag medium på cellerne med en pipette. Overfør cellerne i et 50 ml konisk rør og centrifugeres i 5 minutter ved 200-300 xg og stuetemperatur.
6. Aspirer supernatanten og suspenderer cellerne i et lille volumen af ​​makrofag medium til celletællinger med et hæmocytometer. Juster koncentrationen til 200.000 celler / ml med makrofag migDIUM.
7. For at starte sat op til makrofag assay, tilsættes 480 ul makrofag medium til brønde på en 12-brønds plade.
8. Tilsæt 20 pi makrofag medium i ikke-stimulerede kontrolbrønde og 20 pi af ikke-condition eller MSC-medium, fremstillet ovenfor, i eksperimentelle brønde. Bland mediet i brøndene ved at trykke på pladen.
9. Overfør 500 pi af makrofag cellesuspensionen til de ikke-stimulerede makrofager kontrolbrønde.
10. Stimulere de resterende makrofager med tilsætning af 1: 500-1: 1000 af 0,1 mg / ml lipopolysaccharid (LPS) og inkuberes 5-10 minutter ved stuetemperatur.
11. Overfør 500 pi de stimulerede makrofager i brøndene med ikke-condition eller MSC-medium. Bland brøndene ved støt rokkende pladen flere gange.
12. Overfør pladen til en inkubator i 16-18 timer.
13. Harvest makrofag-konditioneret medium og centrifugeres ved 500 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
14. Overførselsupernatanten i nye rør og analyse for tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) og interleukin-10 (IL-10) af kommercielle ELISA-kits ifølge producentens anvisninger.

6. splenocyt Assay at Vurdere Immunmodulatorisk potentiale Sfæroide-CM

1. Forbered komplet splenocyt medium, som består af Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) -1640-medium suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS, 1x penicillin-streptomycin og 2-mercaptoethanol. Filter-sterilisere mediet.
2. Harvest milt fra eutaniseret-BALB / c-mus gennem et snit fremstillet på venstre side af maven over milten, omtrent halvvejs mellem for- og bagben ^14. Overfør milten til en 70 um cellefilter at isolere splenocytterne ^14.
3. Isoler de splenocytter / lymfocytter ved at skubbe milten gennem 70 um si i en steril petriskål using den blød gummi / plast ende af et stempel fra en 2-3 ml sprøjte ^14. Brug en slibning cirkulær bevægelse for at dissociere milten.
4. Vask cellesigte flere gange med kold PBS og overføre cellerne fra petriskålen i en 50 ml konisk rør. Fyld røret med kold PBS og centrifuger (500 xg) ved 4 ° C i 10 minutter.
5. Aspirere supernatanten og rydde cellerne fra erythrocytter ved inkubation med 5-10 ml lyse af røde blodlegemer opløsning (per milt) i 5-10 minutter.
6. Stop lysis ved tilsætning kold PBS til røret og centrifugeres i 5-10 minutter ved 500 xg og ved 4 ° C.
7. Suspendere isolerede celler i fuldstændig splenocytpopulation medium, filtreres gennem et 40 um si, og tælle cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Tilføj splenocyt medium til cellesuspensionen for at opnå en endelig cellekoncentration på 10 ⁶ celler / ml
   BEMÆRK: Denne teknik typisk giver ca. 3 x 10 ⁷ splenocytter per mus milt.
BEMÆRK: Mængden af ​​splenocytter krævede afhænger af antallet af eksperimentelle betingelser, som fastlægges af investigator (se trin 6.9). For hver eksperimentel prøve / brønd, er 10 ⁶ splenocytter påkrævet.
8. Overfør 10 ⁶ splenocytter (stimulerede eller ustimulerede) i brønde i en plade med 12 brønde, og der tilsættes ikke-konditioneret (kontroller) eller MSC-CM i brønde på slutfortynding på 1: 10-1: 20.
9. Harvest splenocytpopulation CM efter 24 timer og centrifugeres ved 500 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
10. Supernatanten overføres til nye rør og assay for interferon gamma (IFN-γ) indhold ved kommercielt ELISA-kit ifølge producentens instruktioner.

7. Prostatakræft Assay at Vurdere Anti-cancer potentiale Sfæroide-CM

1. Forbered komplet RPMI vækstmedium, der er RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS, 1x penicillin-streptomycin.
2. Opnå en frossen hætteglas med LNCaP prostatacancerceller og inkuber hætteglasset i 2 minutter i et 37 ° C vandbad.
3. Overfør indholdet af hætteglasset til en dyrkningsskål indeholdende 30 ml komplet RPMI vækstmedium under anvendelse af en motoriseret pipette og en 5 ml serologisk pipette. Vask hætteglas flere gange med mediet fra fadet og sæt fadet i kuvøse.
4. Lige før cellerne når sammenflydning, vaskes kulturen to gange med stuetemperatur PBS og frigøre LNCaP-celler med 3 ml forvarmet 0,25% trypsin / EDTA-opløsning.
5. Neutralisere trypsin i skålen med komplet RPMI vækstmedium og overføre cellerne sammen med vaske i en 50 ml konisk rør.
6. Centrifugeres cellerne ved 450 x g i 10 minutter ved stuetemperatur og aspirere supernatanten.
7. Genopslæmmes cellerne i lille volumen af ​​komplet RPMI vækstmedium og tælle cancercellerne ved anvendelse af et hæmocytometer.
8. For at udføre en cellevækst-assay under anvendelse af et celleproliferationsassay kit, aspireres mediet fra brøndene og overføre pladen til en fryser (-80 ° C) i mindst 3 timer.
   1. Optø pladen og lysere cellerne i hver brønd ved tilsætning af 100 pi cellelysis reagens indeholdende 180 mM NaCl, 1 mM EDTA og 0,2 mg / ml RNase A.
   2. For en standardkurve, lyse kendte mængder af LNCaP-celler som beskrevet ovenfor.
   3. Efter 1 time tilsættes 100 pi 1x celle lysis buffer indeholdende 1: 100 fortynding af celleproliferation assayreagens og måle fluorescensen i hver brønd for at bestemme celle beløb.

8. Intraperitoneal Levering af intakte Sfæroider

1. Forbered sfæroide MSC'er som beskrevet ovenfor (protokol 2) og resuspender than sfærer i sterilt Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) suppleret med 0,2-0,5% HSA for at opretholde XF betingelser. HSA i opløsningen hjælper til at forhindre sfære adhæsion til plast under injektion.
2. Overfør 40-120 sfæroider i 15 ml koniske rør og vask af cellerne ved tilsætning af 6 ml HBSS / HSA til rørene. Tillad 3-4 min for kugler til at stige ned. Forbered en uafhængig konisk rør af sfæroider for hvert dyr. Også forberede yderligere rør af spheroids for analyser bestemmer klumpformet fastholdelse (se 8.18 nedenfor) og produktion af terapeutiske faktorer efter overførsel (se 8.19 nedenfor), hvis det ønskes.
3. Aspirere supernatanten, overlay sfæroiderne med 100-200 ml steril HBSS suppleret med 0,2-0,5% HSA, og placere rørene på is.
4. Kort fortalt bedøver dyrene med 2% isofluran i 100% oxygen, indtil forsvinden af ​​pinch-tå refleks i ca. 2 min i induktionen kammeret.
5. Placer dyret inde i BSL-2 kabinet, dorsal Aspect ned (ventrale side opad), med den kontinuerlige strøm af blandingen 1,5% isofluran / oxygen via en næsekegle.
6. Rengør lavere mus maven med en antiseptisk såsom 70% alkohol.
7. Fjern hætten af ​​20 G intravenøs (iv) kateter og udfører intraperitoneal injektion med kateteret-stilethæl forsamling. Brug den ene hånd til at holde musen hud og en anden til at udføre injektionen. Find indstikssted omtrent i midten af ​​en kunstig linie, der forbinder et bøjet knæled og genitale område med nålespidsen peger mod midterlinjen.
   BEMÆRK: kateter-stilethæl samling har en højere modstand end en almindelig nål, derfor pleje skal tages for ikke at injicere nålen for dybt ned i maven, hvilket kan resultere i skader på indre organer. Penetration af huden og derefter muskler / peritoneale membran kan mærkes under kateteranbringelse.
8. Fjern forsigtigt metal stilethæl / nål fra kateteret-stilethæl forsamling. CHECk stiletten for blod, urin og afføring, og kassér den. Blod på nålen angiver punktur af indre organ (er).
9. Hold plastkateter i oprejst position under injektionerne for at tillade fluidstrømning.
10. Bekræft den korrekte placering af plast kateter ved at injicere ca. 100 pi sterilt HBSS / HSA gennem katetret med en pipette med en 100-200 ml spids. Anbring enden af ​​pipettespidsen inde i kateteret sprøjteadapteren danner en tæt forsegling. Injicer langsomt væsken i bughulen.
    BEMÆRK: væske i en korrekt placeret kateter vil strømme frit inde i bughulen med kun mindre justering af kateteret. Forkert placering af kateteret (subkutan eller intra-tarm, eller hvis spidsen af ​​nålen skadet peritoneale organer såsom nyrer) vil øge modstanden og reducere strømning. Subkutan placering vil resultere i en dannelse af en indlysende "boble" under huden.
11. Saml than MSC sfæroider, tilberedt i 100-200 ml HBSS / HSA (trin 8,3) ved anvendelse af en 200 pi pipettespids, og overføre hele mængden af ​​kugler (40-120 kugler) ind i bughulen gennem katetret som beskrevet ovenfor.
12. Vask rør indeholdende kugler med 100 pi HBSS / HSA anvendelse af den samme spids som ovenfor for at opsamle eventuelt resterende sfæroider, og indsprøjtes i bughulen.
13. (Valgfrit) indsprøjtes yderligere 100 pi HBSS / HSA i bughulen til at vaske kateteret.
14. Placer gaze vædet i antiseptisk over kateteret og langsomt fjerne kateteret fra bughulen og kassér den.
15. Masser blidt bughulen med fingrene for at sikre jævn fordeling af sfæroiderne.
16. Lad dyret komme sig under tæt overvågning og se til blødning fra injektionsstedet.
17. Undersøg kateteret og 15 ml rør til eventuelle resterende sphæroider. Det er normalt at observere et par kugler ikateter / rør.
    BEMÆRK: beskrevet for MSC klumpformet levering teknik kan godkendt til brug i normale dyr eller i en række forskellige beskadigelsesmodeller. Denne teknik er med succes blevet anvendt til at injicere sfæroider i muse hornhindeskade og endotoksæmi modeller, såvel som i en zymosan-induceret peritonitis model ^8.
18. For at kvantificere antallet af tilbageholdte sfæroider (ekstraudstyr), skal du bruge en DNA-baseret celle nummer kvantificering kit / reagens. Hold anvendte kateter over 15 ml rør og kraftigt dispensere HBSS / HSA gennem kateteret for at tvinge eventuelle resterende kugler tilbage i 15 ml rør.
    1. Centrifugeres 15 ml rør ved 500 xg i 5 minutter ved stuetemperatur og aspirere supernatanten. Overfør rør indeholdende sfæroiden pellet i en fryser (-80 ° C) i mindst 3 timer.
    2. Optø røret og lyserer kuglerne ved tilsætning af 500 pi cellelysis reagens indeholdende 180 mM NaCl, 1 mM EDTA og 0,2 mg / ml RNase A.
    3. For en kontrol, freeze og lyserer en kendt mængde sfæroider (fortrinsvis svarende til antallet af sfæroider forberedt til en enkelt injektion) som beskrevet ovenfor.
    4. Efter 1 time overføre 100 pi cellelysatet, i to eksemplarer, i en 96-brønds mikroplade og tilsættes til hver brønd 100 pi 1x cellelyse-buffer indeholdende en 1:50 fortynding af celleproliferationsassay reagens fra kittet. Efter 10 min måle fluorescensen i hver brønd for at bestemme antallet af kugler, der ikke blev injiceret ved at sammenligne den eksperimentelle prøve (r) med kontrolprøven.
19. Vurdere aktivering niveau sfæroider forberedt til injektion (ekstraudstyr) ved at måle koncentrationen af ​​PGE2 og TSG6 produceret af overførte sfærer. Overførsel 40-120 kugler gennem kateteret, som beskrevet ovenfor, i en 12-brønd eller 6-brønds plade indeholdende 1 eller 2 ml aMEM suppleret med 2% FBS og 1 x penicillin / streptomycin. Placer pladerne i inkubatoren i 6 timer.
    1. Overfør mediet frabrøndene efter 6 timer i 1,5 eller 15 ml rør og centrifugeres rørene ved 450 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
    2. Overfør den cellefrie supernatant i friske 1,5 ml rør med en pipette og centrifugeres ved 10.000 xg i 5-10 minutter ved stuetemperatur.
    3. Overfør den klarede CM (supernatant) i nye 1,5-ml rør og assay for PGE2-koncentration (god indikator for antiinflammatorisk potentiale cm) under anvendelse af et kommercielt ELISA kit ifølge producentens instruktioner. TSG6 koncentration kan bestemmes ved anvendelse af en offentliggjort protokol ^14.

Representative Results

I den nuværende arbejde, blev hængende dråbe kulturer ansat til at generere kompakte sfæriske mikro-væv eller "sphæroider" af aktiverede MSC under XF betingelser. Det undersøgte køreplan i Figur 1 viser, at MSC opfordres til selv at samle ind sphæroider når suspenderet i hængende dråber i 72 timer, hvorefter sfæroiderne eller CM fyldt med kugle-afledte terapeutiske faktorer, kan opsamles og potentielt udnyttes i både forskning og kliniske anvendelser. Det store antal celler, der er nødvendige for kugle produktion kan erhverves inden for en uge ved podning MSC'erne ved lav densitet, typisk 100-200 celler pr ^cm2, og derefter udvidelse af cellerne i 6-7 dage indtil ca. 80% sammenflydende (figur 2 ). Celle vækstkinetik, bestemt ved at tælle levedygtige celler dagligt, viste, at en robust ekspansionsfase (dag 3-7) følger en kort forsinkelsesfase på 1-2 dage (figur 2C </ Strong>). MSC'er i passage 2 eller 3 giver typisk 50-100 millioner celler fra et enkelt hætteglas på 1 million kryopræserverede celler ved dyrkning i CCM.

Efter ekspansion og høst, er MSC'erne ophængt ved høj celle koncentration at generere sfæroider, typisk 500-1.000 celler pr gl. Hængende dråbe-kulturer fremstilles ved at overføre 25-40 ul dråber af medium indeholdende MSC'erne på undersiden af en cellekultur skålen låg, som efterfølgende vendes, og passende placeret på bunden af skålen (figur 3). Når det suspenderes i 35 pi dråber CCM på 714 celler pr pi (dvs. 25.000 celler pr dråbe), MSC'er først samles til små aggregater, som til sidst flyder sammen til at generere en enkelt kompakt kugle ved 72 timer i spidsen af dråben (figur 3C). Sfæroider også dannes over 72 timer i flere typer af kommercielt tilgængelige XF medier optimeret til MSC ekspansion, Her benævnt XFM-1 og XFM-2. Dog dannes enkelte kompakte kugler i XFM-1 kræver tilskud af 13 mg / ml humant serumalbumin (HSA), en koncentration, som afspejler det skønnede samlede proteinindhold i CCM (figur 3D). Enkelte kompakte kugler ikke let dannes i grundlæggende XFM-1 uden HSA eller protein-fri aMEM (figur 3D). Under sfære samling, MSC fænotype ændringer radikalt (figur 4), og hvornår i passende kemisk definerede XF medium (dvs. XFM-1 + HSA), ekspression af talrige anti-inflammatoriske faktorer opreguleres herunder PGE2 og TSG6 (figur 4C). Men produktionen af TSG6 og PGE2 er ikke markant forøget i MSC dyrket som kugler i XFM-2 eller XFM-1 uden HSA (figur 4C). Især disse antiinflammatoriske faktorer samt anti-cancer faktorer TRAIL og IL-24, blev stærkt opreguleret i kugleformede MSC'er i forhold til monolag MSC'er, når than sfærer blev dyrket i XFM-1 suppleret med enten rekombinant HSA (rHSA) eller klinisk kvalitet HSA (cHSA) fremstillet ud fra humant blod (figur 4D).

For at evaluere den terapeutiske potentiale af MSC kugler udarbejdet i forskellige medier formuleringer er flere praktiske forsøg udført (figur 5). Immun-modulerende egenskaber sfæroider er først bestemt in vitro ved at måle virkningerne af kugle CM på niveauer af cytokiner produceret af LPS-stimulerede makrofager og CD3-stimulerede splenocytter / lymfocytter (figur 5). CM fra MSC sfærer dyrket i CCM og XFM-1 / HSA markant undertrykt produktion af makrofag TNFa og splenocyt IFNy, mens på samme tid forøgede niveauer af anti-inflammatoriske cytokin IL-10 (figur 5A og 5B). De anti-cancer egenskaber af kugler vurderes ved at måle virkningerne af kugle CM on vækst og morfologi af LNCaP-prostatacancerceller. XF medium XFM-1 / HSA reduceres effektivt LNCaP proliferation ligner FBS-holdigt CCM (figur 5C og 5D).

Vigtigt er det, kan intakte MSC sfærer indgives i bughulen af mus til at teste anti-inflammatoriske aktivitet af cellerne in vivo (figur 6). Til disse eksperimenter er sfærer fremstillet til injektion i HBSS indeholdende en lav koncentration af HSA, hvilket minimerer deres adhæsion til plastrør og samtidig bevare en XF tilstand. Efterfølgende kan sfærer let injiceres efter skift fra opsamlingsrøret (figur 6A), ved anvendelse af en pipette (figur 6B), gennem en nål / katetersamling (figur 6C og 6D) passende positioneret for en standard intraperitoneal injektion. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde, kan MSC sfæroider regelmæssigtoverført på en effektivitet på over 90% (figur 6E og 6F) uden at forstyrre deres integritet (figur 6G og 6H). Ukorrekt positionering af kateterspidsen inden bughulen fører til dårlig sfære levering og høj retention (fig 6F). Vigtigt er det, kan niveauet af kugle tilbageholdelse i pipette / kateter kvalitativt bestemmes ved visuel inspektion, eller kvantitativt ved at indsamle / lysere de tilbageholdte kugler og målecelle nummer med en kommercielt tilgængelig DNA-baseret celle kvantificering reagens / kit (figur 6F). Post-injektion sfære fastholdelse analyse med til at skabe inklusion / udelukkelseskriterier under eksperimenter. Især er evnen til CCM og XFM-1 / HSA sphæroider at udskille høje niveauer af TSG6 og PGE2 vedligeholdes mindst 6 timer efter overførsel af kuglerne fra hængende dråbe kulturer (Figur 6i). Svarende til deres in vitro effekter, XFM-1 / HSA kugler injiceret i bughulen af mus, umiddelbart efter induktion af systemisk inflammation ved iv administrering af LPS, forstærkede PGE2 og IL-10 niveauer i peritoneum mens faldende proinflammatorisk TNFa (Figur 6J).

Figur 1: Skematisk fremstilling af platformen udviklet til at udnytte secretome af MSC'er primede som sfæriske mikro-væv under XF betingelser. Efter ekspansion som monolagskulturer (1), er MSC'erne suspenderet i hængende dråber fra låget af en dyrkningsskål (2) ved høj cellekoncentration at aktivere / prime cellerne. Efter 72 timer, både (3) konditioneret medium (CM) og (4) intakte sfæroider kan høstes fra dråberne og anvendt i forskellige efterfølgende anvendelser. CM er rig på immunmodulerende faktorer samt andre terapeutiske kompenser. De kompakte sfæroider, der dannes i hængende dråber kan let overføres ved anvendelse af en pipette (5) og effektivt indgives in vivo via en (6) kateter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Vækst karakteristika for knoglemarvafledte MSC'er i monolagskulturer. MSC'er i passage 2 blev podet ved lav densitet (100 celler pr cm ²⁾ i 15 cm skåle (15.000 celler pr skål) og dyrket i 7 dage i CCM. Medium blev ændret på dag 3 og derefter igen på dag 5 eller 6 (24-48 timer før høst). Repræsentative fasekontrast mikrografier af MSC'er 3 dage (A) og 7 dage (B) efter udpladning af cellerne. Scale bar = 200 um. (C) Vækst kinetik MSC'eropnået fra 3 donorer blev bestemt ved at tælle antallet af levedygtige vedhæftende celler dagligt fra dag 2 til dag 7. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Fremstilling af hængende dråbe-kulturer til priming MSC sfæroider i XF-medium. (A) fotografi, der viser teknikken til hurtigt lag hængende dråber på undersiden af en vævskulturskål låg. (B) Foto illustrerer hængende dråber efter inversion og positionering af låget på fadet base. (C) Tidsafhængige ændringer i sammenlægning af 25.000 MSC i en hængende dråbe som visualiseres ved fase-kontrast mikroskopi. Målet var fokuseret på spidsen af ​​dråben. Scale bar = 500 um. (D) ImaGES af MSC sfærer dannet efter 3 dage i hængende dråbe kulturer under anvendelse af forskellige medieformuleringer herunder aMEM med og uden FBS (dvs. CCM), XFM-1 med og uden HSA, og XFM-2 med og uden HSA. Scale bar = 200 um. Data i panel D blev opnået fra den oprindelige artikel med tilladelse fra udgiveren ^14. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Evaluering af MSC-aktivering i 3-D XF kulturer. (A) Spheres / CM høstes efter 72 timer ved at invertere / vippe skålen låg og tvinger dråberne til kanten med en celle løfteren. Spheres samlet af 25.000 celler kan nemt visualiseres under indsamlingen. (B) Fotografi af indbyrdeskring 500 kugler indsamlet fra låg talrige vævskulturplader. Spheres hurtigt ned til bunden af ​​røret uden centrifugering. (C) Level of PGE2 udskilt fra MSC sfærer efter 72 timer blev målt ved ELISA. Real-time RT-PCR blev anvendt til måling TSG6 niveauer. Både TSG6 og PGE2 er værdifulde markører til screening MSC aktivering i sfæroider. Den XF medium XFM-1 + HSA viste højt niveau af PGE2 og TSG6 produktion (røde kasser). Data er vist som middelværdi ± SD og blev analyseret ved t-test (*** p <0,001 sammenlignet med aMEM prøve). (D) PGE2 ELISA og real-time RT-PCR assays på kugler fremstillet i CCM og XFM-1 suppleret specifikt med 13 mg / ml rekombinant HSA (rHSA) eller klinisk kvalitet HSA (cHSA) fremstillet ud fra humant veneblod. Fold ændringer blev bestemt ud fra adhærerende monolag MSC'er (RQ = 1). Data er vist som middelværdi ± SD og blev analyseret ved t-test (** p <0,01, *** p <0,001 sammenlignet medmonolag MSC'er). Nogle data i paneler C og D blev opnået fra den oprindelige artikel med tilladelse fra udgiveren ^14. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: In vitro funktionelle assays til evaluering af anti-inflammatoriske og anti-cancer egenskaber af MSC-CM indsamlet fra hængende dråbe kulturer. (A) Repræsentative resultater fra ELISA viser virkningerne af kugle CM (CCM og XFM-1 / HSA) om produktion af TNF og IL-10 ved LPS-stimulerede muse makrofager (MQ). (B) Repræsentative resultater fra ELISA viser virkningerne af kugle CM (CCM og XFM-1 / HSA) på produktion af IFNy ved musesplenocytter (SPL) stimuleret med et anti-CD3-antistof. (C) Fase kontrast mikrografier af LNCaP prostatacancerceller behandlet med grundlæggende CCM og XFM-1 / HSA eller konditioneret medium (CM) fra MSC sfærer udarbejdet i CCM og XFM-1 / HSA. LNCaP-celler blev dyrket i RPMI-medium (kontrol). Scale bar er 200 um. (D) Kvantitative ændringer i væksten af LNCaP prostatacancerceller blev bestemt med en kommercielt tilgængelig DNA-baseret celle kvantificering reagens / kit. Stiplet linje angiver seeding tæthed på 5.000 celler pr. Data i alle paneler er vist som middelværdi ± SD, og ​​blev analyseret ved t-test (*** p <0,001). Nogle data i alle paneler blev indhentet fra de originale artikler med tilladelse fra udgiveren ^14. Klik her for at se en større version af dette tal.

belastning / 55126 / 55126fig6.jpg "/>
Figur 6: Effektiv overførsel af intakte MSC sfæroider, udarbejdet i henhold til XF betingelser, ved hjælp af en 20G iv kanyle / kateter-system. (A) Repræsentant fotografi af en 15 ml konisk rør med XFM-1 / HSA MSC kugler forberedt til injektion i HBSS indeholdende 0,2% HSA. (B) Repræsentant fotografi af MSC kugler efter aspiration i en 200 pi pipettespids. (C) Billede af den 20 G nål / kateter samling, der bruges til at administrere intakte MSC sfæroider i mus. (D) Image demonstrerer korrekt positionering af pipettespidsen i adapteren af polyurethan kateter. (E) Billede af MSC sfærer straks efter passage dem gennem kateteret ind i en dyrkningsskål. Ca. 95 kugler ud af 100 blev overført. (F) Effektivitet af kugle levering i bughulen af mus blev bestemt ved at indsamle / lyserende sfærer tilbageholdes ipipette / kateter og måling celleantal, via en kommerciel DNA-baseret celle kvantificering assay i forhold til antallet af celler opnået fra en komplet supplement af lyserede sfærer. Stiplet rød linje angiver en overførsel virkningsgrad på 90%. Dårlig sfære levering (71%) blev observeret med én injektion (pil). (G) Fase kontrast mikrografier af kugler i panelet E (forstørret visning). Scale bar = 200 um. (H) Fase kontrast mikrograf af en XFM-1 / HSA kugle 16 timer efter overførsel til en vævskulturskål. Den fibroblastisk, spindel-formet morfologi MSC'er opretholdes i celler, som vandrede ud af kuglen. Scale bar = 200 um. (I) ELISA assays til anti-inflammatoriske faktorer TSG6 og PGE2 blev udført på CM opsamlet 6 timer efter overførsel af sfærerne i 6-brønds plader indeholdende 2 ml aMEM / 2% FBS. Spheres udarbejdet i XF medium XFM-1 / HSA viste højeste niveau af TSG6 og PGE2 sekretion (røde kasser). Data, udtrykt som gennemsnit± SD, blev analyseret ved t-test (*** p <0,001 sammenlignet med aMEM prøve). Nogle data blev indhentet fra den oprindelige artikel med tilladelse fra udgiveren ^14. (J) Repræsentative grafer, der illustrerer evnen til sfæroider, injiceres i den peritoneale kavitet, for at øge peritoneal PGE2 og IL-10, mens faldende niveau af TNFa hos mus, som ved intravenøs injektion af endotoksin (LPS). Prøver blev opnået ved peritoneal lavage 6 timer efter induktion af inflammation og levering af 80 sfæroider. Data udtrykt som gennemsnit ± SD, blev analyseret ved t-test (* p <0,05, ** p <0,01, sammenlignet med kontrol). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den optimale MSC til brug i nogle forskning og kliniske anvendelser bør være meget aktiveres for at maksimere deres fordel, og fortrinsvis udarbejdet under kemisk definerede XF betingelser for at minimere levering af potentielle antigener fra xenogene mellemstore komponenter såsom FBS. I de protokoller, der er beskrevet her, har vi vist metoder til 1) aktivere MSC'er i 3D kultur ved dannelse af sfæroider, 2) opnå 3D-aktivering af MSC under XF betingelser, 3) vurdere aktivering niveauer af kugleformede MSC i forhold til deres anti- inflammatorisk, immun-modulerende og anti-cancer potentiale, og 4) afgiver aktiverede MSC'er som intakte sfæroider i mus.

MSC'er er multipotente stamceller, som kan isoleres via plast adhærens fra talrige voksent væv, herunder knoglemarv og fedtvæv. MSC er let formeres på vævskultur plast under relativ høj (10-20%) FBS koncentrationer, udtrykker en distinkt sæt af overflademarkører, ogkan differentieres mindste i adipogenisk, osteogene, og chondrogene linier ^{1, 16, 17, 18.} MSC'er er blevet demonstreret at udøve fordelagtige virkninger i forskellige dyremodeller for humane sygdomme, selv om de synes at vedvare kun forbigående efter deres indgivelse in vivo. Effekten af MSC'er er derfor blevet kaldt "hit and run" og er ofte medieret af antiinflammatoriske og immunomodulatoriske parakrine faktorer, såsom PGE2, TSG-6, og indolamin 2,3-dioxygenase (IDO), udskilles af MSC'er ^{2 , 3, 11, 19, 20, 21.} Men for at fremstille disse faktorer, MSC'er kræver aktivering, enten ved signaler fra en beskadiget væv eller fra immun calen af ​​modtageren. Efterfølgende har der været en spirende interesse at udvikle MSC pre-aktivering eller priming protokoller inden leveringen af cellerne i dyr eller patienter ^22. Desuden har tilstedeværelsen af ​​antigene FBS komponenter i standard MSC præparater rejst bekymringer. Derfor er der foretaget undersøgelser for at bestemme optimale kemisk definerede XF betingelser for MSC kulturer. I vores seneste arbejde, først viste vi, at MSC'er kan aktiveres i 3D ved dannelse af sfæroider, og derefter opdaget, at celleaktivering også kan opnås under specifikke XF betingelser ^{8, 12, 13, 14.}

3D celle kultur teknikker er blevet anvendt i årtier med det mål at levere ægte fysiologiske forhold i celle-baserede forskning. Kulturer i 2D se bort fra 3D karakter af væv og derfor ikke altid rekapitulerecelle-til-celle og celle-til-matrix-interaktioner er vigtige i cellesignalering. Mange 3D dyrkningsteknikker anvender roterende fartøjer, spinnerkolber eller forskellige ikke-adhærente overflader, men den største ulempe i mange af disse metoder er heterogeniteten for den genererede sfæroid størrelse og / eller krav om specifik dyrt udstyr. Forskning har også været udført ved anvendelse af hængende dråbe kulturer, der i det væsentlige fremmer MSC'er til spontant aggregat i en enkelt sfæroid ^{4, 5, 6, 7, 8, 9, 23.} Især hængende dråbe kulturer støtter samling af relativt ensartede mikro-væv / aggregater, med den ekstra fordel af at være i stand til nemt at manipulere størrelse af cellen aggregat ved at justere celle koncentration og / eller fald volumen. Endvidere beherskelse af den hængende drop kultur teknik kræver ikke omfattende træning. Dråber af 25-40 pi kan let fremstilles med MSC'er ved høj cellekoncentrationer, typisk 500-1000 celler pr pi. Dråber mindre end 20 pi tendens til at fordampe hurtigt, og de større end 45 pi ofte smøre på tværs af låget under inversion. Men når spejlvende et låg, der indeholder små dråber af enhver størrelse, hastighed og retningsbestemmelse er kritiske parametre at overveje for at opretholde overfladespænding og passende form af drop / klumpformet. Uafbrudt kultur og korrekt luftstrøm i inkubatoren er også vigtig for at sikre MSC'er aggregat til en enkelt kugle i hver dråbe.

En ulempe ved denne teknik er, at plader indeholdende hængende dråber ikke bør stables i inkubatoren eller flyttes under sfære samling, gør opskalering til patientgrupper terapier vanskelige. Desuden ændrer medium i hængende drop kulturer er ekstremt udfordrende, således langvarige kulturer bør være avoided. Derudover kan den lave medier til celle-forhold i hængende dråber forårsage næringsstof sult og ophobning af affald i sidste ende fører til tab af vigtige cellulære funktioner og / eller celledød.

Men med ordentlig hængende dråbe teknik, har vi vist, at MSC'er i sfæroider blive meget aktive eller primet, ved, at cellerne bliver fabrikker stærke anti-inflammatoriske molekyler PGE2 og TSG6 samt anti-cancer-molekyler IL-24 og STI. Vi har vist, at MSC sfæroider faktisk antiinflammatoriske og immunmodulerende, og har anti-cancer egenskaber bedre deres 2D monolag modparter i talrige funktionelle assays under anvendelse af dyrkede makrofager, splenocytter og prostatacancerceller ^{8, 12, 13, 14.} Vi har desuden vist, at MSC sfæroider kan udøve potente antiinflammatoriske virkninger, når de indgivesi bughulen af mus med peritonitis ^8. Specifikt viste vi, at store sfæroider på ca. 400-500 um i diameter (25.000-30.000 MSC'er hver) kan leveres effektivt i et lille volumen af ​​HBSS under anvendelse af en 20G nål / katetersamling og en standard pipette. Med denne teknik, forkert placering af kateter, hvilket resulterer i stor modstand mod fluidstrømning, kan let bestemmes inden klumpformet overdragelse ved først at injicere et lille volumen HBSS / HSA som beskrevet i protokollerne. Sfæroiderne i en korrekt placeret kateter kan strømme frit, forudsat at HBSS suppleres med HSA for at minimere sfære vedhæftning til plastslanger, og kan let visualiseres. Desuden denne teknik forhindrer forskydningsspænding på celler, som kan forekomme ved anvendelse af en standard nål / injektionssprøjte, og undgår behovet for et kirurgisk snit, som bærer en højere risiko for infektion og er mere teknisk udfordrende. En væsentlig ulempe er that stort antal sfæroider kan kun injiceres i rummelige kropshulrum, såsom bughulen, som modstanden mod kugle overførsel gennem katetret er høj i indsnævrede områder.

Vi har også for nylig vist, at det samme niveau af MSC aktivering i sfæroider kan opnås ved anvendelse af en specifik kommercielt tilgængeligt XF medium, her benævnt XFM-1, så længe den blev suppleret med HSA opnået fra humant blod eller fremstilles ved rekombinante teknikker ^14. Det er vigtigt at bemærke her, at MSC sfæroider ikke producerer høje niveauer af PGE2 og TSG6 i alle typer af XF medier ^14, sandsynligvis fordi de fleste XF medier for MSC'er oprindeligt blev formuleret til optimal ekspansion af cellerne i 2D. Det er også vigtigt at bemærke, at forskellige typer af HSA variere i deres styrke ^14. Hertil kommer, at absolutte niveau PGE2 påvist i CM af aktiverede sfæroider kan variere lidtly som ELISA ansat til PGE2 er faktisk en konkurrence assay. Det er således afgørende at medtage passende kontrol i alle PGE2 ELISA og undgå direkte sammenligning af data mellem prøver analyseret på forskellige tidspunkter eller i forskellige plader. Desuden skal MSC'er vaskes grundigt i XF medium før fremstilling hængende dråber med henblik på at fjerne resterende CCM og dermed begrænse overførsel af FBS komponenter. De her beskrevne protokoller kan nemt vedtaget for at vurdere andre medier formuleringer om sfære dannelse og terapeutisk genekspression.

Det er klart, er mange celle-signalering hændelser, der ikke normalt forekommer i 2D MSC'er sat i bevægelse, når MSC'er dyrkes i 3D. Celle-til-celle og celle-til-matrix-interaktioner, der medieres af cadheriner og integriner guide kugleformet dannelse og komprimering ^{24, 25, 26} og sandsynligvis kritisk for sfæroide terapi. Efterhånden som cellerne aggregat og coIRKNING ind sfæroider, forskellige stress-signaler, herunder mindre apoptose, støtte i processen med MSC-aktivering, som medfører produktion af talrige potentielt terapeutiske faktorer ^{4, 5.} Vi har tidligere viste den kritiske rolle autokrine IL-1-signalering i MSC-aktivering og produktion af PGE2 og TSG6 ^12. Mens meget er stadig ukendt om de forskellige signalveje, at støtte i MSC-aktivering, den hængende dråbe kultur platform giver en praktisk måde at studere dette fænomen og forbedre MSC-baserede terapier. Samlet set har vi beskrevet, i protokollerne her, midlerne til aktivering eller priming MSC i 3D kulturer, under kemisk definerede XF betingelser at producere anti-inflammatoriske, immunmodulerende og anti-cancer faktorer. Vi har også beskrevet, hvordan disse intakte MSC sfæroider kan leveres in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling