Produksjon og Administrasjon av Therapeutic Mesenchymale Stem / stromal Cell (MSC) Spheroids Grunnet i 3-D kulturer Under Xeno-frie betingelser

Abstract

Mesenchymale stamceller / stromale celler (MSC) holder store løftet i bioteknologi og regenerativ medisin. MSC kan isoleres fra flere voksent vev via deres sterke tilslutning til vevskultur plast og deretter ytterligere ekspandert in vitro, som oftest ved hjelp av bovint serum (FBS) føtalt. Siden FBS kan føre til MSC til å bli immunogen, dens tilstedeværelse i MSC kulturer begrenser både kliniske og eksperimentelle anvendelser av cellene. Derfor studier som anvender kjemisk definerte Xeno-free (XF) media for MSC kulturer er svært verdifull. Mange fordelaktige effekter av MSC har blitt tilskrevet deres evne til å regulere inflammasjon og immunitet, hovedsakelig gjennom sekresjon av immunmodulerende faktorer, slik som tumor-nekrose faktor-stimulert gen 6 (TSG6) og prostaglandin E2 (PGE2). Men MSC krever aktivering for å produsere disse faktorene og da effekten av MSC er ofte forbigående, har stor interesse dukket opp for å oppdage måter å pre-aktivere cellene PRIOr deres anvendelse, og dermed eliminere forsinkelsen for aktivering in vivo. Her presenterer vi protokoller for å effektivt aktivere eller prime MSC i tre-dimensjonale (3D) kulturer etter kjemisk definerte XF forhold og å administrere disse forhåndsaktivert MSC in vivo. Spesielt vi først beskrive metoder for å generere sfærisk MSC mikro vev eller 'kuler' i hengende dråper bruker XF medium og vise hvordan kulene og kondisjonert medium (CM) kan høstes for ulike bruksområder. Deretter beskriver vi genekspresjon skjermer og in vitro funksjonelle analyser for raskt å vurdere graden av MSC aktivering i sfæroider, med vekt på anti-inflammatorisk og anti-kreft potensial av cellene. For det tredje, beskriver vi en ny fremgangsmåte for å injisere intakte MSC sfæroider i musen bukhulen for in vivo-effektivitet testing. Totalt sett protokollene her vinne store utfordringer med å skaffe pre-aktivert MSC henhold kjemisk definert XF conforhold og tilveiebringe et fleksibelt system for å administrere MSC kuler for terapi.

Introduction

Mesenchymale stilk / stromale celler (MSC) har vist stort potensial for ulike regenerativ medisin tilnærminger. MSC ble opprinnelig isolert som en stromal komponent av benmarg, men har siden blitt erholdt fra mange andre voksne vev, blant annet fettvev ^{1, 2, 3.} Interessant, omfatter hovedisoleringsmetoden den bemerkelsesverdige egenskap av MSC for å overholde fast på vevskultur plast i nærvær av føtalt bovint serum (FBS). Mens dette tradisjonelle isolasjon teknikken tillater enkel og rask utvidelse av MSC i to-dimensjonale (2D) kultur, er det også veldig kunstig og ser bort fra betydningen av de innfødte tredimensjonale (3D) miljø fører til potensielle tap av viktig cellular egenskaper ^{4, 5 6.} Derfor studiet av MSC i 3D kulturer, noe somer mer fysiologisk enn tradisjonelle 2D kulturer, har dukket opp i søk etter "tapte / forminskede" MSC egenskaper. Videre har stor interesse steget å identifisere Xeno-free (XF) kjemisk definerte vilkår for MSC kultur og aktivisering, og dermed gjøre cellene mer mottagelig for kliniske applikasjoner.

Mange studier har blitt publisert som viser 3D-kulturen i MSC både i biomaterialer og som sfæriske aggregater eller kuler. MSC i biomaterialer ble opprinnelig utviklet for tissue engineering tilnærminger for å erstatte skadede vev med celle-seeded stillasene, mens sfæroide kulturer av MSC ble sett på som en måte å forstå MSC oppførsel in vivo etter administrering av cellene for behandling i prekliniske eller kliniske studier ^{4, 5, 7.} Interessant, MSC skjema kuler spontant når tilslutning til vev kultur plast er ikke tillatt^{8, 9, 10.} Tradisjonelt ble celle aggregering tilrettelagt av spinneren kolbe metoder eller flytende overlay teknikker, metoder som brukes i utgangspunktet i kreft biologi i arbeidet med å prøve å etterligne svulsten mikromiljøet. I den senere tid har flere metoder til overflaten som viser celle aggregering i kulturskåler på forhånd belagt med visse kjemikalier for å forhindre celle-til-plast adhesjon ^{4, 5, 6.} En av de enkleste og mest økonomiske metoder for å generere MSC kuler er til kultur dem i hengende dråper, en teknikk som ofte ble brukt til å fremstille embryoid legemer fra embryonale stamceller. Med hengende dråpe kultur teknikk, er celle tilslutning til vevskultur plast forhindres ved å suspendere cellene i et dråpe medium på undersiden av en vevskulturskål lokk og tillater tyngdekraften for å lette celle aggregasjon i toppen av fallet. Den sfæroide størrelse kan lett manipuleres ved å endre cellekonsentrasjon eller rulle volum, noe som gjør hengende dråpe kulturer særlig enkle å kontrollere.

Tidlige studier på 3D-kultur av MSC viste radikale forskjeller i egenskapene til de celler i 3D i forhold til deres motparter 2D ^{6, 8, 9.} På samme tid, rapporter vist at de gunstige virkninger av MSC in vivo avhengig av deres evne til å bli aktivert av mikro-miljø signaler og, som reaksjon, for å fremstille anti-inflammatoriske og immunmodulerende faktorer ^11. Det er interessant at mange av disse faktorer slik som prostaglandin E2 (PGE2), tumor nekrose faktor-stimulert gen 6 (TSG6), og hepatocytt vekstfaktor (HGF) ble produsert i mye større mengder av MSC kuler enn tradisjonelle 2D MSCer banet vei for ideen omved bruk av 3D-kulturer for å aktivere cellene ^{8, 12, 13.} Videre genaktivering i 3D-kulturer først å rekapitulere mekanismer, i det minste delvis, av celleaktivering etter injeksjon inn i mus ^12. Ved å aktivere MSC før deres anvendelse i eksperimenter, kan virkningene av cellene være langvarig og mer fremtredende som de tradisjonelle MSC effekt in vivo, er ofte forsinket og forbigående, og kan beskrives som "hit og kjør". I løpet av de siste årene, har viktige funksjonelle studier ved bruk av MSC sfæroider vist at de kan undertrykke inflammatoriske responser og modulere immunitet in vivo ved å påvirke effektor celler slik som makrofager, dendrittiske celler, nøytrofiler og T-celler som gjør sfæroider en attraktiv form av primede MSCer ^{2 , 3.} I tillegg er produksjonen av anti-kreft-molekyler, slik som interleukin-24 (IL-24) og tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) er økt i 3D-kulturer av MSC i forhold til monolaget MSCer, et fenomen som kan utnyttes for målrettet cancerterapi ^{8, 10, 14.}

Som den tradisjonelle MSC kulturen kreves ikke bare bruken av vevskultur plast, men også FBS, til et annet hinder gjøre MSC sfæroider mer mottagelig for klinisk bruk måtte overvinnes. For å takle dette hinderet, vi nylig viste dannelsen av MSC kuler under bestemte kjemisk definerte XF vilkår og etablerte at de resulterende MSC kuler ble aktivert for å produsere de samme anti-inflammatorisk og anti-kreft molekyler som kulene generert i forhold med FBS ^14. Her er disse funnene presentert i flere detaljerte protokoller som viser generasjon pre-aktivert MSC i 3D kulturer som bruker XFmedia. I tillegg er protokoller presentert som beskriver effektive måter å vurdere aktiveringsnivåer i MSC i forhold til deres anti-inflammatoriske, immunmodulerende og anti-kreft effekt, sammen med en praktisk metode for å levere de intakte sfæroidene i mus.

Protocol

1. MSC Isolering og Utvidelse

1. Skaff tidlige passerings MSC fra Senter for utarbeidelse og distribusjon av voksne stamceller ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~number=plural ) ¹⁵ som frosne ampuller. Alternativt isolere MSC fra benmarg aspirates etter en rutine protokoll ¹⁴ og lagre så frosne ampuller.
2. Fremstille fullstendig dyrkningsmedium (CCM), som er minimalt essensielt medium alfa (aMEM) supplert med 15-20% premie velge FBS, 2 mM L-glutamin, og 1x penicillin-streptomycin. Steril mediet ved filtrering.
3. Plasser 30 ml CCM inn i en 150 mm cellekulturskål og inkuber formen i 30 minutter ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende _5% CO2.
4. Inkuber den frosne ampullen som inneholdt ca. 10 ^6-MSC for 2 min i et 37 ° C vannbad.
5. Overfør innholdet i hetteglasset til kulturskålen ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette og vaske hetteglasset flere ganger med 1-2 ml CCM fra antenne for å fange opp gjenværende celler. Sett fatet over natten i en passende kuvøse.
6. vaskes omhyggelig kulturen to ganger med romtemperatur fosfatbufret saltvann (PBS) og løsne MSC med 3 ml forvarmet 0,25% trypsin / etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) løsning. Detachment tar vanligvis ca 3-4 min i kuvøse.
7. Nøytralisere trypsin i fatet med 6 ml CCM forvarmet til 37 ° C og overføre cellesuspensjonen i et 50 ml konisk rør. Kombiner med vasker av PBS for å maksimere celle yield.
8. Sentrifuger cellene (450 xg) i 10 minutter ved romtemperatur og aspirer supernatanten.
9. Re-suspendere cellene i et lite volum av CCM, og telle levedyktige celler ved hjelp av et hemocytometer og trypanblått.
10. Seed et passende antall på 150 mm skåler på 100 celler / ^cm2
11. Høste celler som ovenfor med trypsin / EDTA og kombinere alle cellene i en enkelt konisk rør med det passende medium. Sentrifuger på nytt og gjensuspendere cellene i et lite volum av det samme medium for celletelling. Bruke standard CCM (inneholdende FBS) eller forskjellige kommersielt tilgjengelige XF medieformuleringer, her referert til som XF medium-1 (XFM-1) og XF medium-2 (XFM-2), begge med og uten humant serumalbumin (HSA, 13 mg / ml) tilskudd.

2. Utarbeidelse av Aktivert MSC Spheroids i 3-D hengende dråpe kulturer etter XF betingelser

1. For å generere kuler på ca 25 000 celler, fortynne de høstes MSC i CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2, eller XFM-2 + HSA (13 mg / ml) ved 714 celler / mikroliter.
2. Pipetter 35 mL / dråper av cellene bort påundersiden av en 150 mm kulturskål invertert lokk. Flere dråper lett kan pipetteres ved hjelp av en flerkanals pipette.
   MERK: Hvis større eller mindre kuler er ønskelig, endre celle konsentrasjon eller rulle volum (25-45 mL) på riktig måte.
3. Overfør 20 ml romtemperatur PBS inn i bunnen av fatet, og i en kontinuerlig og jevn bevegelse snu lokket, som inneholder dråpene, slik at slipp-toppunktene vender nedover. Plassere lokket forsiktig på undersiden av kulturskålen.
4. Overfør fatet i inkubatoren i 3 dager uten å forstyrre det å tillate passende sfære montering.
5. Etter 72 timer, begynner spheroid innhøstingen ved å fjerne lokket forsiktig og snu den slik at dråpene, igjen, vende opp.
6. Vinkel lokket til ca. 10-20 ° og trykk på de dråper, som inneholder sfæroidene, til platen kanten ved hjelp av en celle løfteren.
7. Overfør kulene og medium i en 15 ml konisk rør med en 1000 mL rørTTE. Bruk romtemperatur PBS og pipetten med den samme spiss for å vaske platene og sørge for maksimal utvinning av sfæroider.
8. For real-time PCR-analyser (protokoll 3), sentrifuger kulen suspensjonen ved 450 xg i 5 min ved romtemperatur og aspirer supernatanten. Vask kulene med PBS og gjenta både sentrifugering og aspirasjonstrinnene. For levering til dyr (protokoll 8), la kuler å bosette seg i bunnen av røret (~ 3-4 min) uten sentrifugering.

3. Real-time PCR av anti-inflammatorisk og anti-kreft Markers

1. Bruk RNA-ekstraksjon settet med homogenisator søyler og RNase-fri DNase sett for å isolere DNA-fri total RNA fra monolags MSC (protokoll 1) og MSC sfæroider (protokoll 2) som ble vasket med PBS og sentrifugert.
2. Lyse minst 100.000 monolags MSC og 20 kuler fra hver tilstand i atskilte 15 ml koniske rør med RLT buffer inneholdende β-merkaptoetanol (1: 100).
3. transfer de grundig blandede lysatene i 1,5 ml RNase-frie rør og plasser i en fryser (-80 ° C) i minst 3 timer for å hjelpe til spheroid lyse.
4. Tine cellelysatene på is, vortex kort, og følg produsentens instruksjoner for RNA isolering med en kommersielt tilgjengelig pattedyr total RNA isolering kit.
5. Kvantifisere og vurdere kvaliteten av den isolerte RNA ved hjelp av et spektrofotometer.
6. Bruk High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit eller tilsvarende i henhold til produsentens instruksjoner for å generere cDNA for real-time PCR.
7. Plasser cDNA prøvene, kommersielt designet real-time PCR primere / prober (genekspresjon Analyser), og PCR Master Mix på is. Bruke primere / prober for GAPDH (kontroll), PTGS2 (COX-2, anti-inflammatorisk), TNFAIP6 (TSG6, anti-inflammatorisk), TRAIL (anti-kreft), og IL-24 (anti-kreft).
8. Forbered real-time PCR reaksjoner i henhold til produsentens instruksjoner for genuttrykk Analyser og Fast UniveRsaI Master Mix.
9. Følg retningslinjene for real-time PCR instrument for generering eksperiment dokumenter og utføre kjøringen.
10. Analysere data ved hjelp av ΔΔC _T-metoden ved å beregne de relative endringer (relativ mengde, RQ) i genuttrykk bruker GAPDH som endogene kontroll og monolags MSC som en baseline ^{8, 14.}

4. Innsamling av CM for analyser av immunmodulerende og anti-kreft Potential

1. Høste kuler og CM som beskrevet ovenfor, i en 15 ml konisk rør, ved hjelp av en celle løfter og en pipette, men ikke vaske fatet lokkene med PBS som dette vil utvanne CM.
2. Sentrifuger ved 450 xg i 5 minutter ved romtemperatur, forsiktig samle den cellefrie supernatant med en pipette og overføres supernatanten til 1,5 ml rør.
3. Sentrifuger ved 10000 x g i 5-10 minutter ved romtemperatur, forsiktig samle clarified CM med en pipette, og overføre CM inn i nye 1,5 ml rør for lagring i en fryser (-80 ° C). Forbered prøver av CM før frysing når du bruker den for flere analyser.
   MERK: Før gjennomføring nedstrøms analyser, PGE2 konsentrasjon, en god indikator på anti-inflammatorisk potensialet av CM, kan bestemmes ved hjelp av et kommersielt ELISA-sett i henhold til produsentens instruksjoner. TSG6 konsentrasjon kan bestemmes ved hjelp av en protokoll som er publisert ^14.

5. Macrophage analyse for å vurdere Anti-inflammatorisk potensialet i MSC-CM

1. Forbered makrofag medium, som består av Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) inneholdende L-alanyl-L-glutamin og supplert med 10% FBS og topp velge 1x penicillin-streptomycin. Filter-sterilisere mediet.
2. Oppnå en frossen ampulle på ca. 10 ⁶ J774 musemakrofager og inkuber i hetteglasset i 2 minutter i et 37 ° C vannbad.
3. Aspirer supernatanten, suspenmakrofagene i 1 ml makrofag medium, og overføre makrofager inn i en 150 mm petriskål inneholdende 30 ml av makrofag medium.
4. Skift medium hver 2. dag og inkuberes cellene i inkubatoren inntil omtrent 70-80% sammenflytende.
   MERK: Makrofagene ikke holder seg tett til petriskål, og dermed forsiktighet bør utvises for ikke å miste celler med middels endring.
5. Høste makrofager ved sprøyting av makrofagen medium på cellene med en pipette. Overfør cellene i et 50 ml konisk rør og sentrifuger i 5 minutter ved 200-300 x g og romtemperatur.
6. Aspirer supernatanten og suspendere cellene i et lite volum av makrofag-medium for celletelling med et hemocytometer. Juster konsentrasjon til 200.000 celler / ml med makrofag megdium.
7. Slik starter du satt opp for makrofag-analysen, tilsett 480 mL av makrofag medium i brønner på en 12-brønns plate.
8. Tilsett 20 mL av makrofag medium til ikke-stimulerte kontrollbrønner og 20 ul av ikke-betinget eller MSC-kondisjonert medium, fremstilt ovenfor, i eksperimentelle brønner. Bland medium i brønnene ved å trykke på platen.
9. Overfør 500 ul av makrofag cellesuspensjon til de ikke-stimulerte makrofagen kontrollbrønnene.
10. Stimulerer de gjenværende makrofager med tilsetning av 1: 500 til 1: 1000 på 0,1 mg / ml lipopolysakkarid (LPS) og inkuber 5-10 minutter ved romtemperatur.
11. Overfør 500 mL av de stimulerte makrofager i brønnene med ikke-betinget eller MSC-kondisjonert medium. Bland brønnene ved stadig rocking platen flere ganger.
12. Overføre platen til en inkubator i 16-18 timer.
13. Høste makrofag-kondisjonert medium og sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
14. Overføresupernatanten til nye rør og assay for tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α) og interleukin-10 (IL-10) innhold av kommersielle ELISA-sett etter produsentens instruksjoner.

6. splenocytt analyse for å vurdere Immunmoduler potensialet i spheroid-CM

1. Fremstille komplette splenocytt medium, som består av Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert FBS, 1 x penicillin-streptomycin, og 2-merkaptoetanol. Filter-sterilisere mediet.
2. Harvests milten fra BALB / c mus avlivet-manns gjennom et snitt forberedt på venstre side av magen over milten, omtrent midtveis mellom for- og bakben ^14. Overfør milten til en 70 mikrometer celle sil for å isolere de splenocytter ^14.
3. Isolere splenocytter / lymfocytter ved å skyve milten gjennom 70 mikrometer sil i en steril petriskål using myk gummi / plast enden av et stempel fra en 2-3 ml sprøyte ^14. Bruk en sliping sirkulær bevegelse for å distansere milten.
4. Vask cellefilter flere ganger med kald PBS og overføre celler fra petriskålen til et 50 ml konisk rør. Fylle røret med kald PBS og sentrifuge (500 xg) ved 4 ° C i 10 min.
5. Aspirer supernatanten og fjerne cellene fra erytrocyttene etter inkubering med 5-10 ml røde blodcellelyseløsning (per milt) i 5-10 min.
6. Stopp lysis ved å tilsette kald PBS til røret og sentrifuger i 5-10 minutter ved 500 x g og ved 4 ° C.
7. Suspendere isolerte celler i fullstendig splenocytt medium, filtreres gjennom en 40 mikrometer sil, og telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Legg splenocytt medium til cellesuspensjonen for å oppnå en endelig cellekonsentrasjon på 10 ⁶ celler / ml
   MERK: Denne teknikken gir vanligvis ca 3 x 10 ⁷ splenocytes per mus milt.
MERK: Mengden av splenocytes kreves avhenger av antall eksperimentelle forhold som bestemmes av forskeren (se trinn 6.9). For hver eksperimentell prøve / brønn, er 10 ⁶ splenocytter nødvendig.
8. Overfør 10 ⁶ splenocytes (stimulert eller ikke-stimulert) i brønner på en 12-brønns plate og legge til ikke-condition (kontroller) eller MSC-CM i brønner på endelig fortynning på 1: 10-1: 20.
9. Høste splenocytt cm etter 24 timer og sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
10. Overfør supernatanten til nye rør og analyse for interferon gamma (IFN-γ) innhold av kommersiell ELISA kit følge produsentens instruksjoner.

7. prostatakreft analyse for å vurdere Anti-kreft potensialet i spheroid-CM

1. Fremstille fullstendig RPMI-vekstmedium som er RPMI-1640 medium supplert med 10% FBS, 1x penicillin-streptomycin.
2. Få tak i en frossen hetteglass med LNCaP prostatakreftceller og inkuber hetteglasset i 2 min i en 37 ° C vannbad.
3. Overfør innholdet i hetteglasset til en kulturskål inneholdende 30 ml RPMI komplett vekstmedium ved hjelp av en motorisert pipette og en 5 ml serologisk pipette. Vask hetteglass flere ganger med mediet fra fatet og sett formen inn i kuvøse.
4. Like før cellene når konfluens, vaskes kulturen to ganger med PBS romtemperatur og ta av LNCaP-celler sammen med 3 ml forvarmet 0,25% trypsin / EDTA-løsning.
5. Nøytralisere trypsin i fatet med komplett RPMI vekst medium og overføre cellene sammen med vasker inn i en 50 ml konisk tube.
6. Sentrifuger cellene ved 450 xg i 10 min ved romtemperatur og aspirer supernatanten.
7. Re-suspendere cellene i små volum av komplett RPMI vekst medium og telle kreftcellene ved hjelp av en hemocytometer.
8. For å utføre en cellevekstanalyse ved anvendelse av en celleformering analysesett, aspirere mediet fra brønnene og overfører platene inn i en fryser (-80 ° C) i minst 3 timer.
   1. Tine platen og lysere cellene i hver brønn ved å tilsette 100 ul av cellelyse reagens inneholdende 180 mM NaCl, 1 mM EDTA, og 0,2 mg / ml RNase A.
   2. For en standard kurve, lyse kjente mengder av LNCaP-celler som beskrevet ovenfor.
   3. Etter 1 time, tilsett 100 ul av 1 x cellelyseringsbuffer som inneholdt 1: 100 fortynning av celleproliferasjonsanalyse reagens og måle fluorescens i hver brønn for å bestemme celle beløp.

8. Intraperitoneal Levering av Intakt Spheroids

1. Forbered sfæroide MSC som beskrevet ovenfor (fremgangsmåte 2) og resuspender than kuler i steril Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) supplementert med 0,2-0,5% HSA for å opprettholde XF-forhold. HSA i løsningen forhindrer sfære adhesjon til plastikk under injeksjon.
2. Overfør 40-120 kuler inn i 15 ml koniske rør og vaske cellene ved tilsetning av 6 ml HBSS / HSA til rørene. Tillat 3-4 minutter for kuler å stige. Forbered en uavhengig konisk rør av kuler for hvert dyr. Også forberede flere rør av kuler for analyser som bestemmer spheroid oppbevaring (se 8.18 nedenfor) og produksjon av terapeutiske faktorer etter overføring (se 8.19 nedenfor) hvis ønskelig.
3. Aspirer supernatanten, overlappe kulene med 100-200 mL sterilt HBSS supplert med 0,2-0,5% HSA, og plassere rørene på is.
4. I korthet bedøve dyrene med 2% isofluran i 100% oksygen inntil forsvinningen av pinch-tå refleks i ca. 2 min i induksjonskammeret.
5. Plasser dyret inne i BSL-2 skap, rygg Aspect ned (ventral siden opp), med den kontinuerlige strøm av 1,5% isofluran / oksygen-blanding via en nesekonus.
6. Rengjør lavere musen magen med en antiseptisk som 70% alkohol.
7. Ta av lokket på 20 G intravenøs (iv) kateter og utfører intraperitoneal injeksjon med kateter stiletto montering. Bruk en hånd å holde musen huden og en annen for å utføre injeksjonen. Finn injeksjonspunktet omtrent i midten av en kunstig linje som forbinder en bøyd kneleddet og genital område med nålespissen peker mot midtlinjen.
   MERK: kateter stiletto enheten har en høyere motstand enn en vanlig nål, derfor må tas for ikke å injisere nålen for dypt ned i magen, noe som kan føre til skade på indre organer. Penetrasjon av huden og deretter muskler / bukhinnen kan bli følt i løpet av kateter.
8. Fjern forsiktig metall stiletto / nålen fra kateter stiletto montering. Check stiletto for blod, urin og avføring og kast den. Blod på nålen indikerer punktering av indre organ (er).
9. Hold plastkateter i en oppreist stilling under injeksjonen for å tillate fluidstrømning.
10. Bekrefte korrekt plassering av plastkateter ved å injisere ca. 100 ul steril HBSS / HSA gjennom kateteret ved hjelp av en pipette med 100-200 pl spiss. Plasser enden av pipettespissen på innsiden av kateteret sprøyteadapteren som danner en tett forsegling. Sakte injisere væske i bukhulen.
    MERK: fluid i en riktig plassert kateter vil strømme fritt inne i bukhulen med bare mindre justeringer av kateteret. Feilaktig plassering av kateteret (subkutan eller intra-intestinal, eller hvis spissen av nålen skadet peritoneale organer som nyrer) vil øke motstanden og redusere strømning. Subkutan plassering vil resultere i en dannelse av en åpenbar "boble" under huden.
11. samle than MSC sfæroider fremstilt i 100-200 ul HBSS / HSA (trinn 8.3), ved hjelp av en 200 ul pipette, og overføre hele volumet av kuler (40-120 kuler) inn i bukhulen gjennom kateteret som beskrevet ovenfor.
12. Vask det rør som inneholdt kuler med 100 ul HBSS / HSA ved hjelp av den samme spiss som ovenfor for å samle eventuelle gjenværende kuler og sprøyte dem inn i det peritoneale hulrom.
13. (Valgfritt) injiseres ytterligere 100 ul HBSS / HSA inn i bukhulen for å vaske kateteret.
14. Plasser kompress dynket i antiseptisk over kateteret og sakte fjerne kateteret fra bukhulen og kast den.
15. Forsiktig massasje av bukhulen med fingrene for å sikre jevn fordeling av kulene.
16. La dyret komme under tett oppfølging og se etter blødning fra injeksjonsstedet.
17. Inspisere kateteret og 15 ml rør for eventuelle gjenværende kuler. Det er vanlig å observere noen kuler ikateter / tube.
    MERK: teknikken beskrevet for MSC sfæroide levering kan tas i bruk for bruk i normale dyr eller i en rekke skademodeller. Denne teknikken har blitt brukt for å injisere kuler i korneal skade mus og endotoksemi modell, så vel som i en zymosan-indusert peritonitis modell ^8.
18. For å kvantifisere antallet av tilbakeholdt kuler (valgfritt), bruk en DNA-basert celle nummer kvantifisering kit / reagens. Hold brukes kateteret over 15 ml rør og kraftig dispensere HBSS / HSA gjennom kateteret for å tvinge eventuelle gjenværende kuler tilbake inn i 15 ml rør.
    1. Sentrifuger 15 ml rør ved 500 x g i 5 min ved romtemperatur og aspirer supernatanten. Overfør røret som inneholder den sfæroide pellet inn i en fryser (-80 ° C) i minst 3 timer.
    2. Tine røret og lysere sfærene ved å tilsette 500 ul av cellelyse reagens inneholdende 180 mM NaCl, 1 mM EDTA, og 0,2 mg / ml RNase A.
    3. For en kontroll, freEze og lyse en kjent mengde av sfæroider (fortrinnsvis tilsvarende til antall sfæroider fremstilt av en enkelt injeksjon) som beskrevet ovenfor.
    4. Etter 1 time, overføre 100 ul av cellelysatet, i duplikat, til en 96-brønners mikroplate, og legge til hver brønn 100 ul av 1 x cellelyseringsbuffer inneholdende en 1:50 fortynning av celleproliferasjon assayreagens fra settet. Etter 10 min måle fluorescens i hver brønn for å bestemme antall sfærer som ikke ble injisert ved å sammenligne den eksperimentelle prøven (e) med kontrollprøven.
19. Vurdere aktiveringsnivå kuler forberedt for injeksjon (valgfritt) ved å måle konsentrasjonen av PGE2 og TSG6 produsert av overførte kuler. Overføring 40-120 kuler gjennom kateteret, som beskrevet ovenfor, inn i en 12-brønn eller 6-brønns plate inneholdende 1 eller 2 ml aMEM supplert med 2% FBS og 1 x penicillin / streptomycin. Plassere platene i inkubator i 6 timer.
    1. Overføre mediet frabrønnene etter 6 timer i 1,5 eller 15 ml rør og sentrifugere rørene ved 450 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Overfør den cellefrie supernatant i nye 1,5 ml rør ved hjelp av en pipette og sentrifuger ved 10 000 xg i 5-10 minutter ved romtemperatur.
    3. Overfør den klarede CM (supernatant) inn nye 1,5 ml rør og assay for PGE2 konsentrasjon (god indikator på anti-inflammatorisk potensialet CM) ved anvendelse av et kommersielt ELISA-sett i henhold til produsentens instruksjoner. TSG6 konsentrasjon kan bestemmes ved hjelp av en protokoll som er publisert ^14.

Representative Results

I dagens arbeid, ble hengende slipp kulturer ansatt for å generere kompakte sfæriske mikro vev eller "kuler" av aktiverte MSC henhold XF forhold. Utprøvings veikart i figur 1 viser at MSC oppfordres til å selv montere inn kulene når suspendert i hengende dråper for 72 timer, hvoretter kuler, eller CM lastet med kule-avledet terapeutiske faktorer, kan samles og potensielt utnyttes i både forskning og kliniske applikasjoner. Det store antall celler som kreves for tjeneste-produksjon kan erverves i løpet av en uke ved utsåing av MSCene ved lav tetthet, typisk 100-200 celler pr ^cm2, og deretter ekspandere cellene i 6-7 dager, inntil omtrent 80% sammenflytende (figur 2 ). Celle vekstkinetikk, bestemmes ved å telle levedyktige celler daglig, indikerte at en sterk ekspansjon fase (dag 3-7) følger en kort forsinkelse fase av 1-2 dager (figur 2C </ Strong>). MSC i passasjen 2 eller 3 gir vanligvis 50-100 millioner celler fra en enkelt ampulle på 1 million cryopreserved-celler når de ble dyrket i CCM.

Etter ekspansjon og høst, er MSC suspendert ved høy cellekonsentrasjon for å generere kuler, typisk 500-1000 celler per mL. Hengende dråpe kulturer fremstilles ved å overføre 25-40 pl dråper av medium inneholdende de MSCene på undersiden av et vev-dyrkningsskål lokk, som deretter vippes og riktig plassert på bunnen av fatet (figur 3). Når suspendert i 35 pl dråper av CCM på 714 celler per mL (dvs. 25,000 celler pr slipp), MSC først montere opp i små aggregater som etter hvert flyter sammen til å generere en enkelt kompakt kule på 72 timer i spissen av rulle (figur 3C). Spheroids også form over 72 timer i flere typer kommersielt tilgjengelige XF medier optimalisert for MSC utvidelse, Her referert til som XFM-1 og XFM-2. Dannelse av enkle kompakte kuler i XFM-1 krever supplering med 13 mg / ml humant serumalbumin (HSA), en konsentrasjon som gjenspeiler den beregnede totale proteininnhold i CCM (figur 3D). Enkelt kompakte kuler ikke lett dannes i grunnleggende XFM-en uten HSA eller proteinfritt aMEM (figur 3D). Under sfære montering MSC fenotype endres radikalt (figur 4), og da i den aktuelle kjemisk definerte XF medium (dvs. XFM-1 + HSA), ekspresjon av en rekke anti-inflammatoriske faktorer er oppregulert inklusive PGE2 og TSG6 (figur 4C). Men produksjon av TSG6 og PGE2 er ikke markert forsterket i MSC dyrkede som kuler i XFM-2 eller XFM-en uten HSA (Figur 4C). Spesielt disse anti-inflammatoriske faktorer, så vel som anti-kreft faktorer TRAIL og IL-24, ble sterkt oppregulert i sfæroide MSC i forhold til monolaget MSC, når than kuler ble dyrket i XFM-1 supplert med enten rekombinant HSA (rHSA) eller klinisk grade HSA (cHSA) fremstilt fra humant blod (Figur 4D).

For å evaluere det terapeutiske potensialet i MSC sfærer utarbeidet i ulike medie formuleringer, er flere praktiske tester utført (figur 5). De immun-modulerende egenskaper av sfæroider blir først bestemt in vitro ved å måle virkningen av sfære CM på nivåer av cytokiner produsert av LPS-stimulerte makrofager og CD3-stimulerte splenocytter / lymfocytter (figur 5). CM fra MSC kuler dyrket i CCM og XFM-1 / HSA markert undertrykt produksjon av makrofager, TNFa og splenocytt IFNy, mens på samme tid forbedrede nivåer av anti-inflammatoriske cytokin IL-10 (figur 5A og 5B). Den anti-kreft egenskaper av kuler blir evaluert ved å måle effekten av sfære CM on vekst og morfologi av LNCaP prostata kreft celler. XF medium XFM-1 / HSA effektivt redusert LNCaP spredning lik FBS holdig CCM (figur 5C og 5D).

Viktigere, kan intakte MSC bobler injiseres i bukhulen til mus for å teste den antiinflammatoriske aktivitet til celler in vivo (figur 6). For disse forsøk, er kuler fremstilt for injeksjon i HBSS inneholdende en lav konsentrasjon av HSA, som reduserer deres adhesjon til plastrøret og samtidig bevare en XF tilstand. Deretter kan kulene være lett injiseres etter overføring fra oppsamlingsrøret (figur 6A), ved hjelp av en pipette (figur 6B), gjennom en nål / katetersammenstillingen (figur 6C og 6D) hensiktsmessig posisjonert for en standard intraperitoneal injeksjon. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan MSC kuler være regelmessigoverføres ved en virkningsgrad som er større enn 90% (figur 6E og 6F) uten å forstyrre deres integritet (figur 6G og 6H). Feilaktig plassering av kateterspissen i det peritoneale hulrom fører til dårlig sfære levering og høy retensjon (figur 6F). Viktigere, kan nivået av sfære retensjon i pipetten / kateteret bestemmes kvalitativt ved visuell inspeksjon, eller kvantitativt ved å samle / lysering av de tilbakeholdte kuler og måling av celle nummer med et kommersielt tilgjengelig DNA-basert celle kvantifisering reagens / kit (figur 6F). Post-injeksjon sfære oppbevaring analyse bidrar til å skape inkludering / eksklusjonskriterier under eksperimentering. Spesielt, er evnen for CCM og XFM-1 / HSA-kuler for å skille ut høye nivåer av TSG6 og PGE2 opprettholdes i minst 6 timer etter overføring av kulene fra hengende dråpe kulturer (figur 6i). I likhet med sine in vitro effects, XFM-1 / HSA kuler injisert i bukhulen til mus, umiddelbart etter induksjon av systemisk inflammasjon ved intravenøs administrering av LPS, forsterket PGE2 og IL-10 nivåer i peritoneum samtidig redusere pro-inflammatorisk TNFa (fig 6J).

Figur 1: Skjematisk fremstilling av plattformen er utviklet for å utnytte secretome av MSC primede som sfæriske mikro vev under XF-forhold. Etter ekspansjon som monolagskulturer (1), blir MSC suspendert i hengende dråper fra lokket av en dyrkningsskål (2) ved høy cellekonsentrasjon for å aktivere / prime cellene. Etter 72 timer, er både (3) kondisjonert medium (CM) og (4) intakte kuler kan høstes fra dråpene og benyttet i forskjellige nedstrøms applikasjoner. CM er rik på immun-modulerende faktorer, så vel som andre terapeutiske kompentene. De kompakte kuler som dannes i hengende dråper kan enkelt overføres ved hjelp av en pipette (5) og effektivt administrert in vivo gjennom et kateter (6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Vekst egenskapene av benmarg-avledede MSC i monolagskulturer. MSC i passasjen 2 ble sådd ut ved lav tetthet (100 celler pr ^cm2) i 15 cm skåler (15.000 celler pr tallerken) og dyrket i 7 dager i CCM. Mediet ble forandret på dag 3, og deretter igjen på dag 5 eller 6 (24-48 timer før høsting). Representative fasekontrastmikrografer av MSC 3 dager (A) og 7 dager (B) etter plating av cellene. Scale bar = 200 mikrometer. (C) Vekstkinetikken til MSC-innhentet fra 3 donorer ble bestemt ved å telle antall levedyktige heftende celler daglig fra dag 2 til dag 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Utarbeidelse av hengende slipp kulturer for priming MSC kuler i XF medium. (A) Foto viser teknikken for hurtig lag hengende dråper på undersiden av en vevskulturskål lokk. (B) Foto illustrerer hengende dråper etter inversjon og plassering av lokket på fatet basen. (C) tidsavhengige endringer i aggregering av 25.000 MSC i en hengende dråpe som visualisert ved hjelp av fasekontrastmikroskopi. Målet ble fokusert på toppen av fallet. Scale bar = 500 mikrometer. (D) Images av MSC kuler dannet etter 3 dager i hengende dråpe kulturer ved hjelp av ulike medie formuleringer inkludert aMEM med og uten FBS (dvs. CCM), XFM-1 med og uten HSA, og XFM-2 med og uten HSA. Scale bar = 200 mikrometer. Dataene i panelet D ble hentet fra den opprinnelige artikkelen med tillatelse fra utgiveren ^14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Evaluering av MSC aktivering i 3-D XF kulturer. (A) Spheres / CM blir høstet etter 72 timer ved å invertere / vippe fatet lokket og tvinger dråpene til kanten ved hjelp av en celle løfteren. Spheres satt sammen av 25.000 celler lett kan visualiseres under samlingen. (B) Fotografi på rundt NOKinstans 500 kuler samlet inn fra lokk av en rekke vev kultur plater. Kuler hurtig ned til bunnen av røret uten sentrifugering. (C) Nivå av PGE2 utskilt fra MSC kuler etter 72 timer ble målt ved ELISA. Sanntids RT-PCR ble anvendt for å måle TSG6 nivåer. Både TSG6 og PGE2 er verdifulle markører for screening MSC aktivering i kulene. XF medium XFM-1 + HSA viste høyt nivå av PGE2 og TSG6 produksjon (røde bokser). Data er vist som gjennomsnitt ± SD og ble analysert ved t-test (*** p <0,001, sammenlignet med aMEM prøve). (D) PGE2 ELISA og sanntids RT-PCR-analyser for kuler fremstilt i CCM og XFM-1 supplert spesifikt med 13 mg / ml rekombinant HSA (rHSA) eller klinisk kvalitet HSA (cHSA) fremstilt fra humant venøst blod. Brett endringer ble bestemt fra heftmonolags MSC (RQ = 1). Data er vist som gjennomsnitt ± SD og ble analysert ved t-test (** p <0,01, *** p <0,001, sammenlignetmonolag MSC). Noen data i panelene C og D ble hentet fra den opprinnelige artikkelen med tillatelse fra utgiveren ^14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: In vitro funksjonelle analyser for å vurdere anti-inflammatorisk og anti-kreft egenskaper av MSC-CM samlet inn fra hengende slipp kulturer. (A) Representative resultater fra ELISA-er som viser virkningene av sfære CM (CCM og XFM-1 / HSA) på produksjon av TNFa og IL-10 ved hjelp av LPS-stimulerte musemakrofager (MQ). (B) Representative resultater fra ELISA som viser virkningene av sfære CM (CCM og XFM-1 / HSA) på produksjon av IFNy av musesplenocyter (SPL) stimulert med anti-CD3-antistoff. (C) Fase kontrastmikrografer av LNCaP prostata kreft celler behandlet med grunnleggende CCM og XFM-1 / HSA eller kondisjonert medium (CM) fra MSC kuler utarbeidet i CCM og XFM-1 / HSA. LNCaP-celler ble dyrket i RPMI-medium (kontroll). Scale bar er 200 mikrometer. (D) Kvantitative endringer i veksten av LNCaP prostata kreftceller ble bestemt med et kommersielt tilgjengelig DNA-basert celle kvantifisering reagens / kit. Prikket linje angir seeding tetthet på 5000 celler per brønn. Dataene i alle panelene er vist som gjennomsnitt ± SD, og ​​ble analysert ved t-test (*** p <0,001). Noen data i alle paneler ble hentet fra de originale artikler med tillatelse fra utgiveren ^14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

belastning / 55126 / 55126fig6.jpg "/>
Figur 6: Effektiv overføring av intakte MSC kuler, utarbeidet i henhold XF forhold, ved hjelp av et 20G iv nål / kateter system. (A) Representant fotografi av en 15 ml konisk rør med XFM-1 / HSA MSC kuler forberedt for injeksjon i HBSS som inneholder 0,2% HSA. (B) Representant fotografi av MSC kuler etter aspirasjon til en 200 mL pipette tips. (C) Bilde av den 20 G nål / kateterenhet som brukes til å administrere intakte MSC sfæroidene i mus. (D) Bilde som viser riktig plassering av pipettespissen inn i adapteren for polyuretanet kateteret. (E) Bilde av MSC kuler umiddelbart etter å ha passert dem gjennom kateteret inn i en kultur tallerken. Omtrent 95 kuler ut av 100 ble overført. (F) Effektivitet av sfære levering inn i bukhulen til mus ble bestemt ved å samle / lyserende kuler tilbakeholdt ipipette / kateteret og målecelletall, via en kommersiell DNA-baserte celle kvantifisering assay, i forhold til antallet av celler oppnådd fra en fullstendig utfylle lyserte kuler. Rød stiplet linje indikerer en overføringseffektivitet på 90%. Dårlig sfære levering (71%) ble observert med en injeksjon (pil). (G) Fase kontrast mikrografer av kuler i panelet E (forstørret visning). Scale bar = 200 mikrometer. (H) Fase kontrast micrograph av en XFM-1 / HSA sfære 16 timer etter overføring til en vev kultur parabolen. Den fibroblastisk, spindelformet morfologi av MSC-er opprettholdt i cellene som migrerte ut av kulen. Scale bar = 200 mikrometer. (I) ELISA-analyser for anti-inflammatorisk faktorer TSG6 og PGE2 ble utført på CM oppsamlet 6 timer etter overføring av kulene inn i 6-brønners plater inneholdende 2 ml aMEM / 2% FBS. Spheres utarbeidet i XF medium XFM-1 / HSA viste høyeste nivå av TSG6 og PGE2 sekresjon (røde bokser). Data uttrykt som middelverdi± SD, ble analysert ved t-test (*** p <0,001, sammenlignet med aMEM prøve). Noen data ble hentet fra den opprinnelige artikkelen med tillatelse fra utgiveren ^14. (J) Representative kurver som viser evnen til sfæroider, injisert inn i bukhulen, for å øke peritoneal PGE2 og IL-10 samtidig redusere nivået av TNFa hos mus utfordret ved intravenøs injeksjon av endotoksin (LPS). Prøvene ble oppnådd ved peritoneal lavage 6 timer etter induksjon av betennelse og levering av 80 kuler. Data uttrykt som gjennomsnitt ± SD, ble analysert ved t-test (* p <0,05, ** p <0,01, sammenlignet med kontroll). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den optimale MSC for bruk i noen forskning og kliniske applikasjoner bør være svært aktivert for å maksimere sin fordel, og fortrinnsvis utarbeidet under kjemisk definerte XF vilkår for å minimere levering av potensielle antigener fra xenogene mellom komponenter som FBS. I protokollen beskrevet her, har vi vist metoder til 1) aktivere MSC i 3D kultur ved dannelse av kuler, 2) oppnå 3D-aktivering av MSC henhold XF forhold, 3) vurdere aktiveringsnivå sfæroide MSC i forhold til deres anti- inflammatoriske, immunmodulerende og anti-kreft-potensial, og 4) leverer aktiverte MSCer som intakte kuler inn i mus.

MSC er multipotente stamceller som kan isoleres via plast tilslutning fra mange voksne vev inkludert benmargen og fettvev. MSC er lett spredd på vev kultur plast under relativt høy (10-20%) FBS konsentrasjoner, uttrykke et distinkt sett av overflatemarkører, ogkan skilles i det minste inn i adipogenic, osteogene og chondrogenic linjene ^{1, 16, 17, 18.} MSC har vist seg å utøve gunstige effekter i ulike dyremodeller av menneskelige sykdommer, selv om de ser ut til å vedvare bare forbigående etter deres administrasjon in vivo. Effekten av MSCer er derfor kalt "hit og kjør" og er ofte mediert av anti-inflammatoriske og immunmodulerende parakrine faktorer, slik som PGE2, TSG-6, og indoleamine 2,3-dioksygenase (IDO), utskilt av ^{MSC-2 , 3, 11, 19, 20, 21.} Imidlertid, for å fremstille disse faktorene, MSC krever aktivering, enten gjennom signaler fra en skadet vev eller fra immun calen til mottakeren. Deretter har det vært en voksende interesse for å utvikle MSC pre-aktivering eller grunning protokoller før levering av cellene i dyr eller pasienter ^22. Også har tilstedeværelsen av antigene FBS komponenter i standard MSC forberedelser reist bekymringer. Derfor studier har blitt utført for å bestemme optimale kjemisk definerte XF forhold for MSC kulturer. I vår siste arbeid, vi først viste at MSC kan aktiveres i 3D ved dannelse av sfæroider, og deretter oppdaget at celleaktivering kan også oppnås under spesielle betingelser XF ^{8, 12, 13, 14.}

3D cellekultur teknikker har vært ansatt i flere tiår med mål om å gi ekte fysiologiske forhold i cellebasert forskning. Kulturer i 2D se bort fra 3D natur vev og derfor ikke alltid rekapitulerecelle-til-celle og celle-til-matriks interaksjoner viktig i cellesignalisering. Mange 3D kulturteknikker bruke roterende beholdere, spinnerflasker, eller en rekke ikke-klebende overflater, men den største ulempe ved mange av disse fremgangsmåter er den heterogeniteten av den genererte sfæroide størrelse og / eller krav om spesifikke kostbart utstyr. Forskning har også blitt utført ved hjelp av hengende dråpe kulturer som hovedsakelig oppmuntrer MSC til spontant aggregat i en enkelt celleklump ^{4, 5, 6, 7, 8, 9, 23.} Spesielt, hengende slipp kulturer støtte montering av relativt ensartede mikro vev / råvarer, med den ekstra fordelen av å være i stand til å enkelt manipulere størrelsen på cellen samlet ved å justere celle konsentrasjon og / eller slippe volum. Videre mestring av hengende drop kultur teknikk krever ikke omfattende opplæring. Dråper 25-40 mL kan lett fremstilles med MSC ved høy cellekonsentrasjon, typisk 500-1000 celler per mL. Dråper mindre enn 20 ul tendens til å fordampe hurtig, og disse er større enn 45 ul ofte smøre tvers over lokket under inversjon. Men når bla en lokk som inneholder dråper av alle størrelser, hastighet og retningen er kritiske parametre for å vurdere for å opprettholde overflatespenning og hensiktsmessig form av rulle / spheroid. Uavbrutt kultur og riktig luftstrøm i inkubatoren er også viktig for å sikre MSC samlet inn i en enkelt kule i hver dråpe.

En ulempe med denne teknikken er at plater inneholdende hengende dråper ikke skal stables i kuvøse eller beveges under sfære monteringen, noe som gjør oppskalering for pasientbehandlinger vanskelige. Dessuten endrer medium i hengende slipp kulturer er ekstremt utfordrende, og dermed langsiktige kulturer bør være avoided. I tillegg kan den lave media-til-celle-forhold i hengende dråper føre næringsutarming og avfall akkumulering slutt fører til tap av viktige cellefunksjoner og / eller celledød.

Men med riktig hengende dråpe teknikk, har vi vist at MSC i sfæroider blir svært aktive eller primet, ved at cellene blir fabrikkene av den kraftige anti-inflammatoriske molekyler PGE2 og TSG6, så vel som anti-kreft-molekyler IL-24 og STI. Vi har vist at sfæroider MSC er faktisk anti-inflammatoriske og immunmodulerende, og har anti-kreft egenskaper overlegne i forhold til deres 2D-monolags motstykker i en rekke funksjonelle analyser ved anvendelse av dyrkede makrofager, splenocytter og prostatakreftceller ^{8, 12, 13, 14.} Videre har vi vist at MSC-sfæroider kan utøve potente antiinflammatoriske effekter når de administreresinn i bukhulen til mus med peritonitt ^8. Nærmere bestemt viste vi at store kuler på omtrent 400-500 pm i diameter (25000-30000 MSCS hver) effektivt kan leveres i et lite volum av HBSS ved anvendelse av en 20G nål / katetersammenstilling og en standard pipette. Med denne teknikken, uriktig innsetting av kateter, noe som resulterer i høy motstand mot fluidstrømning, kan lett bestemmes før sfæroide overføring ved først å injisere et lite volum av HBSS / HSA som beskrevet i protokollene. Sfæroidene i et riktig plassert kateter vil flyte fritt, forutsatt at HBSS supplert med HSA for å minimalisere sfære adhesjon til plastrøret, og kan lett visualiseres. Dessuten forhindrer denne teknikken skjærspenning på celler som kan oppstå ved anvendelse av en standard nål / sprøyte for injeksjon, og unngår behovet for et kirurgisk innsnitt som bærer en høyere risiko for infeksjon og er mer teknisk utfordrende. En stor ulempe er that et stort antall sfæroider bare kan injiseres i store kroppshulrom, så som bukhulen, som motstanden mot kulen overføring gjennom kateteret er høy i trange områder.

Vi har også nylig vist at den samme grad av MSC aktivering i sfæroider kan oppnås ved hjelp av en spesiell kommersielt tilgjengelig XF medium, referert til her som XFM-en, så lenge det ble supplert med HSA erholdt fra humant blod eller fremstilles ved rekombinante teknikker ^14. Det er viktig å merke seg her at MSC sfæroider ikke produserer høye nivåer av PGE2 og TSG6 i alle typer media XF ^14, sannsynligvis fordi de fleste XF media for MSC ble opprinnelig utviklet for optimal ekspansjon av cellene i 2D. Det er også viktig å merke seg at forskjellige typer av HSA varierer i deres styrke ^14. I tillegg er det absolutte nivået av PGE2 påvist i CM av aktiverte kuler kan variere svaktly som ELISA anvendt for PGE2 er faktisk en konkurranseanalyse. Således er det viktig å inkludere egnede kontroller i alle PGE2 ELISA, og for å unngå direkte sammenligning av data mellom prøvene analysert ved forskjellige tidspunkter eller i forskjellige platene. Videre må MSC være grundig vasket i XF medium før fremstilling hengende dråper for å fjerne rester av CCM, og derfor begrense overføring av FBS komponenter. Protokollene er beskrevet her kan lett vedtatt å vurdere andre medier formuleringer om sfære dannelse og terapeutisk genuttrykk.

Åpenbart er tallrike celle-signalhendelser som normalt ikke forekommer i 2D MSC satt i bevegelse når MSC-er dyrket i 3D. Celle-til-celle og celle-til-matrise-interaksjoner mediert av cadherins og integriner guide sfæroide dannelse og komprimering ^{24, 25, 26} og vil sannsynligvis avgjørende for sfæroide terapi. Som cellene samlet og coMpact til sfæroider, ulike spenningssignaler, inklusive mindre apoptose, hjelpemiddel i ferd med MSC aktivering som resulterer i produksjon av en rekke potensielt terapeutiske forhold ^{4, 5.} Vi har tidligere vist den kritiske rollen autokrint IL-1 signalering i MSC aktivering og produksjon av PGE2 og TSG6 ^12. Selv om mye er fortsatt ukjent om de ulike signalveier som kan benyttes til MSC aktivering, gir en praktisk måte å studere dette fenomenet og forbedre MSC-basert terapi hengende dråpe kultur plattform. Totalt sett har vi beskrevet i protokollene her, midlene aktivere eller grunning MSC i 3D kulturer under kjemisk definerte XF forhold, for å produsere anti-inflammatorisk, immunmodulerende, og anti-kreft faktorer. Vi har også beskrevet hvordan disse intakte MSC kuler kan bli levert in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling