ייצור ומנהלה של גזע הטיפולי mesenchymal / תא סטרומה (MSC) Spheroids הדרוך בתרבויות 3-D בתנאים קסנו ללא

Abstract

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSCs) מחזיקים הבטחה גדולה Bioengineering ורפואה רגנרטיבית. MSCs יכול להיות מבודד רקמות בוגרות מרובות באמצעות הדבקות החזקה שלהם פלסטיק בתרבית רקמה ולאחר מכן להרחיב עוד יותר במבחנה, לרוב תוך שימוש בסרום שור עובר (FBS). מאז FBS יכול לגרום MSCs להפוך immunogenic, נוכחותה תרבויות MSC המגבילה הוא יישומים קליניים וניסויים של התאים. לכן, מחקרים והעסיקו עובדים ללא קסנו הגדרה כימית (XF) מדיה עבור תרבויות MSC היא יקרה ערך. השפעות מועילות רבות של MSCs יוחסו יכולתי לווסת דלקת חסינות, בעיקר באמצעות הפרשת גורמי מערכת חיסוניים כגון גן גורם מגורה נימק גידול 6 (TSG6) ו פרוסטגלנדין E2 (PGE2). עם זאת, MSCs מחייב הפעלה לייצר גורמים אלה שכן ההשפעה של MSCs היא לעתים קרובות חלף, עניין רב התפתח לגלות דרכים של טרום הפעלת PRIO התאיםr כדי השימוש בהם, ובכך לחסל את זמן השהיה עבור ההפעלה in vivo. כאן אנו מציגים פרוטוקולים כדי להפעיל ביעילות או MSCs הממשלה תלת ממדי (3D) תרבויות בתנאי XF הגדרה כימית ולנהל MSCs מראש מופעל אלה in vivo. באופן ספציפי, אנו מתארים שיטות ראשונות שיצרו MSC הכדורי-רקמות מייקרו או 'spheroids' בטיפות תלויות באמצעות מדיום XF ולהדגים כיצד הספירות והתנו הבינוני (CM) ניתן לקצור עבור יישומים שונים. שנית, אנו מתארים מסכי ביטוי גנים במבחנת מבחנים תפקודיים כדי להעריך את הרמה במהירות של הפעלת MSC ב spheroids, תוך שימת דגש על הפוטנציאל אנטי-דלקתי ואנטי-סרטני של התאים. שלישית, אנו מתארים שיטה חדשה להזריק spheroids MSC השלם לתוך חלל הצפק העכבר לבדיקות יעילות vivo. בסך הכל, את הפרוטוקולים בזאת להתגבר על האתגרים העיקריים של קבלת MSCs מראש מופעל תחת con XF הגדרה כימיתditions ולספק מערכת גמישה לניהול spheroids MSC עבור טיפולים.

Introduction

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSCs) הראה פוטנציאל גדול עבור גישות רפואת רגנרטיבית שונות. MSCs בתחילה בודדו כמרכיב סטרומה של מח העצם אבל מאז התקבלו מחברת רקמות בוגרות רבות אחרות, כולל רקמת שומן ^{1, 2, 3.} מעניין לציין, כי שיטת הבידוד העיקרית מחבק תכונה יוצאת דופן של MSCs להיצמד בחוזקה על פלסטיק בתרבית רקמה בנוכחות בסרום שור העובר (FBS). בעוד טכניקת בידוד המסורתית הזה מאפשרת רחבה קלה ומהירה של MSCs ב דו ממדים (2D) תרבות, זה גם מאוד מלאכותי ומתעלם משמעות של תלת ממדי (3D) בסביבה המקורית שמובילה לאובדן פוטנציאל של מאפיינים תאיים חשובים ^{4, 5 , 6.} לכן, המחקר של MSCs בתרבויות 3D, אשרהם יותר פיסיולוגיים מאשר תרבויות 2D מסורתיות, התפתח בחיפוש עבור "אבדו / פחתה" מאפייני MSC. יתר על כן, עניין רב עלה לזהות תנאים מוגדרים קסנו-חינם (XF) כימי לתרבות הפעלת MSC, ובכך להפוך את התאים יותר נוחים עבור יישומים קליניים.

מחקרים רבים פורסמו הוכחת תרבות 3D של MSCs היא biomaterials וכפי אגרגטים או spheroids כדוריים. MSCs ב biomaterials בתחילה תוכנן עבור גישות הנדסת רקמות להחליף רקמות פגועות עם פיגומי תא זרע, ואילו תרבויות אליפטית של MSCs נראו כדרך להבין את התנהגות MSC in vivo לאחר מתן של התאים עבור טיפולים בניסויים פרה-קליניים או קליניים ^{4, 5, 7.} מעניין, spheroids טופס MSCs ספונטני כאשר דבקות פלסטיק בתרבית רקמה אינה מותרת^{8, 9, 10.} באופן מסורתי, צבירה התא התאפשרה על ידי שיטות בקבוק טווה או טכניקות כיסוי נוזלי, שיטות השתמשו בתחילה בביולוגיה סרטן במאמצים לנסות לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול. לאחרונה, שיטות נוספות צצו ממחישי צבירת תא כלי תרבות מראש מצופית עם כימיקלים מסוימים כדי למנוע תא אל הפלסטיק דבק ^{4, 5, 6.} אחת השיטות הפשוטות ביותר וחסכוני ליצור spheroids MSC היא תרבות אותם בטיפות תלויים, טכניקה ששימשה לעתים קרובות לייצר גופים embryoid מתאי גזע עובריים. עם תלוי טכניקת תרבות ירידה, דבקות תא הפלסטיק בתרבית רקמת נמנע בשל השעיית תאי ירידה של מדיום על החלק התחתון של מכסת צלחת בתרבית רקמה ומאפשר הכביד כדי להקל תא aggregation ב הקודקוד של ירידה. גודל אליפטית ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי ריכוז התא או נפח ירידה, מה שהופך תרבויות Drop Hanging במיוחד קל לשלוט.

מחקרים מוקדמים על תרבות 3D של MSCs הפגינו שוני קיצוני קיים בין המאפיינים של תאי 3D לעומת עמיתיהם 2D שלהם ^{6, 8, 9.} במקביל, דיווחים הראו כי ההשפעות המיטיבות של MSCs in vivo הסתמכה על יכולתם להיות מופעל על ידי רמזים מיקרו-סביבתיים, בתגובה, כדי לייצר אנטי דלקתי אימונו גורמי ^11. מעניין לציין, כי רבים של גורמים אלה כגון פרוסטגלנדין E2 (PGE2), מגורה גורם נמק גידול גן 6 (TSG6), ואת גורם הגדילה hepatocyte (HGF) יוצרו בכמויות הרבה יותר גדול על ידי spheroids MSC מ MSCs 2D המסורתית לסלול את הדרך עבור רעיון שלבתרביות 3D כדי להפעיל את תאי ^{8, 12, 13.} יתר על כן, הפעלת גנים בתרבויות 3D הופיע לשחזר מנגנונים, לפחות חלקית, של הפעלת תא לאחר ההזרקה לעכברים ^12. על ידי הפעלת MSCs לפני השימוש בם בניסויים, אפקטים של התאים עשויים להתמשך ובולטים יותר כהשפעת MSC המסורתית in vivo היא לעתים קרובות מתעכבת וחולפת, והוא יכול להיות מתואר כמו "פגע וברח". במהלך השנים האחרונות, מחקרים תפקודיים חשובים באמצעות spheroids MSC הוכיחו כי הם יכולים לדכא תגובות דלקתיות ולווסת חסינויות in vivo באמצעות השפעה על תאי מפעיל כגון מקרופאגים, תאים דנדריטים, נויטרופילים, ותאי T ביצוע spheroids צורה אטרקטיבית של MSCs הדרוך ^{2 , 3.} בנוסף, ייצור של מולקולות אנטי-סרטניות, כגון interleukin-24 (IL-24) ו נימקים גידול קשור גורם ליגנד וישכנע אפופטוזיס (TRAIL), גוברים בתרבויות 3D של יחסי MSCs כדי חד שכבתי MSCs, תופעה שעלולה להיות מנוצלת על בטיפולי הסרטן ממוקד ^{8, 10, 14.}

כמו התרבות MSC המסורתית נדרשה לא רק את שימוש פלסטיק בתרבית רקמה אלא גם FBS, משוכה נוספת וגדילה ל spheroids MSC יותר נוחה לשימוש קליני היה הצורך להתגבר. כדי להתמודד עם המשוכה הזאת, הראינו היווצרות לאחרונה של spheroids MSC בתנאי XF ספציפי הגדרה כימית והקמתי כי spheroids MSC וכתוצאה מכך הופעל לייצר המולקולות אנטי-דלקתית ואנטי-הסרטניות הזהות spheroids שנוצר בתנאים עם FBS ^14. הנה, ממצאים אלה מוצגים בכמה פרוטוקולים מפורטים המדגימים את הדור של MSCs מראש המופעל בתרבויות 3D באמצעות XFכְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת. בנוסף, פרוטוקולים מוצגים המתארים דרכים יעילות כדי להעריך את רמות ההפעלה של MSCs לגבי ההשפעות אנטי דלקתית, המערכת החיסונית ואנטי סרטן שלהם, יחד עם שיטה מעשית כדי לספק את spheroids השלם לעכברים.

Protocol

בידוד MSC 1. והרחבה

1. השג MSCs מעבר מוקדם מן המרכז הכנה והפצה של תאי גזע בוגרים ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) ¹⁵ בקבוקונים קפוא כמו. לחלופין, לבודד MSCs מ aspirates מח עצם בעקבות פרוטוקול שגרתי ¹⁴ ולאחסן כמו צלוחיות קפוא.
2. הכן בינוני תרבות שלמה (CCM), המהווה אלפא מדיום חיוני מינימלי (αMEM) בתוספת פרמיה 15-20% בחרו FBS, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו 1x-סטרפטומיצין פניצילין. לעקר את המדיום על ידי סינון.
3. מניחים 30 מ"ל של CCM לתוך צלחת תרבית תאים 150 מ"מ ו דגירה את המנה למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכיל 5% CO _2.
4. דגירה בקבוקון קפוא המכיל כ 10 ⁶ MSCs למשך 2 דקות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
5. מעבירים את תכולת הבקבוקון כדי בצלחת תרבות באמצעות pipet 5 מ"ל סרולוגיות ולשטוף מספר פעמים בקבוקון עם 1-2 CCM מ"ל מצלחת ללכוד תאים שיורית. מניחים את לילה המנה באינקובטור המתאים.
6. בזהירות לשטוף את תרבות פעמיים עם בופר פוספט בטמפרטורת החדר (PBS) ולנתק את MSCs עם 3 מ"ל של תמיסת מראש חימם 0.25% טריפסין / ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). ניתוק בדרך כלל לוקח כ 3-4 דקות בחממה.
7. לנטרל את טריפסין בצלחת עם 6 מ"ל CCM מחומם מראש ל -37 ° C ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. מערבבים עם שטיפות של PBS על מנת למקסם את התשואה התא.
8. בצנטריפוגה תאים (450 XG) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לשאוב supernatant.
9. Re- להשעות את התאים בנפח קטן של CCM לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer trypan כחול.
10. זרעים של מספר הולם של מנות 150 מ"מ ב -100 תאים / ² ס"מ
11. קציר התאים כנ"ל עם טריפסין / EDTA ולשלב כל התאים לתוך צינור חרוטי יחיד עם המדיום המתאים. צנטריפוגה שוב מחדש להשעות את התאים לתוך נפח קטן של אותו המדיום עבור ספירת תאים. השתמש CCM סטנדרטי (המכיל FBS) או שונים זמינים מסחרית ניסוחים מדיה XF, כאן המכונה XF בינוני 1 (XFM-1) ו XF בינוני 2 (XFM-2), עם או בלי אלבומין בסרום אדם (HSA, 13 תוספת מ"ג / מ"ל).

2. הכנה הופעל MSC Spheroids ב 3-D תליית תרבויות זרוקות תחת תנאי XF

1. כדי ליצור spheroids של 25,000 תאים כ, לדלל את MSCs שנקטפו לתוך CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 מ"ג / מ"ל), XFM-2, או XFM-2 + HSA (13 מ"ג / מ"ל) ב 714 תאים / μl.
2. טיפות פיפטה 35 μl / של תאים על גביהחלק התחתון של מכסה צלחת תרבות הפוכה 150 מ"מ. טיפות מרובות ניתן pipetted בקלות באמצעות פיפטה רבה.
   הערה: אם spheroids גדול יותר או קטן הם רצויים, לשנות את ריכוז תאים או נפח הירידה (25-45 μl) כראוי.
3. העבר 20 מ"ל של בטמפרטורת החדר PBS לתוך הבסיס של המנה ובאחד תנועה רציפה ויציבה להעיף את המכסה, המכיל את טיפות, כך apices ירידה כלפי מטה. מניח את המכסה בזהירות על הבסיס של מנת התרבות.
4. מעביר את הצלחת לתוך החממה במשך 3 ימים מבלי להפריע זה להתיר הרכבה בתחום מתאימה.
5. לאחר 72 שעות, להתחיל את הקציר אליפטית ידי הסרת המכסה בזהירות היפוך זה כך טיפות, שוב, כלפי מעלה.
6. זווית את המכסה כ 10-20 ° ולדחוף את טיפות, המכיל את spheroids, עד לקצה הצלחת באמצעות מרים תא.
7. מעבירים את התחומים ובינוניים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל עם צינור μl 1,000טטי. השתמש בטמפרטורת החדר PBS ו פיפטה עם אותו קצה לשטוף את הצלחת להבטיח התאוששות מקסימלית של spheroids.
8. עבור מבחני PCR בזמן אמת (פרוטוקול 3), בצנטריפוגה ההשעיה בתחום ב -450 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר לשאוב supernatant. שטפו את spheroids עם PBS וחזור הן הצעדים צנטריפוגה והשאיפה. למסירה לתוך חיים (פרוטוקול 8), לאפשר התחומים להתיישב התחתון של הצינור (~ 3-4 דקות) ללא צנטריפוגה.

3. PCR בזמן אמת של סמנים ואנטי דלקתי אנטי-סרטניות

1. השתמש בערכת RNA החילוץ עם עמודות homogenizer ו RNase ללא DNase סט לבודד RNA סך DNA ללא מ MSCs בשכבה (פרוטוקול 1) ו spheroids MSC (פרוטוקול 2) כי נשטפו עם PBS ו centrifuged.
2. Lyse לפחות 100,000 MSCs בשכבה ו -20 spheroids מכל מצב צינורות חרוטי 15 מ"ל נפרד עם חיץ RLT המכיל β-mercaptoethanol (1: 100).
3. עָבָרFER את lysates מעורבת ביסודיות לתוך צינורות 1.5 מ"ל RNase ללא מקום לתוך המקפיא (-80 מעלות צלזיוס) במשך לפחות 3 שעות כדי לסייע תמוגה אליפטית.
4. ההפשרה lysates התא על קרח, מערבולת בקצרה, ופעל בהתאם להוראות היצרן עבור בידוד RNA באמצעות ערכת בידוד RNA הכולל יונקים זמינים מסחרית.
5. לכמת ולהעריך את איכות RNA הבודד באמצעות ספקטרופוטומטר.
6. השתמש בקיבולת גבוהה ערכת שעתוק לאחור cDNA או שווה ערך על פי הוראות היצרן כדי ליצור cDNA עבור PCR בזמן אמת.
7. מניחים דגימות cDNA, נועד מסחרית פריימרים PCR בזמן אמת / בדיקות (מבחני ביטוי גנים), ו- PCR מיקס מאסטר על הקרח. השתמש פריימרים / בדיקות עבור GAPDH (שליטה), PTGS2 (COX-2, אנטי דלקתי), TNFAIP6 (TSG6, אנטי דלקתי), TRAIL (נגד סרטן), ו- IL-24 (אנטי סרטניים).
8. הכן את התגובות בזמן אמת PCR פי הוראות היצרן עבור מבחני ג'ין הביטוי Unive מהירמיקס מאסטר rsal.
9. פעל בהתאם להנחיות עבור מכשיר PCR בזמן האמת להפקת מסמכי הניסוי וביצוע הריצה.
10. לנתח את הנתונים בשיטת _T ΔΔC ידי חישוב השינויים היחסיים (כמות יחסית, RQ) ב ביטוי גנים באמצעות GAPDH כמו MSCs המלא בשכבת אנדוגני כבסיס ^{8, 14.}

אוסף 4. של CM עבור מבחנים של מערכת חיסונית ואת הפוטנציאל אנטי-סרטני

1. קציר spheroids ו CM כמתואר לעיל לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, באמצעות מרים תא ו פיפטה, לעומת זאת, לא לשטוף את מכסים בצלחת עם PBS כמו זה יהיה לדלל את CM.
2. צנטריפוגה ב 450 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות לאסוף את supernatant תא ללא עם טפטפת, ולהעביר את supernatant לתוך צינורות 1.5 מ"ל.
3. צנטריפוגה ב XG 10,000 למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות לאסוף את CLCM arified עם טפטפת, ולהעביר את CM לתוך צינורות 1.5 מ"ל חדש לאחסון במקפיא (-80 ° C). כן aliquots של CM לפני ההקפאה כאשר משתמשים בו עבור מבחנים מרובים.
   הערה: לפני ביצוע מבחנים במורד זרם, ריכוז PGE2, אינדיקטור טוב של פוטנציאל אנטי-דלקתי של CM, ניתן לקבוע באמצעות ערכת ELISA מסחרית לפי הוראות היצרן. ריכוז TSG6 ניתן לקבוע באמצעות פרוטוקול פרסם ^14.

5. Assay Macrophage כדי להעריך את הפוטנציאל האנטי-דלקתיות של MSC-CM

1. הכן בינוני מקרופאג, אשר מורכב של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל L-alanyl-L- גלוטמין ו בתוספת 10% פרמיה לבחור FBS ו 1x פניצילין, סטרפטומיצין. מסנן לעקר את המדיום.
2. השג בקבוקון קפוא של כ 10 ⁶ מקרופאגים העכבר J774 דגירה בקבוקון למשך 2 דקות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
3. לשאוב supernatant, להשעות את מקרופאגים לתוך 1 מ"ל של מדיום מקרופאג, ולהעביר את מקרופאגים לתוך צלחת פטרי 150 מ"מ המכיל 30 מ"ל של מדיום מקרופאג.
4. שנה את בינונית כל 2 ימים דגירה התאים בחממה עד ומחוברות 70-80% כ.
   הערה: המקרופאגים לא להיצמד בחוזקה כדי בצלחת פטרי, ובכך יש להיזהר לא לאבד את התאים עם שינוי בינוני.
5. קציר מקרופאגים ידי ריסוס המדיום מקרופאג על גבי תאים עם טפטפת. העברת התאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 200-300 XG ו בטמפרטורת החדר.
6. לשאוב supernatant ו להשעות את תאי נפח קטן של מדיום מקרופאג עבור ספירת תאים עם hemocytometer. התאם את הריכוז 200,000 תאים / מ"ל ​​עם מקרופאג ליdium.
7. כדי להפעיל את להגדיר עבור assay מקרופאג, להוסיף 480 μl של מדיום מקרופאג לתוך הבארות של צלחת 12-היטב.
8. הוסף 20 μl של מדיום מקרופאג לתוך בארות שליטה הלא מגורה 20 μl של בתווך בלתי מותנה או MSC ממוזג, מוכן לעיל, בבארות ניסיון. מערבבים את בינוניים הבארות על ידי הקשה על צלחת.
9. העבר 500 μl של השעית תא מקרופאג אל בארות שליטה מקרופאג הלא מגורה.
10. לעורר את מקרופאגים הנותרים עם תוספת של 1: 500-1: 1,000 של 0.1 מ"ג / מ"ל ​​lipopolysaccharide (LPS) דגירה 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
11. העבר 500 μl של מקרופאגים מגורה לתוך הבארות עם בתווך בלתי מותנה או MSC ממוזג. מערבבים את בארות ידי בהתמדה נדנדה את הצלחת כמה פעמים.
12. מעביר את הצלחת באינקובטור במשך 16-18 שעות.
13. קציר המדיום ממוזגים מקרופאג ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
14. לְהַעֲבִירsupernatant לתוך צינורות assay חדשים עבור אלפא tumor necrosis factor (TNF-α) ו- interleukin-10 (IL-10) תוכן לפי ערכות מסחריות ELISA בעקבות הוראות היצרן.

6. Assay Splenocyte כדי להעריך את הפוטנציאל המערכת החיסונית של אליפטית-CM

1. הכן בינוני splenocyte מלאה, אשר מורכב של מכון הזיכרון Rosewell פארק (RPMI) בינוני -1640 בתוספת 10% חום מומת FBS, סטרפטומיצין פניצילין 1x, ו -2-mercaptoethanol. מסנן לעקר את המדיום.
2. טחול קציר מעכברים BALB מורדמים-זכר / ג דרך חתך מוכן בצד השמאלי של הבטן מעל הטחול, כ באמצע הדרך בין החלק הקדמי ורגליו האחוריות ^14. מעבירים את הטחול כדי מסננת תא 70 מיקרומטר לבודד את splenocytes ^14.
3. לבודד את splenocytes / לימפוציטים על ידי לחיצה על טחול דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך usin צלחת פטרי סטריליתז סוף רך גומי / פלסטיק של הבוכנה של 2-3 מ"ל מזרק ^14. השתמש תנועה מעגלית שחיקה לנתק את הטחול.
4. שטפו את מסננת תא מספר פעמים עם PBS קר להעביר תאים מצלחת פטרי לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. מלאו את הצינור עם PBS קר צנטריפוגות (500 XG) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
5. לשאוב supernatant ולנקות את התאים מן אריתרוציטים ידי הדגירה עם 5-10 פתרון תמוגה תאי הדם האדומים מ"ל (מחיר הטחול) למשך 5-10 דקות.
6. עצור את תמוגה על ידי הוספת PBS קר אל הצינור צנטריפוגות במשך 5-10 דקות ב XG 500 ו ב 4 מעלות צלזיוס.
7. להשעות את התאים המבודדים במדיום splenocyte מלא, לסנן דרך מסננת 40 מיקרומטר, לספור את התאים באמצעות hemocytometer. הוסף בינוני splenocyte על השעיית התא כדי להשיג ריכוז התא הסופי של 10 ⁶ תאים / מ"ל
   הערה: טכניקה זו בדרך כלל מניבה כ 3 x 10 ⁷ splenocytes לכל טחול עכבר.
הערה: כמות splenocytes נדרשת תלויה במספר תנאי ניסוי כפי שנקבע על ידי החוקר (ראה שלב 6.9). עבור כל מדגם ניסיוני / טוב, 10 ⁶ splenocytes נדרשים.
8. העברת 10 ⁶ splenocytes (מגורה או הלא מגורה) לתוך הבארות של צלחת 12-היטב ולהוסיף ממוזג הלא (שולטת) או MSC-CM לתוך בארות בדילול סופי של 1: 10-1: 20.
9. קציר את CM splenocyte לאחר 24 שעות ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
10. מעביר את supernatant לתוך צינורות assay חדשים עבור גמא אינטרפרון (IFN-γ) תוכן ידי ערכת מסחרי ELISA בעקבות הוראות היצרן.

7. Assay סרטן הערמונית כדי להעריך את הפוטנציאל האנטי-סרטניות של אליפטית-CM

1. כן בינוני צמיחת RPMI שלם כי הוא בינוני RPMI-1640 בתוספת 10FBS%, 1x-סטרפטומיצין פניצילין.
2. השג בקבוקון קפוא של תאי סרטן ערמונית LNCaP דגירת הבקבוקון עבור 2 דקות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
3. מעבירים את תכולת הבקבוקון לתוך צלחת תרבות המכיל 30 מ"ל של מדיום הגידול RPMI להשלים באמצעות pipettor ממונע ו pipet סרולוגיות 5 מ"ל. שטוף את פעמי בקבוקון כמה עם מדיום מצלחת ומניח בצלחת לתוך החממה.
4. רק לפני התאים להגיע confluency, לשטוף את תרבות פעמיים עם בטמפרטורת החדר PBS ולנתק את תאי LNCaP עם 3 מ"ל של תמיסת טריפסין מחומם מראש 0.25% / EDTA.
5. לנטרל את טריפסין בצלחת עם מדיום הגידול RPMI להשלים ולהעביר את התאים יחד עם שטיפות לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
6. צנטריפוגה התאים ב 450 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לשאוב supernatant.
7. מחדש להשעות את התאים לתוך נפח קטן של מדיום הגידול RPMI המלא ולספור את התאים הסרטניים באמצעות hemocytometer.
8. כדי לבצע assay צמיחת תאים באמצעות ערכת assay תא התפשטות, לשאוב את המדיום מבאר ולהעביר את הצלחת לתוך במקפיא (-80 ° C) לפחות 3 שעות.
   1. להפשיר את הצלחת lyse התאים בכל טוב על ידי הוספת 100 μl של מגיב תמוגה התא המכיל 180 mM NaCl, 1 mM EDTA, ו -0.2 מ"ג / מ"ל ​​RNase א
   2. עבור עקומת סטנדרט, לסכומים ידועים lyse של תאי LNCaP כמתואר לעיל.
   3. אחרי השעה 1, להוסיף 100 μl של חיץ תמוגה תא 1x המכיל 1: 100 דילול של מגיב assay התפשטות תאים למדוד את הקרינה בכל טוב כדי לקבוע את הכמות התאית.

8. משלוח Intraperitoneal של Spheroids Intact

1. הכן MSCs אליפטית כמתואר לעיל (פרוטוקול 2) ו resuspend tהוא בתחומי המלח המאוזן של סטרילית האנק הפתרון (HBSS) השלים עם 0.2-0.5% HSA כדי לשמור על תנאי XF. HSA בפתרון מסייע במניעת הידבקות לכדור הפלסטיק במהלך הזרקה.
2. העבר 40-120 spheroids לתוך 15 מ"ל צינורות חרוטי ולשטוף את התאים על ידי הוספת 6 מ"ל HBSS / HSA של חצוצרות. אפשר 3-4 דקות עבור תחומים לרדת. הכין צינור חרוטים עצמאי של spheroids עבור כל חיה. כמו כן, להכין צינורות נוספים של spheroids עבור מבחני קביעת שימור אליפטית (ראה 8.18 להלן) וייצור של גורמים טיפוליים לאחר ההעברה (ראה 8.19 להלן) אם תרצה בכך.
3. לשאוב supernatant, כיסוי הספרואידים עם 100-200 μl של HBSS סטרילי השלימו עם 0.2-0.5% HSA, ולמקם את הצינורות על הקרח.
4. בקצרה להרדים את החיות עם isoflurane 2% ב 100% חמצן עד היעלמות רפלקס קמצוץ הבוהן כ 2 דקות בחדר אינדוקציה.
5. מניח את החיה בתוך ארון BSL-2, הגבה aspeCT למטה (בצד הגחון כלפי מעלה), עם זרימה רציפה של תערובת 1.5% isoflurane / חמצן באמצעות חרטומו.
6. נקה את בטן העכבר הנמוכה עם כזה חיטוי כמו אלכוהול 70%.
7. הסר את המכסה של 20 תוך ורידי G (iv) קטטר ולבצע את זריקת intraperitoneal עם הרכבת קטטר-סטילטו. השתמש ביד אחת להחזיק את עור העכבר אחר לבצע את הזריקה. אתר את נקודת ההזרקה בערך באמצע של קו מלאכותי חיבור אזור משותף מין ברך מכווצת עם קצה המחט מצביע לכיוון קו האמצע.
   הערה: הרכבת קטטר-הפגיון בעל עמידות גבוהה יותר מאשר מחט רגיל, ולכן אכפת צריכה להילקח כמו לא להזריק את המחט עמוקה מדי לתוך הבטן, אשר יכול לגרום לפגיעה באיברים פנימיים. חדירה של העור ולאחר מכן שרירים / קרום הצפק יכולים להיות מורגש במהלך השמת צנתר.
8. הוצא בעדינות את המתכת סטילטו / מחט ממכלול קטטר-סטילטו. check את פגיון דם, שתן וצואה וזורק אותו. דם על המחט מצביע ניקוב האיבר הפנימי (ים).
9. החזק את הקטטר הפלסטיק בתנוחה זקופה במהלך הזריקות להתיר זרימת נוזל.
10. אשר את המיקום הנכון של הקטטר פלסטיק ידי הזרקת כ 100 μl של סטרילית HBSS / HSA באמצעות קטטר בעזרת פיפטה עם קצה 100-200 μl. מניחים את הקצה של קצה פיפטה בתוך מתאם מזרק קטטר להרכיב חותם חזק. לאט לאט להזריק את הנוזל בתוך חלל הצפק.
    הערה: נוזל קטטר וממוקמים כראוי יזרום בחופשיות בתוך חלל הצפק עם התאמה קלה בלבד של הקטטר. מיקום לא תקין של הקטטר (תת עורית או תוך-מעיים, או אם קצה האיברים הצפק נפצע המחט כגון כליות) יגדיל התנגדות ולהפחית זרימה. מיקום תת עורי יגרום במערך של "בועה" ברורה מתחת לעור.
11. אסוף tהוא MSC spheroids, ערוכים 100-200 μl של HBSS / HSA (שלב 8.3), באמצעות קצה פיפטה 200 μl, ולהעביר את כל נפח של כדורים (40-120 תחומים) לתוך חלל הצפק באמצעות קטטר כפי שתואר לעיל.
12. שטפו את שפופרת המכילה תחומי עם 100 μl של HBSS / HSA באמצעות אותו קצה כנ"ל לאסוף כל spheroids שיורית ולהזריק אותם לתוך חלל הצפק.
13. (אופציונלי) להזריק 100 μl נוסף של HBSS / HSA לתוך חלל הצפק כדי לשטוף את הקטטר.
14. מניחים את פד גזה טבול חומר מחטא על קטטר ולאט לאט להסיר את הקטטר מחלל הצפק וזורקים אותו.
15. בעדינות לעסות את חלל הצפק עם האצבעות על מנת להבטיח חלוקה שווה של spheroids.
16. בואו החיה להתאושש תחת השגחה צמודה ולצפות לדימומים מאתר ההזרקה.
17. בדוק את הקטטר ואת צינור 15 מ"ל לכל spheroids הנותרים. זה נורמלי לצפות כמה כדורים בקטטר / צינור.
    הערה: הטכניקה המתוארת למסירת אליפטית MSC יכולה להיות מאומצת לשימוש בחיות נורמליות או במגוון מודלי פציעה. טכניקה זו שימשה בהצלחה להזריק spheroids לפגיעה בקרנית העכבר ומודלים endotoxemia, כמו גם מודל הצפק הנגרמת zymosan ^8.
18. כדי לכמת את מספר spheroids שמר (לא חובה), השתמש מגיב / ערכת כימות מספר הסלולרי מבוסס-DNA. החזק את הקטטר בשימוש מעל הצינור 15 מ"ל נמרצות לוותר HBSS / HSA באמצעות קטטר לכפות על כל התחומים הנותרים בחזרה לתוך הצינור 15 מ"ל.
    1. צנטריפוגה שפופרת 15 מ"ל ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר לשאוב supernatant. מעביר את הצינור המכיל את הגלולה אליפטית לתוך מקפיא (-80 מעלות צלזיוס) במשך לפחות 3 שעות.
    2. להפשיר את הצינור lyse הספירות על ידי הוספת 500 μl של מגיב תמוגה התא המכיל 180 mM NaCl, 1 mM EDTA, ו -0.2 מ"ג / מ"ל ​​RNase א
    3. עבור פקד, freEze ו lyse כמות של spheroids ידוע (רצוי שווה למספר של spheroids מוכן זריקה אחת) כמתואר לעיל.
    4. אחרי שעה 1, להעביר 100 μl של lysate התא, בשני עותקים, לתוך microplate 96-היטב ולהוסיף היטב כל 100 μl של חיץ תמוגה התא 1x המכיל 01:50 דילול של מגיב assay התפשטות תאים מתוך הערכה. לאחר 10 דקות, למדוד את הקרינה בכל טוב כדי לקבוע את מספר תחומים שלא הוזרקו ידי השוואת המדגם הניסיון (ים) עם מדגם השליטה.
19. להעריך את רמת ההפעלה של spheroids המוכן להזרקה (אופציונלית) על ידי מדידת ריכוז של PGE2 ו TSG6 המיוצר על ידי תחומי עבירה. העברת 40-120 התחומים באמצעות קטטר, כמתואר לעיל, לתוך צלחת 12-היטב או 6-היטב המכיל 1 או 2 מ"ל αMEM בתוספת 2% FBS ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין. מניחים את הצלחות בחממה במשך 6 שעות.
    1. מעבירים את המדיוםהבארות לאחר 6 שעות לתוך 1.5 או 15 מ"ל צינורות צנטריפוגות צינורות ב 450 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. מעבירים את supernatant תא ללא לתוך צינורות 1.5 מ"ל טרי בעזרת פיפטה ו צנטריפוגות ב XG 10,000 למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. מעביר את הבהיר CM (supernatant) לתוך צינורות 1.5 מיליליטר ו assay חדשים עבור ריכוז PGE2 (אינדיקטור טוב של פוטנציאל אנטי-דלקתי של CM) באמצעות ערכת ELISA מסחרית לפי הוראות היצרן. ריכוז TSG6 ניתן לקבוע באמצעות פרוטוקול פרסם ^14.

Representative Results

בעבודה הנוכחית, תרבויות ירידה תלויות הועסקו כדי ליצור רקמות מייקרו כדורי קומפקטיות או 'spheroids' של MSCs מופעל בתנאי XF. מפת דרכי המחקר באיור 1 מתארת כי MSCs מעודד עצמי להרכיב לתוך spheroids מרחף תלוי טיפות במשך 72 שעות, שלאחריו spheroids, או CM עמוסה גורמים טיפוליים הנגזר בתחום, ניתן לאסוף ולנצל פוטנציאל בשני מחקר ויישומים קליניים. המספר הגדול של תאים הדרושים לייצור בתחום ניתן לרכוש בתוך שבוע על ידי זריעת MSCs בצפיפות נמוכה, בדרך כלל 100-200 תאים לסנטימטר ^2, ולאחר מכן להרחיב את התאים במשך 6-7 ימים עד כ 80% ומחוברות (איור 2 ). קינטיקה צמיחת תאים, נקבע על ידי ספירת תאי קיימא יומית, ציינה כי בשלב התרחבות איתן של משק (יום 3-7) כדלקמן שלב בפיגור קצר של 1-2 ימים (איור 2 ג </ Strong>). MSCs בקטע 2 או 3 בדרך כלל תשואה 50-100 מיליון תאים מבקבוקון אחד של 1 מיליון תאים cryopreserved כאשר בתרבית CCM.

בעקבות התרחבות קציר, MSCs מושעה בריכוז תא גבוה כדי ליצור spheroids, בדרך כלל 500-1,000 תאים לכל μl. תרבויות Drop Hanging ערוכות על ידי העברת 25-40 טיפות μl של מדיום המכיל את MSCs על החלק התחתון של מכסת צלחת רקמות-תרבות, אשר הוא התהפך לאחר מכן וממוקם כראוי על הבסיס של המנה (איור 3). כאשר מרחפי 35 טיפות μl של CCM ב 714 תאים לכל μl (כלומר 25,000 תאים לכל טיפה), MSCs להרכיב ראשון לתוך אגרגטים קטנים שבסופו של דבר להתמזג כדי ליצור כדור קומפקטי אחת ב 72 שעות ב הקודקוד של הירידה (איור 3 ג). Spheroids גם מהווה למעלה מ -72 שעות בכמה סוגי המדיה זמינה מסחרי XF אופטימיזציה להרחבת MSC, כאן המכונה XFM-1 ו XFM-2. עם זאת, היווצרות של תחומים קומפקטיים אחת ב XFM-1 דורשת תוספת של 13 מ"ג / אלבומין אנושי מיליליטר (HSA), ריכוז המשקף את תכולת החלבון הכולל נאמדה ב CCM (האיור 3D). תחומים קומפקטיים אחת לא יוצרים קושי הבסיסי XFM-1 ללא HSA או αMEM חלבון ללא (האיור 3D). במהלך הרכבה בתחום, שינויי פנוטיפ MSC באופן קיצוני (איור 4), וכאשר במדיום XF כימי המוגדר המתאים (כלומר XFM-1 + HSA), ביטוי של גורמים רבים אנטי-דלקתיים הוא שהוגבר כולל PGE2 ו TSG6 (איור 4C). עם זאת, הייצור של TSG6 ו PGE2 אינו augmented ניכרת MSCs מתורבת כמו בתחומים XFM-2 או XFM-1 ללא HSA (איור 4C). יש לציין אלה גורמים אנטי-דלקתיים, כמו גם את TRAIL גורם אנטי סרטני ו- IL-24, היו שהוגבר מאוד אליפטית MSCs ביחס חד שכבתי MSCs, כאשר tהוא Spheres היה בתרבית-1 XFM בתוספת או HSA רקומביננטי (rHSA) או כיתה קלינית HSA (cHSA) שהוכן דם אדם (האיור 4D).

כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של תחומי MSC המוכנים בניסוחי תקשורת שונים, כמה בדיקות מעשיות מבוצעות (איור 5). המאפיינים החיסוני-modulatory של spheroids נקבעים ראשונים במבחנה על ידי מדידת ההשפעה של הכדור CM על רמות ציטוקינים המיוצרים על ידי מקרופאגים מגורה LPS ו CD3 מגורה splenocytes / לימפוציטים (איור 5). ס מ MSC Spheres בתרבית CCM ו XFM-1 / HSA ייצור דיכא במידה ניכרת של מקרופאג TNFα ו splenocyte IFNγ, בעוד באותו הזמן רמות משופרות של ציטוקינים אנטי דלקתיות IL-10 (איור 5 א ו 5 ב). תכונות אנטי-סרטניות של תחומי מוערכים על ידי מדידת השפעות o בתחום CMצמיחת n ומורפולוגיה של תאי סרטן ערמונית LNCaP. מדיום XF XFM-1 / HSA מופחת ביעילות LNCaP התפשטות דומה FBS המכיל CCM (איור 5 ג ו 5D).

חשוב לציין, תחומי MSC שלם יכול להינתן לתוך חלל הצפק של עכברים כדי לבדוק את פעילות אנטי דלקתית של תאים in vivo (איור 6). בניסויים אלה, כדורים מוכנים להזרקת HBSS המכילים ריכוז נמוך של HSA, אשר ממזער ההידבקות שלהם כדי צינורות פלסטיק תוך שמירת מדינת XF. בהמשך לכך, כדורים ניתן להזריק בקלות לאחר העברה מהצינור האוסף (איור 6 א), בעזרת פיפטה (איור 6), דרך הרכבת המחט / קטטר (איור 6 ג ו 6D) ממוקמת כראוי עבור זריקת intraperitoneal סטנדרטית. בגישה זו, spheroids MSC יכול להיות באופן קבועיותר הועבר על יעילות מ -90% (איור 6E ו 6F) מבלי לשבש שלמותם (איור 6G ו 6 שעות). מיצוב נכון של קצה הצנתר בתוך חלל הצפק מוביל משלוח כדור עניים ושימור גבוה (איור 6F). חשוב לציין, רמת שימור כדור בתוך פיפטה / קטטר יכולה להיקבע באופן איכותי על ידי בדיקה ויזואלית, או כמותית על ידי איסוף / lysing ספירות שמר ומדידת מספר סלולארי עם ריאגנט כימותים מבוסס תאי DNA זמין מסחרי / ערכה (האיור 6F). ניתוח שימור כדור שלאחר הזרקה עוזר ליצור קריטריוני הכללה / הדרה במהלך ניסויים. יש לציין, כי היכולת של spheroids CCM ו XFM-1 / HSA להפריש רמות גבוהות של TSG6 ו PGE2 נשמרות לפחות 6 שעות לאחר העברת הספירות מ תלויים תרבויות ירידה (איור 6i). בדומה שלהם במבחנה EFfects, XFM-1 / תחומי HSA מוזרק לתוך חלל הצפק של עכברים, מיד לאחר אינדוקציה של דלקת מערכתית על ידי הממשל iv של LPS, PGE2 משופרת ו- IL-10 רמות ב הצפק תוך הפחתת TNFα פרו-דלקתיים (איור 6-י).

איור 1: ייצוג סכמטי של הפלטפורמה שפותח עבור רתימת secretome של MSCs הדרוך כמו מייקרו-רקמות כדוריות בתנאי XF. בעקבות התרחבות כמו תרבויות monolayer (1), MSCs מושעה תלוי טיפות ממכסה של צלחת תרבות (2) בריכוז תא גבוה כדי להפעיל / ממשלת התאים. לאחר 72 שעות, הן (3) בינוני מותנה (CM) ו- (4) spheroids שלמים ניתן לקצור מן הטיפות מנוצל יישומים במורד הזרם שונים. הסנטימטר עשיר בגורמי חיסון ויסות, כמו גם compon הטיפולית אחרתמציג. הספרואידים הקומפקטי כי טופס טיפות תלויות ניתן להעביר בקלות בעזרת פיפטה (5) ו מנוהלת ביעילות in vivo באמצעות צנתר (6). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: מאפייני צמיחה של MSCs מח העצם נגזר בתרבויות בשכבה. MSCs בקטע 2 היו זורע בצפיפות נמוכה (100 תאים לסנטימטר ²⁾ במנות 15 סנטימטר (15,000 תאים לכל צלחת) ו בתרבית למשך 7 ימי CCM. בינוני שונתה ביום 3 ולאחר מכן שוב ביום 5 או 6 (24-48 שעות לפני הקציר). Micrographs שלב בניגוד נציג של MSCs 3 ימים (א) ו 7 ימים (ב) לאחר ציפוי התאים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (C) קינטיקה צמיחה של MSCsהמתקבל 3 תורמים נקבעו על ידי ספירת מספר התאים חסידים קיימא מדי יום בין יום 2 עד עצם היום 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: הכנה תלויה תרבויות ירידה תחול spheroids MSC במדיום XF. (א) תצלום המתאר את טכניקת השכבה במהירות תלויה טיפות על החלק התחתון של מכסת צלחת בתרבית רקמה. (ב) תמונות ממחישות תלוי טיפות לאחר היפוך ומיצוב את המכסה על בסיס הצלחת. (ג) שינויים תלויי זמן כלול הצבירה של 25,000 MSCs בטיפה תלויה כמו דמיין ידי מיקרוסקופ שלב ניגודיות. המטרה הייתה ממוקדת על השיא של הירידה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (ד) ImaGES תחומים MSC נוצר לאחר 3 ימים לתלות תרבויות ירידה באמצעות ניסוחים התקשורת השונים לרבות αMEM עם ובלי FBS (כלומר CCM), XFM-1 עם ובלי HSA, ו XFM-2 עם ובלי HSA. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. נתונים ברי לוח התקבלו מהמאמר המקורי עם רשות מהמפרסם ^14. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: הערכת הפעלת MSC ב 3-D תרבויות XF. (א) Spheres / CM נקצר לאחר 72 שעות על ידי היפוך / הטיית מכסת הצלחת ומאלצי הטיפין עד לקצה באמצעות מרים תא. Spheres התאסף מ -25,000 תאים ניתן מדמיין בקלות במהלך איסוף. (ב) תצלום של approximately 500 תחומים שנאספו מכסים של צלחות תרבות רבות רקמות. Spheres במהירות יורדים לתחתית הצינור ללא צנטריפוגה. (ג) רמה של PGE2 מופרש מתחומי MSC לאחר 72 שעות נמדדו על ידי ELISA. בזמן אמת RT-PCR שימש למדידת רמות TSG6. שניהם TSG6 ו PGE2 הם סמנים ערך לסינון ההפעלה MSC ב spheroids. מדיום XF XFM-1 + HSA הראה רמה גבוהה של PGE2 וייצור TSG6 (תיבות אדומות). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD ו נותחו על ידי מבחן t (*** p <0.001, לעומת מדגם αMEM). (ד) PGE2 ELISA בזמן אמת מבחני RT-PCR על התחומים המיוצרים CCM ו XFM-1 בתוספת במיוחד עם 13 מ"ג / HSA רקומביננטי מיליליטר (rHSA), או כיתה קלינית HSA (cHSA) שהוכנה דם ורידי אדם. שינויים מקפלים נקבעו מ MSCs monolayer חסיד (RQ = 1). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD ו נותחו על ידי מבחן t (** p <0.01, *** p <0.001, לעומתבשכבה MSCs). חלק מנתוני לוחות C ו- D התקבלו מהמאמר המקורי עם רשות מהמפרסם ^14. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: מבחנים פונקציונליים במבחנה להערכת התכונות אנטי דלקתיות ואנטי-סרטנית של MSC-CM שנאספו תלויים תרבויות ירידה. (א) תוצאות נציגת ELISAs מראה את ההשפעות של כדור CM (CCM ו XFM-1 / HSA) על הייצור של TNFα ו- IL-10 על ידי מקרופאגים העכבר מגורה LPS (MQ). (ב) תוצאות נציגת ELISA מראה את ההשפעות של כדור CM (CCM ו XFM-1 / HSA) על הייצור של IFNγ ידי splenocytes העכבר (SPL) מגורה עם נוגדן אנטי CD3. (C) micrographs בניגוד שלב של תאי סרטן הערמונית LNCaP שטופלו CCM בסיסי XFM-1 / HSA או בינוני מותנה (CM) מתחומים MSC ערוכים CCM ו XFM-1 / HSA. תאי LNCaP היו בתרבית בינוני RPMI (שליטה). בר סולם הוא 200 מיקרומטר. (ד) שינויים הכמותיים הצמיחה של תאי סרטן ערמונית LNCaP נקבעו עם / ערכה מגיב כימותים מבוססי תאי DNA זמין מסחרי. קו מקווקו מציין צפיפות זריעה של 5,000 תאים לכל טוב. נתונים בכל הלוחות מוצגים כממוצע ± SD, ו נותחו על ידי מבחן t (*** p <0.001). נתונים מסוימים בכל הלוחות התקבלו מאמרים המקוריים עם רשות מהמפרסם ^14. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עומס / 55,126 / 55126fig6.jpg "/>
איור 6: העברה יעילה של spheroids MSCs השלם, מוכן בתנאי XF, באמצעות מערכת 20G iv המחט / קטטר. (א) תצלום נציג של צינור חרוטי 15 מ"ל עם XFM-1 / תחומי HSA MSC מוכן להזרקה HBSS המכיל 0.2% HSA. (ב) תצלום נציג של הספירות MSC לאחר השאיפה אל קצה פיפטה 200 μl. (C) תמונה של 20 מחט G / קטטר ההרכבה המשמשת לניהול spheroids MSC השלם לעכברים. תמונה (D) הוכחת מיצוב נכון של קצה פיפטה למתאם של הקטטר פוליאוריטן. תמונה (E) של הספירות MSC מיד לאחר שעוברים אותם דרך קטטר לתוך צלחת תרבות. כ 95 כדורים מתוך 100 הועברו. יעילות (F) של משלוח כדור לתוך חלל הצפק של עכברים נקבע על ידי איסוף / תחומי lysing לשמור את השןפיפטה / קטטר ומספרי טלפונים מדידים באמצעות assay כימות תא מסחרי מבוסס DNA, ביחס למספר תאי מתקבלים שלם מלאה של תחומי lysed. קו אדום מקווקו מציין יעילות העברת 90%. משלוח כדור עלוב (71%) נצפה עם זריקה אחת (חץ). (G) micrographs-בניגוד שלב של תחומי E לוח (בהגדלת נוף). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (H) מיקרוסקופ-בניגוד שלב של hr 16 בתחום XFM-1 / HSA לאחר העברת לצלחת בתרבית רקמה. Fibroblastic, מורפולוגיה בצורת כישור של MSCs נשמר בתאים היגרו אל מחוץ לתחום. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (I) מבחני ELISA עבור גורמים אנטי דלקתיות TSG6 ו PGE2 בוצעו על CM שנאספו 6 שעות לאחר העברת הספירות לתוך 6 צלחות היטב המכיל 2 מ"ל αMEM / 2% FBS. Spheres ערוך מדיום XF XFM-1 / HSA הראה הרמה הגבוהה ביותר של TSG6 והפרשת PGE2 (תיבות אדומות). נתונים, כפי שבאו לידי ביטוי ממוצעSD ±, נותחו על ידי מבחן t (*** p <0.001, לעומת מדגם αMEM). נתונים מסוימים התקבלו מהמאמר המקורי עם רשות מהמפרסם ^14. (J) גרפים נציג הממחישות את היכולת של spheroids, מוזרק לתוך חלל הצפק, להגדיל PGE2 הצפק ו- IL-10 תוך הפחתת רמת TNFα בעכברים לערער על ידי הזרקה תוך ורידית של רעלן פנימי (LPS). דוגמאות התקבלו על ידי הצפק שטיפה 6 שעות לאחר אינדוקציה של דלקת ואספקה ​​של 80 spheroids. נתונים, כפי שבאה לידי ביטוי ממוצע ± סטיית תקן, נותחו על ידי מבחן t (* p <0.05, ** p <0.01, לעומת קבוצת ביקורת). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

MSC האופטימלי לשימוש בכמה יישומי מחקר קליניים צריך להיות מופעל ביותר על מנת למקסם את התועלת שלהם, והכין מועדף בתנאי XF הגדרה כימית כדי למזער את המסירה של אנטיגנים פוטנציאל מרכיבים בינוניים xenogeneic כגון FBS. בפרוטוקולים המתוארים כאן, הראינו שיטות 1) להפעיל MSCs בתרבות 3D ידי היווצרות spheroids, 2) להשיג את הפעלת 3D של MSCs בתנאי XF, 3) להעריך את רמות ההפעלה של אליפטית MSCs לגבי אנטי שלהם דלקתית,-modulatory חיסונית, וכן פוטנציאל אנטי-סרטני, ו -4) לספק MSCs להפעילם מספר בלתי מוגבל spheroids השלם לעכברים.

MSCs הם תאי גזע מולטיפוטנטיים כי ניתן לבודד באמצעות דבקות פלסטיק מרקמות רבות מבוגרים כולל מח עצם ורקמת השומן. MSCs מופצת בקלות על פלסטיק בתרבית רקמה תחת גבוה יחסית (10-20%) בריכוזי FBS, להביע קבוצה נפרדת של סמני פני שטח,ניתן להבדיל לפחות לתוך adipogenic, osteogenic, שושלות chondrogenic ^{1, 16, 17, 18.} MSCs הודגם להפעיל השפעות מועילות במודלים של בעלי חיים שונים של מחלות אנושיות, למרות שהם מופיעים להתמיד רק זמניים לאחר המתן שלהם in vivo. השפעת MSCs ולכן זכה לכינוי "פגע וברח" והיא מתווכת לעתים קרובות על ידי גורמים paracrine אנטי דלקתי המערכת החיסונית, כגון PGE2, TSG-6, ו indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), המופרש על ידי MSCs ^{2 3,, 11, 19, 20, 21.} עם זאת, על מנת לייצר גורמים אלה, MSCs מחייב הפעלה, בין אם באמצעות איתותי רקמות פגועות או ג חיסוניאמות של הנמען. בהמשך לכך, חלה התעניינות המתעוררת לפתח MSC פרוטוקולים קדם-הפעלה או הטרמה לפני הלידה של התאים לתוך חיים או חולים ^22. כמו כן, נוכחותם של רכיבי FBS אנטיגני בהכנות MSC תקן מעלה חששות. לכן, מחקרים נערכו על מנת לקבוע תנאי XF אופטימליים הגדרה כימית עבור תרבויות MSC. בשנים האחרונה העבודה שלנו, הראינו הראשון MSCs ניתן להפעיל 3D ידי היווצרות spheroids, ולאחר מכן גילינו כי הפעלת תא יכולה גם להיות מושגת בתנאי XF ספציפי ^{8, 12, 13, 14.}

טכניקות תרבית תאי 3D להיות מועסקות במשך עשרות שנים במטרה לספק תנאים פיסיולוגיים אמיתיים במחקר מבוסס תאים. תרבויות ב 2D להתעלם אופי 3D של רקמות ולכן לא תמיד לשחזרתא אל תא תא אל מטריצת אינטראקציות חשובות איתות תא. טכניקות תרבות 3D רבות משתמשות כלי מסתובב, צלוחיות טווות, או משטחים שאינם חסידים שונים, עם זאת, החסרון הגדול ביותר ברבות מהשיטות הללו הוא ההטרוגניות של גודל אליפטית שנוצר ו / או הדרישה של ציוד יקר ספציפי. המחקר אף בוצעו באמצעות תרביות Drop Hanging כי בעצם לעודד MSCs כדי ספונטני המצרפי לתוך אחד אליפטית ^{4, 5, 6, 7, 8, 9, 23.} יש לציין, תרבויות ירידה תלויות לתמוך הרכבה של אגרגטים-רקמות מייקרו / האחידים יחסית, עם הערך המוסף של להיות מסוגל לתפעל גודל בקלות של מצרף התא על ידי התאמת ריכוז תא ו / או נפח טיפה. יתר על כן, שליטה של ​​ד התלייהROP טכניקת התרבות אינה דורשת הכשרה מקיפה. טיפות של 25-40 μl ניתן להכין בקלות עם MSCs בריכוזי תא גבוה, בדרך כלל 500-1,000 תאים לכל μl. טיפות קטנות מ -20 μl נוטים להתאדות במהירות, אלה גדולים יותר 45 μl לעתים קרובות למרוח על פני המכסה בזמן ההיפוך. עם זאת, כאשר מרפרף מכסה המכיל טיפות בכל גודל, מהירויות כיווניות הם פרמטרים קריטיים לשקול לשמירת מתח פנים וצורה מתאימה של הירידה / אליפטית. התרבות ללא הפרעות וזרימת אוויר נאות בחממה חשובה גם להבטחה במצטבר MSCs לתוך כדור בודד בתוך כל טיפה.

חסרון של שיטה זו הוא כי צלחות המכילות טיפות תלויות לא צריכות להיערם בחממה או עברו במהלך הרכבה בתחום, מה שהופך מדרוג כלפי מעלה עבור טיפולים מטופלים קשים. יתר על כן, השינוי בינוני תלוי תרבויות ירידה הוא מאוד מאתגר, ובכך תרבויות לטווח ארוכות צריכות להיות avoided. בנוסף, יחס תקשורת אל תא הנמוך בטיפות תלויות יכול לגרום דלדול מזין והצטברות פסולת בסופו של דבר שמוביל לאובדן תפקודים תאיים חשובים ו / או מוות של תאים.

עם זאת, עם טכניקת Drop Hanging נכונה, אנחנו הוכחנו כי MSCs ב spheroids להיות מאוד פעיל או דרוך, ב שתאי להפוך מפעלים של המולקולות אנטי הדלקתיות החזקות PGE2 ו TSG6, וכן המולקולות אנטי-הסרטניות IL-24 ו שביל. הראינו כי spheroids MSC אכן אנטי דלק מערכת חיסונית, ויש להם מאפיינים אנטי סרטניים מעולים לעמיתיהם בשכבת 2D שלהם מבחנים תפקודיים רבים באמצעות מקרופאגים תרבותיים, splenocytes, ותאי סרטן הערמונית ^{8, 12, 13, 14.} יתר על כן, הראינו כי spheroids MSC יכול להשפיע באורח אנטי דלקתי כאשר מנוהללתוך חלל הצפק של עכברים עם דלקת הצפק ^8. באופן ספציפי, הראינו כי spheroids הגדול של כ 400-500 מיקרומטר קוטר (25,000-30,000 MSCs כל אחד) יכול להיות מועבר ביעילות בנפח קטן של HBSS באמצעות הרכבת 20G מחט / קטטר פיפטה סטנדרטית. בעזרת טכניקה זו, מיקום קטטר פסול, שתוצאתה עמידות הגבוהה בפני זרימת נוזל, ניתן לקבוע בקלות לפני אליפטית העברה על ידי ההזרקה הראשונה נפח קטן של HBSS / HSA כמתואר הפרוטוקולים. הספרואידים ב קטטר וממוקם כראוי יזרמו בחופשיות, ובלבד HBSS הוא השלים עם HSA כדי למזער הידבקות לכדור צינורות הפלסטיק, ניתן דמיינו בקלות. יתר על כן, טכניקה זו מונעת לחץ גזירה על תאים אשר יכול להתרחש באמצעות מחט / מזרק סטנדרטי להזרקה, ונמנעה את צורך חתך כירורגים אשר טומן בחובו סיכון גבוה של זיהום הוא יותר מאתגר מבחינה טכנית. החיסרון העיקרי הוא אחת tספר כובע גדולים של spheroids ניתן להזריק רק לתוך חללים בגוף מרווחים, כגון חלל הצפק, כאשר תנועת ההתנגדות נגד העברת כדור דרך הקטטר היא גבוהה באזורים מכווצים.

כמו כן, אנו הוכחנו לאחרונה כי באותה הרמה של הפעלת MSC ב spheroids יכולה להיות מושגות באמצעות מדיום XF ספציפי זמין מסחרי, המכונה כאן XFM-1, כל עוד זה היה בתוספת HSA המתקבל דם אדם או שהוכנה באמצעות טכניקות רקומביננטי ^14. חשוב לציין כאן כי spheroids MSC אינו מייצר רמות גבוהות של PGE2 ו TSG6 בכל סוגי המדיה XF ^14, כנראה בגלל תקשורת XF ביותר עבור MSCs בתחילה גובשו להרחבה אופטימלית של תאי 2D. כמו כן, חשוב לציין כי סוגים שונים של HSA להשתנות בחוזק שלהם ^14. בנוסף, ברמה המובהקת של PGE2 זוהתה CM של spheroids הרשום יכולה להשתנות קלly כמו ELISA מועסק PGE2 אכן assay התחרות. לכן, חשוב לכלול בקרות נאותות בכל PGE2 ELISA וכדי למנוע השוואת נתונים ישירות בין דגימות assayed בזמנים שונים או בלוחות שונים. יתר על כן, MSCs יש לרחוץ ביסודיות במדיום XF לפני ההכנה תלויה טיפות כדי להסיר CCM שיורית, ולכן, שריד גבול של רכיבי FBS. הפרוטוקולים המתוארים כאן ניתן לאמץ בקלות להעריך ניסוחי מדיה אחרים על היווצרות כדור וביטוי גן טיפולי.

ברור, אירועים התא איתות רבים אינם מתרחשים בדרך כלל 2D MSCs נקבעים בתנועה כאשר MSCs בתרבית 3D. תא אל תא ותא-אל-מטריקס אינטראקציות, בתיווכו של היווצרות אליפטית מדריך cadherins ו integrins דחיסה ^{24, 25, 26} ו הם קריטיים סביר לטיפול אליפטית. כאשר התאים המצרפי ושיתוףmpact לתוך spheroids, אותות מתח שונים, כוללים אפופטוזיס קטין, וסיוע בתהליך של הפעלת MSC שתוצאתו ייצור של גורמים טיפוליים רבים בפוטנציה ^{4, 5.} אנחנו הראינו בעבר את התפקיד הקריטי של איתות autocrine IL-1 ב MSC הפעלה וייצור של PGE2 ו TSG6 ^12. בעוד הרבה נותר עלום על מסלולי איתות השונים המסייעות הפעלת MSC, פלטפורמת תרבות Drop Hanging מקנה דרך מעשי לחקור את התופעה הזאת ולשפר טיפולים מבוססים MSC. בסך הכל, שתארנו, בפרוטוקולים כאן, אמצעי הפעלה או תחולו MSCs בתרבויות 3D, בתנאי XF-הגדרה כימית, לייצר אנטי-דלקתית, מערכת חיסונית, וגורם אנטי-סרטני. גם תארנו כיצד spheroids MSC השלם אלה יכול להיות מועבר in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling