Производство и введения терапевтических мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (MSC) Spheroids грунтованный в 3-D культур Под Зенона свободных условиях

Abstract

Мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК), весьма перспективны в биоинженерии и регенеративной медицины. MSCs может быть выделен из нескольких взрослых тканей с помощью их сильной присоединения к тканевой культуры , пластика , а затем дополнительно расширен в лабораторных условиях , наиболее часто с использованием фетальной бычьей сыворотки (FBS). Поскольку ФБС может вызвать MSCs стать иммуногенными, его присутствие в MSC культур ограничивает как клинические и экспериментальные применения клеток. Таким образом, исследования с использованием определенного химического Зенона бесплатно (XF) среды для MSC культур являются чрезвычайно ценными. Многие полезные эффекты ПКЦ, были отнесены к их способности регулировать воспаление и иммунитет, главным образом, за счет секреции иммуномодулирующих факторов, таких как фактор некроза опухоли-стимулированной гена 6 (TSG6) и простагландин Е2 (ПГЕ2). Тем не менее, MSCs требует активации, чтобы произвести эти факторы и так как действие MSCs часто преходящи, большой интерес возник, чтобы обнаружить способы предварительной активации клеток PrioR для их использования, таким образом , исключая время задержки для активации в естественных условиях. Здесь мы представляем протоколы для эффективного включения или простых MSCs в трехмерных (3D) культур при химически определенных условиях и XF управлять этими предварительно активированная MSCs в естественных условиях. В частности, мы сначала опишем методы для создания сферической MSC микро-ткани или «сфероидов» в висячей капли с использованием среды и XF демонстрируют, как сферы и кондиционированной среды (CM) могут быть собраны для различных областей применения. Во- вторых, мы опишем экраны экспрессии генов и в пробирке функциональные тесты для быстрой оценки уровня активации MSC в сфероидов, подчеркивая противовоспалительное и противораковое потенциал клеток. В- третьих, мы опишем метод романа впрыснуть неповрежденные MSC сфероидов в брюшную полость мыши для естественных условиях тестирования эффективности в. В целом, протоколы в данном документе преодолеть основные проблемы получения предварительно активированного MSCs под химически определенной XF Conвиям и обеспечивают гибкую систему для администрирования MSC сфероиды для лечения.

Introduction

Мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК), показали большой потенциал для различных регенеративных подходов медицины. МСК были первоначально выделены в виде стромального компонента костного мозга , но с тех пор были получены от многих других тканях взрослого организма, в том числе жировой ткани ^{1, 2, 3.} Интересно отметить, что основной способ изоляции включает замечательное свойство ПКЦ, чтобы плотно прилипать на тканевой культуры, пластика в присутствии эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Хотя этот традиционный метод выделения позволяет легко и быстрое расширение MSCs в двумерной (2D) культуры, это также очень искусственным и не принимает во внимание значение нативной трехмерной (3D) окружающей среды , ведущие к потенциальной потере важных клеточных характеристик ^{4, 5 , 6.} Таким образом, изучение MSCs в 3D культур, которыйявляются более физиологичным, чем традиционные 2D культур, возникла в поисках «потерянных / заниженных" MSC характеристик. Кроме того, большой интерес поднялся, чтобы идентифицировать Xeno свободных (XF) химически определенные условия для MSC культуры и активации, и таким образом сделать клетки более податливыми для клинического применения.

Многие исследования были опубликованы демонстрации 3D культуры ПКЦ как в биоматериалов и в виде сферических агрегатов или сфероидов. MSCs в биоматериалов первоначально были разработаны для тканевой инженерии подходы для замены поврежденных тканей с сотовыми посеяны каркасах, в то время как сфероида культуры MSCs рассматривались как способ понять поведение MSC в естественных условиях после введения клеток для терапии в доклинических или клинических испытаний ^{4, 5, 7.} Интересно, что MSCs форма сфероидов спонтанно, когда присоединение к культуре ткани пластика не допускается^{8, 9, 10.} Традиционно агрегация клеток облегчается с помощью методов колбах центрифужных или жидких методов наложения, методы, используемые первоначально в биологии рака в усилиях, чтобы попытаться имитировать микроокружение опухоли. В последнее время , дополнительные методы всплыли , которые демонстрируют агрегацию клеток в культуральные чашки , предварительно покрытые конкретными химическими веществами , чтобы предотвратить клетки к пластический адгезии ^{4, 5, 6.} Один из самых простых и экономичных методов для генерации MSC сфероидов к культуре их в висячей капли, метод, который часто используется для получения эмбриональных телец из эмбриональных стволовых клеток. С свисающими технику культуры, прилипание клеток к культуре ткани пластика предотвращается путем суспендирования клеток в капле среды на нижней стороне ткани культуры блюдо крышкой и позволяя тяжести, чтобы облегчить клеточную AGGREGвания в вершине капли. Размер сфероид можно легко манипулировать с помощью изменения концентрации клеток или объема капли, что делает свисающими культур особенно легко контролировать.

В ранних исследованиях на 3D культуры ПКЦ продемонстрировали радикальные различия в характеристиках клеток в 3D по сравнению с их аналогами 2D ^{6, 8, 9.} В то же время, отчеты показали , что благотворное воздействие MSCs в естественных условиях полагались на их способности активируются с помощью микро-сигналы окружающей среды и, в ответ, чтобы произвести противовоспалительное и иммуномодулирующее факторы ^11. Интересно отметить, что многие из этих факторов, таких как простагландин Е2 (PGE2), фактор некроза опухоли-стимулированной гена 6 (TSG6) и фактор роста гепатоцитов (HGF) были произведены в гораздо больших количествах MSC сфероидов, чем традиционные 2D MSCs прокладывают путь для Идеяс использованием 3D культур , чтобы активировать клетки ^{8, 12, 13.} Кроме того, активация генов в 3D культурах появились перепросматривать механизмы, по крайней мере частично, активации клеток после инъекции в мышей ^12. При активации MSCs до их использования в экспериментах эффекты клеток может быть продлен и более заметным , как традиционный MSC эффект в естественных условиях часто задерживается и переходных процессов , и может быть описана как "хит и запустить". В течение последних нескольких лет, важные функциональные исследования с использованием MSC сфероиды, показали , что они могут подавлять воспалительные реакции и модулирования иммунитета в естественных условиях, оказывая влияние на эффекторные клетки , такие как макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы и Т - клеток , что делает сфероидов привлекательной формой загрунтованных ПКЦ ; ^{2 , 3.} Кроме того, производство молекул противораковых, таких как Interleukin-24 (ИЛ-24) и фактор некроза опухолей , связанных с апоптозиндуцирующая лиганд (TRAIL), увеличены в 3D культурах ПКЦ по отношению к монослойный MSCs, явление , которое может быть использовано для целенаправленной терапии рака ^{8, 10, 14.}

В соответствии с требованием не только использование тканевой культуры пластика, но и FBS традиционная культура MSC, еще одно препятствие, чтобы сделать MSC сфероиды более пригодным для клинического применения было необходимо преодолеть. Для решения этого препятствия, мы недавно показали образование MSC сфероидов при определенных химически определенных условиях и XF установлено , что в результате MSC сфероиды были активированы для получения тех же молекул противовоспалительными и противораковыми как сфероидов , генерируемых в условиях с FBS ^14. Здесь эти результаты представлены в нескольких детальных протоколов, которые демонстрируют генерацию предварительно активированных MSCs в 3D культур с использованием XFСМИ. Кроме того, протоколы представлены, которые описывают эффективные способы оценки уровней активация MSCs в отношении их противовоспалительными, иммуномодулирующими и противораковым действием, вместе с практическим способом доставить неповрежденные сфероидов в мышей.

Protocol

1. MSC Выделение и расширения

1. Получение ранних прохождение MSCs из Центра для подготовки и распространения взрослых стволовых клеток ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~HEAD=pobj~~number=plural ) ¹⁵ , как замороженные флаконы. В качестве альтернативы, изолировать MSCs из аспирата костного мозга после рутинной ¹⁴ -й протокол и хранить в виде замороженных ампул.
2. Подготовка полной культуральной среде (МКД), который является минимальным необходимым среда альфа (αMEM) с добавлением 15-20% премией выбрать FBS, 2 мМ L-глутамина, и 1x пенициллина-стрептомицина. Стерилизация среды путем фильтрации.
3. Поместите 30 мл ССМ в 150 мм для культивирования клеток чашку для и инкубировать блюдо в течение 30 мин при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO _2.
4. Выдержите замороженный флакон , содержащий приблизительно 10 ⁶ MSCs в течение 2 мин в C водяной бане при 37 °.
5. Перенести содержимое флакона в чашку для культивирования с использованием 5 мл серологической пипеткой и сполоснуть флакон несколько раз с 1-2 мл ССМ от тарелки, чтобы захватить остаточные клетки. Поместите блюдо на ночь в соответствующем инкубаторе.
6. Тщательно промывать культуру дважды при комнатной температуре фосфатном буферном солевом растворе (PBS) и отсоединить MSCs 3 мл подогретого / этилендиаминтетрауксусной кислоты раствор 0,25% трипсина (ЭДТА). Отрыв обычно занимает приблизительно 3-4 мин в инкубаторе.
7. Нейтрализовать трипсина в чашке с 6 мл CCM предварительно нагревают до 37 ° С и передачи клеточной суспензии в 50 мл коническую трубку. Совместимый с промывками PBS для максимального выхода клеток.
8. Центрифуга клетки (450 XG) в течение 10 мин при комнатной температуре и аспирата супернатант.
9. Повторное приостановить клетки в малом объеме СКК и подсчета жизнеспособных клеток с использованием гемоцитометра и трипановым синим.
10. Seed соответствующее количество 150 - мм чашек при 100 клеток / см ²
11. Сбора клеток, как описано выше с трипсин / ЭДТА и объединить все клетки в одну коническую трубку с соответствующей средой. Центрифуга снова и повторно приостанавливать клетки в малом объеме той же среды для кровяных клеток. Используйте стандартный CCM (содержащий FBS) или различные имеющиеся в продаже XF медиа-композиций, здесь называют XF средней-1 (XFM-1) и XF средней-2 (XFM-2), так и без человеческого сывороточного альбумина (ЧСА, 13 мг / мл) добавки.

2. Получение активированного MSC сфероидов в 3-D висячие культур для Drop под XF Условия

1. Для создания сфероиды приблизительно 25000 клеток, разбавить заготовленные MSCs в текущем СКК, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 мг / мл), XFM-2, или XFM-2 + HSA (13 мг / мл) в 714 клетках / мкл.
2. Пипетка 35 мкл / капли клеток наизнанка перевернутой культуры блюдо крышкой 150 мм. Несколько капель можно легко пипеткой с помощью многоканальной пипетки.
   Примечание: Если большие или меньшие сфероидов желательно, изменять концентрацию клеток или объема капли (25-45 мкл) соответствующим образом.
3. Перенесите 20 мл воды комнатной температуры PBS в основание тарелки и в одном непрерывном и устойчивом движении перевернуть крышку, содержащую капли, так что Вершины падение лицом вниз. Поместите крышку осторожно на основании чашки для культивирования.
4. Передача блюдо в инкубаторе в течение 3-х дней, не нарушая его, чтобы обеспечить соответствующую сборку сферы.
5. Через 72 ч, начинают урожай сфероид осторожно удалить крышку и переворачивая ее так, чтобы капли, еще раз, лицом вверх.
6. Угол крышка примерно 10-20 ° и раздвинуть капли, содержащие сфероидов, к краю пластины с помощью мобильного подъемника.
7. Перенесите сферы и среды в коническую пробирку на 15 мл с 1000 мкл трубыTTE. Использование комнатной температуры PBS и пипетку с тем же наконечником, чтобы вымыть плиту и обеспечить максимальное восстановление сфероидов.
8. Для ПЦР в реальном времени анализов (протокол 3), центрифугировать сферы суспензии при 450 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирата супернатант. Вымойте сфероиды с PBS и повторить как центрифугирование и аспирационных шаги. Для доставки в животных (протокол 8), позволяют сферы осесть в нижней части трубки (~ 3-4 мин) без центрифугирования.

3. ПЦР в реальном времени противовоспалительных и противораковых маркеров

1. С помощью набора для экстракции РНК с гомогенизаторов колоннами и РНКазы ДНКазы Набор для выделения ДНК-свободной тотальной РНК из однослойных ПКЦ (Протокол 1) и MSC сфероиды (Протокол 2), которые были промыты с PBS и подвергали центрифугированию.
2. Лизируйте по крайней мере, 100000 монослой МСК и 20 сфероидов из каждого условия в отдельных 15 мл конические пробирки с RLT буфером, содержащим бета-меркаптоэтанола (1: 100).
3. Трансфер тщательно перемешанную смесь лизатов в 1,5 мл РНКазы пробирки и помещают в морозильную камеру (-80 ° C) в течение по меньшей мере 3 ч, чтобы помочь в сфероида лизиса.
4. Оттепель клеточных лизатов на льду, вихрем кратко, и следовать инструкциям производителя для выделения РНК с использованием коммерчески доступного набора для выделения общей РНК млекопитающих.
5. Количественно и оценить качество выделенной РНК с использованием спектрофотометра.
6. Использование большой емкости кДНК с обратной транскрипцией Kit или эквивалент в соответствии с инструкциями изготовителя, чтобы генерировать кДНК для ПЦР в реальном времени.
7. Поместите образцы кДНК, коммерчески разработанный ПЦР в реальном времени праймеров / зондов (экспрессии генов АНАЛИЗЫ) и PCR Master Mix на льду. С помощью праймеров / зондов для GAPDH (контроль), PTGS2 (ЦОГ-2, оказывает противовоспалительное), TNFAIP6 (TSG6, противовоспалительное), TRAIL (противораковый), и IL-24 (анти-рак).
8. Подготовка ПЦР в реальном времени реакции в соответствии с инструкциями изготовителя для экспрессии генов Assays и Fast Universal Master Mix.
9. Следуйте инструкциям для ПЦР в реальном времени инструмент для генерирования эксперимента документов и выполнение прогона.
10. Анализ данных с помощью метода ΔΔC _T путем расчета относительных изменений (относительное количество, RQ) в экспрессии генов с использованием GAPDH в качестве эндогенного контроля и однослойных MSCs в качестве базовой линии ^{8, 14.}

4. Сбор КМ для анализами иммуномодулирующее и противораковых потенциал

1. Заготавливают сфероидов и СМ, ​​как описано выше, в 15 мл коническую трубку, используя подъемное приспособление клеток и пипетку, однако, не мыть тарелки с крышками PBS, как это будет разбавлять CM.
2. Центрифуга при 450 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, необходимо тщательно собрать бесклеточной надосадочной жидкости с помощью пипетки, и переносят надосадочную жидкость в 1,5 мл пробирки.
3. Центрифуга при 10000 х г в течение 5-10 мин при комнатной температуре, осторожно собирают ХЛarified СМ с пипеткой, и передавать КМ в новые 1,5 мл пробирки для хранения в морозильной камере (-80 ° С). Готовят аликвот СМ перед замораживанием при использовании его для нескольких анализов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением анализов вниз по течению, концентрация ПГЕ2, хороший показатель противовоспалительного потенциала КМ, может быть определена с использованием коммерческого набора для ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрация TSG6 может быть определена с использованием опубликованного протокола ^14.

5. Анализ Макрофаг для оценки противовоспалительного потенциала МСЦ-CM

1. Готовят макрофага среду, которая состоит из модифицированной среде Дульбекко Eagle (DMEM), содержащей L-аланил-L-глутамина и дополненной 10% FBS премии выбрать и 1x пенициллин-стрептомицина. Фильтр-стерилизовать среду.
2. Получение замороженного флакона приблизительно 10 ⁶ J774 макрофагами мыши и инкубировать пробирку в течение 2 мин в C водяной бане при 37 °.
3. Аспирируйте супернатант, приостановить макрофаги в 1 мл макрофагального среды, а также передавать макрофаги в 150 мм чашку Петри, содержащую 30 мл макрофагального среды.
4. Изменение среды каждые 2 дня и не инкубировать клетки в инкубаторе до примерно 70-80% сплошности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: макрофаги действительно плотно не прилипает к чашке Петри, таким образом, следует позаботиться о том, чтобы не потерять клеток со средним изменением.
5. Урожай макрофаги путем распыления макрофага среды на клетки с пипеткой. Перенести клетки в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируют в течение 5 мин при температуре 200-300 XG и комнатной температуре.
6. Аспирируйте супернатант и суспендирования клеток в небольшом объеме макрофагальной среды для подсчета клеток с помощью гемоцитометра. Отрегулируйте концентрацию до 200000 клеток / мл с макрофагальной мнеDIUM.
7. Для запуска настройки для анализа макрофагами, добавьте 480 мкл среды макрофагами в лунки 12-луночного планшета.
8. Добавьте 20 мкл среды в макрофаг нестимулированных контрольных лунок и 20 мкл некондиционного или ЦКМ-кондиционированной среды, полученный выше, в экспериментальных скважинах. Смешайте среду в лунки, нажав на пластину.
9. Передача 500 мкл суспензии клеток макрофагов к нестимулированных контрольных макрофаг скважин.
10. Стимулируют оставшиеся макрофаги с добавлением 1: 500-1: 1000 из расчета 0,1 мг / мл липополисахарида (LPS) и инкубировать 5-10 мин при комнатной температуре.
11. Передача 500 мкл стимулированных макрофагов в лунки с некондиционированной или MSC-кондиционированной среды. Смешайте скважин постепенно раскачивать пластину несколько раз.
12. Перенести пластину в инкубаторе в течение 16-18 часов.
13. Урожай макрофагами-кондиционированной среды и центрифуге при 500 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
14. Переводсупернатант в новые пробирки и анализа для фактора некроза опухоли-альфа (TNF-alpha) и интерлейкина-10 (IL-10) контента с помощью коммерческих наборов ELISA следующим инструкциям изготовителя.

6. Анализ спленоцитов для оценки иммуномодулирующих Потенциал сфероида-CM

1. Подготовьте полный спленоцитов среду, состоящую из Института Rosewell Park Memorial (RPMI) -1640 среде, дополненной 10% инактивированной нагреванием FBS, 1x пенициллина-стрептомицина и 2-меркаптоэтанола. Фильтр-стерилизовать среду.
2. Урожай Селезенки из умерщвлены-самцов мышей линии BALB / C через разрез , полученного на левой стороне живота над селезенкой, примерно на полпути между передней и задней ноги ^14. Передача селезенку на ячейки фильтра 70 мкм , чтобы изолировать спленоцитов ^14.
3. Изолировать спленоцитов / лимфоциты, нажав селезенке через сетчатый фильтр 70 мкм в стерильную чашку Петри USINг мягкая резина / пластик конец плунжера из 2-3 мл шприца ^14. Используйте шлифовальную круговое движение, чтобы отделить селезенку.
4. Вымойте клеточный фильтр несколько раз холодным PBS и переносят клетки из чашек Петри в 50 мл коническую пробирку. Заполните трубку с холодным PBS и центрифугировать (500 XG) при температуре 4 ° С в течение 10 мин.
5. Аспирируйте супернатант и очистить клетки от эритроцитов путем инкубации с 5-10 мл красного раствора для лизиса клеток крови (в селезенке) в течение 5-10 мин.
6. Остановить лизис путем добавления холодной PBS в пробирку и центрифугируют в течение 5-10 мин при 500g и при температуре 4 ° С.
7. Приостановка Выделенные клетки в полной среде спленоцитов, фильтруют через сетчатый фильтр 40 мкм, и подсчет клеток с помощью гемоцитометра. Добавить спленоцитов среду к клеточной суспензии , чтобы достичь конечной концентрации клеток 10 ⁶ клеток / мл
   Примечание: Этот метод обычно дает приблизительно 3 × 10 ⁷ спленоцитов за селезенки мыши.
Примечание: Количество спленоцитов требуется, зависит от числа экспериментальных условий, определяемых исследователем (этап 6.9). Для каждого экспериментального образца / лунку, 10 ⁶ спленоцитов требуется.
8. Передача 10 ⁶ спленоцитов (стимулируется или не стимулируется) в лунки 12-луночного планшета и добавить некондиционных (контроль) или MSC-CM в лунки при окончательном разведении 1: 10-1: 20.
9. Урожай спленоцитов см после 24 ч и центрифугируют при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
10. Передача супернатант в новые пробирки и анализа для гамма-интерферона (IFN-gamma) содержание коммерческой ELISA набор, следуя инструкциям изготовителя.

7. Рак простаты анализа для оценки потенциала противораковой сфероида-CM

1. Готовят полную ростовую среду RPMI, который среде RPMI-1640, дополненной 10% FBS, 1x пенициллина-стрептомицина.
2. Получение замороженного пузырек LNCaP клеток рака простаты и инкубировать флакон в течение 2 мин в водяной бане при 37 ° C.
3. Перенести содержимое флакона в культуральную чашку, содержащую 30 мл полной среды RPMI роста с использованием моторизованного дозаторов и 5 мл серологической пипеткой. Сполоснуть флакон несколько раз со средой из тарелки и поместить блюдо в инкубатор.
4. Непосредственно перед клетки достигают слитности, мыть культуру дважды при комнатной температуре PBS и отделить LNCaP клеток с 3 мл подогретого 0,25% раствора трипсина / ЭДТА.
5. Нейтрализовать трипсина в чашке с полной средой RPMI роста и переносят клетки вместе с промывками в коническую пробирку на 50 мл.
6. Центрифуга клетки при 450 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и аспирата супернатант.
7. Повторное приостановить клетки в небольшом объеме полной среды роста RPMI и подсчета раковых клеток с помощью гемоцитометра.
8. Для проведения анализа роста клеток с использованием набора для анализа пролиферации клеток, аспирата среды из скважин и передачи пластины в морозильную камеру (-80 ° С) в течение по крайней мере 3 ч.
   1. Разморозить пластины и лизиса клеток в каждую лунку путем добавления 100 мкл клеточного лизиса, содержащего реагент мМ NaCl, 180, 1 мМ ЭДТА и 0,2 мг / мл РНКазы А.
   2. Для получения стандартной кривой, лизируют известные количества клеток LNCaP, как описано выше.
   3. Через 1 ч добавляют 100 мкл 1х буфера для лизиса клеток, содержащего 1: 100 разбавление реагента анализа клеточной пролиферации и измеряют флуоресценцию в каждую лунку, чтобы определить количество клеток.

8. Внутрибрюшинной Поставка Малонарушенных сфероидов

1. Подготовьте сфероидами MSCs, как описано выше (протокол 2) и ресуспендируют тон сфер в стерильном Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) с добавлением 0,2-0,5% HSA для поддержания условий XF. HSA в растворе помогает предотвратить сферы адгезии к пластмассе во время инъекции.
2. Передача 40-120 сфероиды в 15 мл конические пробирки и промыть клетки путем добавления 6 мл HBSS / HSA к трубкам. Дайте 3-4 минуты для сферы спускаться вниз. Подготовьте независимую коническую трубку сфероидов для каждого животного. Кроме того, подготовить дополнительные трубки сфероидов для анализов, определяющих сохранение сфероида (см ниже 8.18) и производство лечебных факторов после передачи (см ниже 8.19) при желании.
3. Аспирируйте супернатант, наложение сфероидов с 100-200 мкл стерильной HBSS с добавкой 0,2-0,5% ЧСА, и помещают пробирки на лед.
4. Кратко обезболить животных с 2% изофлуран в 100% кислорода до исчезновения пинч-носочной рефлекса в течение приблизительно 2 мин в индукционной камере.
5. Поместите животное внутри BSL-2 кабинета, спинной AspeCt вниз (вентральной стороной вверх), с непрерывным потоком 1,5% смеси изофлуран / кислород через носовой конус.
6. Очистите нижнюю часть живота мыши с антисептиком, например, как 70% спирта.
7. Снимите колпачок 20 G внутривенной (IV) катетер и выполнить внутрибрюшинную инъекцию с узлом катетер-шпильках. Используйте одну руку, чтобы держать кожу мыши, а другой для выполнения инъекции. Найдите точку инъекции примерно в середине искусственной линии, соединяющей согнутом коленном суставе и область половых органов с кончик иглы направлен в сторону средней линии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Узел катетер-шпилька имеет более высокое сопротивление, чем обычный иглы, поэтому уход должен быть принят, чтобы не вводить иглу слишком глубоко в брюшной полости, что может привести к травмам внутренних органов. Проникновение кожи, а затем мышцы / брюшину может ощущаться во время установки катетера.
8. Аккуратно удалите металл шпилек / иглу из узла катетер-шпильках. ChecК стилет для крови, мочи и кала и отказаться от него. Кровь на игле указывает пункцию внутреннего органа (ов).
9. Держа пластиковый катетер в вертикальном положении во время инъекции, чтобы обеспечить поток текучей среды.
10. Подтвердите правильное размещение пластикового катетера путем введения приблизительно 100 мкл стерильного HBSS / HSA через катетер с помощью пипетки с наконечником 100-200 мкл. Поместите конец наконечника пипетки внутри переходника катетера шприца, образующей герметичное уплотнение. Медленно впрыскивать жидкость внутрь брюшной полости.
    Примечание: Жидкость в правильном положении катетера циркулирует свободно внутри полости брюшины лишь незначительные корректировки катетера. Неправильное размещение катетера (подкожного или внутри-кишечное, или если кончик иглы ранения перитонеальных органов, таких как почки) будет увеличивать сопротивление и уменьшить поток. Подкожный размещение приведет к формированию очевидного «пузыря» под кожей.
11. Сбор тон MSC сфероиды, подготовленные в 100-200 мкл HBSS / HSA (этап 8.3), используя 200 мкл кончиком пипетки, и передавать весь объем сфер (40-120 сфер) в брюшную полость через катетер, как описано выше.
12. Промыть пробирку, содержащую шары 100 мкл HBSS / HSA, используя тот же наконечник, что и выше, чтобы собирать любые остаточные сфероиды и их вводят в брюшную полость.
13. (Необязательно) Вводить дополнительно 100 мкл HBSS / HSA в брюшную полость промывать катетер.
14. Поместите марлевый тампон, пропитанный антисептическим через катетер и медленно удалить катетер из брюшной полости и отказаться от него.
15. Осторожно массировать брюшную полость с пальцами, чтобы обеспечить равномерное распределение сфероидов.
16. Пусть животное восстанавливаться под пристальным наблюдением и следить за кровотечение из места инъекции.
17. Осмотрите катетер и 15 мл трубку для оставшихся сфероидов. Это нормально наблюдать несколько сфер вкатетер / трубку.
    Примечание: Описанная методика для MSC доставки сфероида могут быть приняты для использования в нормальных животных или в различных моделях травмы. Этот метод был успешно использован для введения сфероиды в клетках мышиной роговицы травмы и модели эндотоксикоза, а также в зимозаном модели перитонита ^8.
18. Для того, чтобы определить число сохраняемых сфероидов (факультативно), использовать ДНК на основе количества клеток количественного набора / реагента. Держите использованный катетер за 15 мл пробирку и энергично обойтись HBSS / HSA через катетер, чтобы заставить оставшихся сфер обратно в 15 мл пробирку.
    1. Центрифуга 15 мл трубки при 500g в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирата супернатант. Передача трубки, содержащей сфероид осадок в морозильную камеру (-80 ° C) в течение по меньшей мере 3 ч.
    2. Разморозить трубу и лизировать сферы путем добавления 500 мкл клеточного лизиса, содержащего реагент мМ NaCl, 180, 1 мМ ЭДТА и 0,2 мг / мл РНКазы А.
    3. Для управления, FreЭз и лизируют известное количество сфероидов (предпочтительно эквивалентно количеству сфероидов, подготовленных для одной инъекции), как описано выше.
    4. Через 1 ч передать 100 мкл клеточного лизата, в двух экземплярах, в 96-луночный микропланшет и добавить в каждую лунку по 100 мкл 1х буфера для лизиса клеток, содержащего разведение 1:50 реагента анализа клеточной пролиферации из комплекта. Через 10 мин измеряют флуоресценцию в каждую лунку, чтобы определить количество сфер, которые не были впрыскивается путем сравнения экспериментального образца (ов) с контрольным образцом.
19. Оценить уровень активации сфероидов подготовленных для инъекций (опционально) путем измерения концентрации ПГЕ2 и TSG6 производимого переданных сфер. Передача 40-120 сферы через катетер, как описано выше, в 12-луночный или 6-луночный планшет, содержащий 1 или 2 мл αMEM, дополненной 2% FBS и 1x пенициллина / стрептомицина. Место пластин в инкубаторе в течение 6 часов.
    1. Перенести среду излунки после 6 ч в 1,5 или 15 мл пробирки и центрифугируют пробирки при 450 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Перенести бесклеточной супернатант в свежую 1,5 мл пробирки с помощью пипетки и центрифуге при 10000 х г в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
    3. Перенести осветленной CM (надосадочную) в новые 1,5 мл пробирки и анализа для концентрации PGE2 (хороший показатель противовоспалительного потенциала см) с использованием коммерческого набора для ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрация TSG6 может быть определена с использованием опубликованного протокола ^14.

Representative Results

В текущей работе, свисающие культуры капли были использованы для создания компактных сферических микро-ткани или «сфероидов» активированных MSCs в условиях XF. Исследуемое дорожную карту на рисунке 1 видно , что MSCs рекомендуется самосборке в сфероидов при суспендировании в висячей капли в течение 72 ч, после чего сфероиды или КМ , нагруженной сферы полученных терапевтических факторов, могут быть собраны и потенциально использованы в обоих научных исследований и клинического применения. Большое количество клеток , необходимых для производственной сферы могут быть приобретены в течение одной недели путем посева MSCs при низкой плотности, как правило , 100-200 клеток на см ^2, а затем расширение клеток в течение 6-7 дней до примерно 80% сплошности (рис 2 ). Кинетика роста клеток, определяется путем подсчета жизнеспособных клеток ежедневно, показали , что надежная фаза расширения (день 3-7) следует краткое лаг - фазу 1-2 дней (рис 2C </ Сильный>). MSCs в проходе 2 или 3, как правило, дают 50-100 млн клеток из одного флакона в 1 миллион криоконсервированных клеток при культивировании в СКК.

После расширения и жатвы MSCs подвешены при высокой концентрации клеток для создания сфероидов, обычно 500-1000 клеток на мкл. Висячие культуры капель получают путем переноса 25-40 мкл капли среды , содержащей MSCs на обратной стороне ткани культуры блюдо крышкой, который затем переворачивается и соответствующим образом расположены на основание тарелки (рисунок 3). Когда суспендировали в 35 мкл капель МНЛЗ 714 клеток на мкл (т.е. 25000 клеток на каплю), MSCs первую сборку в небольших агрегатов , которые в конечном итоге сливаются для создания единой компактной сферы на 72 ч в вершине капли (рис 3C). Spheroids также образуют более 72 ч в нескольких типах коммерчески доступных XF сред, оптимизированных для расширения MSC, Здесь упоминается как XFM-1 и XFM-2. Тем не менее, формирование отдельных компактных сфер в XFM-1 требует добавок с 13 мг / мл сывороточного альбумина человека (HSA), в концентрации , которая отражает расчетное общее содержание белка в СКК (рис 3D). Одиночные компактные сферы не легко образуют в основном XFM-1 без HSA или в безбелковом αMEM (рис 3D). Во время сборки сферы, изменения фенотипа MSC радикально (рисунок 4), а также, когда в соответствующем химически определенной XF среде (т.е. XFM-1 + HSA), экспрессия многочисленных противовоспалительных факторов активируемых включая PGE2 и TSG6 (рис 4С). Тем не менее, производство TSG6 и PGE2 не заметно увеличены в ПКЦ культивируемых в виде сфер в XFM-2 или XFM-1 без ЧСА (фиг.4С). Особенно эти противовоспалительные факторы, а также факторы, противораковые TRAIL и IL-24, были высоко в шаровидных повышающей регуляции MSCs по отношению к монослоя MSCs, когда тон сфер культивировали в XFM-1 с добавлением либо рекомбинантного HSA (rHSA) или клинического класса HSA (CHSA) , полученного из крови человека (рис 4D).

Для того, чтобы оценить терапевтический потенциал MSC сфер , полученных в различных составах средств массовой информации, несколько практических испытаний выполняются (рисунок 5). Свойства иммунной модулирующие сфероидов сначала определяются в пробирке путем измерения влияния сферы СМ на уровни цитокинов , производимых LPS-стимулированных макрофагов и CD3-стимулированных спленоцитов / лимфоциты (рисунок 5). КМ от MSC сферы культивируют в СКК и XFM-1 / HSA в значительной степени подавлено производства макрофагальной TNF & alpha ; и IFN & gamma ; спленоцитов, в то время как в то же время повышенные уровни противовоспалительного цитокина IL-10 (рис 5А и 5В). Свойства противораковой сфер оценивали путем измерения влияния сферы CM Oрост н и морфология клеток рака простаты LNCaP. Среда XF XFM-1 / HSA эффективно уменьшить LNCaP пролиферацию , аналогичную FBS-содержащей СКК (Рисунок 5C и 5D).

Важно отметить, что интактные MSC сферы могут быть введены в брюшную полость мыши , чтобы проверить противовоспалительную активность клеток в живом организме (рисунок 6). Для этих экспериментов сферы подготовлены для инъекций в HBSS, содержащей низкую концентрацию HSA, что сводит к минимуму их адгезию к пластиковой трубке, сохраняя при этом состояние XF. Впоследствии сферы могут быть легко впрыскивается после передачи из коллекции трубки (рисунок 6 , а ), с помощью пипетки (рис 6б), через узел иглы / катетер (Рисунок 6С и 6D) соответствующим образом расположены на стандартной внутрибрюшинной инъекции. Используя этот подход, MSC сфероиды может быть регулярнопереносится на эффективность более 90% (рис 6e и 6f) , не нарушая их целостности (рис 6G и 6Н). Неправильное расположение наконечника катетера в брюшную полость приводит к ухудшению доставки сферы и высокой удержания (рис 6f). Важно отметить, что уровень удержания сферы внутри пипетки / катетер может быть качественно определяется путем визуального осмотра, или количественно путем сбора / лизиса нераспределенной сферы и измерения количества клеток с коммерчески доступной ДНК на основе клеток Количественное реагента / комплект (Рисунок 6f). После инъекции анализ удержания сферы помогает создать критерии включения / исключения в ходе экспериментов. Следует отметить, что способность к СКК и XFM-1 / HSA сфероидов секретировать высокие уровни TSG6 и ПГЕ2 поддерживаются по меньшей мере 6 ч после переноса сфер из свисающими культур (рис 6i). Подобно их в пробирке эффекты, XFM-1 / HSA сферы вводят в брюшную полость мыши, сразу после индукции системного воспаления внутривенного введения LPS, усиленного ПГЕ2 и уровни IL-10 в брюшине при уменьшении провоспалительного TNF - alpha (рис 6J).

Рисунок 1: Схематическое представление платформы , разработанной для задействования secretome из MSCs загрунтованных в виде сферических микро-тканей в условиях XF. После расширения в виде монослойных культур (1), MSCs суспендируют в висячей капли из крышке чашки для культивирования (2) при высокой концентрации клеток, чтобы активировать / простое число клеток. Через 72 ч, как (3) кондиционированной среде (СМ) и (4) интактные сфероиды могут быть собраны из капелек и используются в различных применениях, ниже по течению. CM богат иммуномодулирующих факторов, а также другим терапевтическим COMPONЭнты. Компактные сфероиды , которые формируются в висячей капли могут быть легко перенесены с помощью пипетки (5) и эффективно вводить в естественных условиях через (6) катетера. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Характеристики роста из костного мозга ПКЦ в однослойных культурах. MSCs в проходе 2, высевали при низкой плотности (100 клеток на см ²⁾ в 15 см чашки (15000 клеток на чашку) и культивировали в течение 7 дней в СКК. Среду заменяли на 3-й день, а затем еще раз в день 5 или 6 (24-48 ч до сбора клеток). Представительные фазового контраста микрофотографии ПКЦ 3 дня (а) и 7 дней (B) после посева клеток. Шкала бар = 200 мкм. (С) Кинетика роста MSCsполученный из 3 -х доноров определяли путем подсчета количества жизнеспособных прикрепленных клеток ежедневно с 2 дня до 7 дней Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Получение культур висит падение для грунтования MSC сфероидов в среде XF. (А) Фотография , изображающая технику быстро слой висячей капли на нижней стороне ткани культуры блюдо крышкой. (Б) фотография , иллюстрирующую висячей капли после инверсии и позиционирование крышки на блюдо основанием. (C) , зависящие от времени изменения в агрегации 25000 MSCs в висячей капли , как визуализировали с помощью фазово-контрастной микроскопии. Цель была сосредоточена на вершине капли. Шкала бар = 500 мкм. (D) ИмаGES МСК сфер формируется после 3 -х дней в свисающими культур с использованием различных средств массовой информации композиций , включающих αMEM с и без FBS (т.е. СКК), XFM-1 с и без HSA, и XFM-2 с и без HSA. Шкала бар = 200 мкм. Данные в панели D были получены из оригинальной статьи с разрешения издателя ^14. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Оценка активации MSC в 3-D XF культур. (A) Шары / CM собирают через 72 ч путем переворачивания / наклона крышки тарелки и заставляя капельки до края с помощью мобильного подъемника. Шары, собранные из 25000 клеток можно легко визуализировать во время сбора. (B) Фотография Approxiзительно 500 сфер, собранные из крышек многочисленных культуральных планшетах. Шары быстро опускаются на дно трубы без центрифугирования. (C) Уровень PGE2 секретируется из MSC шаров после 72 ч измеряли с помощью ELISA. В режиме реального времени RT-PCR использовали для измерения уровней TSG6. Оба TSG6 и PGE2 являются ценными маркерами для скрининга активации MSC в сфероидов. Среда XF XFM-1 + HSA показал высокий уровень PGE2 и производства TSG6 (красные коробки). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение и анализировали с помощью т-теста Стьюдента (*** р <0,001, по сравнению с образцом αMEM). (D) ПГЕ2 ELISA и в режиме реального времени RT-ПЦР - анализ на сферах , произведенных в СКК и XFM-1 , дополненной в частности , с 13 мг / мл рекомбинантного HSA (rHSA), или клиническая оценка HSA (CHSA) , полученные из венозной крови человека. Сложите изменения определялись из прикрепленных однослойных MSCs (RQ = 1). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение и анализировали с помощью т-теста Стьюдента (** р <0,01, *** р <0,001, по сравнению смонослой MSCs). Некоторые данные в панелях C и D были получены из оригинальной статьи с разрешения издателя ^14. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: В пробирке функциональных анализов для оценки противовоспалительными и противораковыми свойствами MSC-CM , собранные от виселицы культур падения. (А) Характерные результаты ELISAs , показывающие влияние сферы СМ (ССМ и XFM-1 / HSA) по производству TNF & alpha ; и IL-10 под действием ЛПС-стимулированных макрофагов мышей (MQ). (Б) Типичные результаты ELISA , показывающие влияние сферы СМ (ССМ и XFM-1 / HSA) по производству IFN & gamma ; по спленоцитов мышей (УЗД) , стимулированных с антителом анти-CD3. (C) фазового контраста микрофотографии клеток рака простаты LNCaP , обработанных с основными МНЛЗ и XFM-1 / HSA или кондиционированной среды (КМ) от MSC сфер , подготовленной в СКК и XFM-1 / HSA. LNCaP клетки культивировали в среде RPMI (контроль). Шкала бар составляет 200 мкм. (D) Количественные изменения в росте раковых клеток LNCaP предстательной железы определяли с помощью коммерчески доступного ДНК на основе клеток Количественное реагента / комплект. Пунктирная линия указывает на плотность засева 5000 клеток на лунку. Данные во всех панелях показаны как среднее ± стандартное отклонение, и анализировали с помощью Т-критерия Стьюдента (*** р <0,001). Некоторые данные во всех панелях были получены из оригинальных статей с разрешения издателя ^14. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

нагрузка / 55126 / 55126fig6.jpg "/>
Рисунок 6: Эффективная передача интактных сфероидов, МСК , полученных в условиях XF, с использованием системы 20G IV иглы / катетера. (А) представитель фотография 15 мл коническую пробирку с XFM-1 / ЧСА MSC сфер , подготовленные для инъекций в HBSS , содержащем 0,2% HSA. (B) представитель фотография MSC сфер после аспирации в 200 мкл кончика пипетки. (C) Изображение узла 20 G иглы / катетера , используемого для управления неповрежденные MSC сфероидов в мышей. (D) Изображение демонстрирует правильное положение кончика пипетки в переходник полиуретанового катетера. (Е) изображение MSC сфер сразу после прохождения их через катетер в культуральную чашку. Приблизительно 95 сфер из 100 были переданы. (F) Эффективность доставки сферы в брюшную полость мышей определяли путем сбора / лизирующий сфер , сохраненными впипетка / катетер и измерения количества клеток, с помощью ДНК-на основе клеток квантификации анализа коммерческой, по отношению к числу клеток, полученных из полного набора лизированных сфер. Пунктирная красная линия указывает на эффективность передачи 90%. Плохая доставка сфера (71%) наблюдалась при одной инъекции (стрелка). (G) фазового контраста микрофотографии сфер в панели Е (увеличенное изображение). Шкала бар = 200 мкм. (H) фазового контраста микрофотография XFM-1 / HSA шар 16 ч после переноса на тканевой культуры , блюдо. Фибробластическая, веретенообразный морфология MSCs сохраняется в клетках, которые мигрировали из сферы. Шкала бар = 200 мкм. (I) ELISA анализы для противовоспалительных факторов TSG6 и ПГЕ2 были выполнены на СМ собрали 6 ч после переноса сфер в 6-луночные планшеты , содержащие 2 мл αMEM / 2% FBS. Шары, подготовленные в среде XF XFM-1 / HSA показал высокий уровень TSG6 и секрецию PGE2 (красные коробки). Данные, выраженные в виде среднего значения± SD, были проанализированы с помощью Т-критерия Стьюдента (*** р <0,001, по сравнению с образцом αMEM). Некоторые данные были получены из оригинальной статьи с разрешения издателя ^14. (J) , репрезентативной графики , иллюстрирующие способность к сфероиды, впрыскиваемого в брюшную полость, чтобы увеличить перитонеальный PGE2 и IL-10, уменьшая уровень TNF & alpha ; в мышах , которым с помощью внутривенной инъекции эндотоксина (LPS). Образцы были получены путем перитонеального лаважа 6 ч после индукции воспаления и доставки 80 сфероидов. Данные, выраженные в виде среднего значения ± SD, были проанализированы с помощью Т-критерия Стьюдента (* р <0,05, ** р <0,01, по сравнению с контролем). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Оптимальная MSC для использования в некоторых научно-исследовательских и клинических применений должны быть высоко активированы, чтобы максимизировать их выгоду, и предпочтительно получают в химически определенных условиях XF, чтобы минимизировать доставку потенциальных антигенов из ксеногенных компонентов среды, таких как FBS. В протоколах, описанных здесь, мы показали методы: 1) активировать MSCs в 3D культуры путем формирования сфероидов, 2) достижения 3D активации ПКЦ в условиях XF, 3) оценить уровни активационных сфероида ПКЦ в отношении их анти- противовоспалительное, иммунно-модулирующее, и потенциальный противораковый, и 4) обеспечивают активированные MSCs в неповрежденных сфероидов мышам.

MSCs мультипотентны стволовые клетки, которые могут быть изолированы с помощью пластической приверженностью из многочисленных взрослых тканей, включая костный мозг и жировую ткань. MSCs легко размножаются на культуре ткани пластика при относительно высокой (10-20%) концентрации FBS, выражают определенный набор поверхностных маркеров, иможно дифференцировать по крайней мере , в Adipogenic, остеогенных и хондрогенными родословных ^{1, 16, 17, 18.} МСК были продемонстрированы оказывают благоприятное воздействие на различных животных моделях заболеваний человека, несмотря на то, что они , по всей видимости сохраняются только скоротечно после их введения в естественных условиях. Эффект MSCs Поэтому был назван "хит и запустить" и часто опосредовано противовоспалительными и иммуномодулирующими факторов паракриновых, такие как PGE2, TSG-6 и indoleamine 2,3-диоксигеназой (ИДО), выделяемый MSCs ^{2 , 3, 11, 19, 20, 21.} Тем не менее, для того, чтобы произвести эти факторы, MSCs требует активации, либо с помощью сигналов от поврежденной ткани или от иммунной Cгезов получателя. Впоследствии, наблюдается появление интерес к развитию MSC предварительной активации или заливке протоколы до доставки клеток в животных или больных ^22. Кроме того, наличие антигенных компонентов FBS в стандартных MSC препаратов вызывает озабоченность. Таким образом, были проведены исследования с целью определения оптимальных условий химически определенных для MSC XF культур. В нашей недавней работе мы впервые показали , что МСК может быть активирована в 3D образованием сфероидов, а затем обнаружили , что активация клеток также может быть достигнута при определенных ^{условиях,} XF ^{8 12, 13, 14.}

3D методы клеточной культуры были использованы на протяжении десятилетий с целью обеспечения подлинных физиологических условий, в основе клеток исследований. Культуры в 2D игнорировать 3D характер тканей и, следовательно, не всегда перепросматриватьклетка от клетки к и клетка-матрица взаимодействия важных в клеточной сигнализации. Многие 3D методы культивирования используют вращающиеся сосуды, вращающихся колбах или различные неадгезированных поверхности, тем не менее, самый большой недостаток во многих из этих методов является гетерогенность генерируемого сфероида размера и / или требования конкретного дорогостоящего оборудования. Исследования также проводились с использованием висячей капли культуры , которые по существу поощряют MSCs спонтанно агрегат в одну сфероида ^{4, 5, 6, 7, 8, 9, 23.} Следует отметить, что висит культуры капель поддерживают сборку относительно однородных микро-тканей / агрегатов, с дополнительным преимуществом, которое позволяет легко манипулировать размером совокупности клеток путем корректировки концентрации клеток и / или объема капли. Кроме того, овладение висячего дROP техника культура не требует широкой подготовки. Капли 25-40 мкл могут быть легко получены с ПКЦ при высоких концентрациях клеток, обычно 500-1000 клеток на мкл. Капли меньше, чем 20 мкл, как правило, быстро испаряются, и те больше, чем 45 мкл часто мазать на крышке во время инверсии. Однако, когда листать крышку, содержащую капли любого размера, скорости и направленности являются критическими параметрами, которые следует учитывать для поддержания поверхностного натяжения и соответствующей формы капли / сфероида. Бесперебойное культура и надлежащая циркуляция воздуха в инкубаторе также имеют важное значение для обеспечения агрегата в МСК одной сферы в каждой капле.

Недостатком этого метода является то, что пластины, содержащие висячей капли не должны быть уложены в инкубатор или перемещены во время сборки сферы, делая расширение масштабов для лечения пациентов трудно. Кроме того, изменение среды в висящих культур падение является чрезвычайно сложной задачей, при этом долгосрочные культуры должны быть прoided. Кроме того, низкое соотношение медиа-к-клетке в подвесных капель может привести к истощению питательных веществ и накопление отходов конечном итоге приводит к потере важных клеточных функций и / или гибель клеток.

Тем не менее, при правильной технике висячей капли, мы показали, что МСК в сфероидов становятся очень активными или грунтовкой, в том, что клетки становятся фабрики мощных противовоспалительных молекул PGE2 и TSG6, а также молекул противораковых IL-24 и TRAIL. Мы показали , что MSC сфероиды действительно являются противовоспалительным и иммуномодулирующим, а также имеют противораковые свойства , превосходящие их 2D однослойных аналогов в многочисленных функциональных анализов с использованием культивированных макрофаги, спленоциты и клетки рака простаты ^{8, 12, 13, 14.} Кроме того, мы показали, что MSC сфероиды могут оказывать мощное противовоспалительное действие при введениив брюшную полость мышей с перитонитом ^8. В частности, мы показали, что большие сфероидов приблизительно 400-500 мкм в диаметре (25000-30000 MSCs каждый) могут эффективно использоваться в небольшом объеме HBSS с помощью 20G иглы / катетера в сборе и стандартный пипетку. С помощью данной методики, неправильной установки катетера, что приводит к высоким сопротивлением потоку текучей среды, может быть легко определено до сфероида передачи сначала путем введения небольшого объема HBSS / HSA, как описано в протоколах. Сфероиды в правильном расположении катетера будет течь свободно, при условии, что HBSS, дополняется HSA, чтобы минимизировать сферу адгезию к пластиковой трубке, и их можно легко визуализировать. Кроме того, этот метод предотвращает напряжение сдвига на клетки, которые могут произойти с использованием стандартной иглы / шприца для инъекций, и избавляет от необходимости хирургического разреза, который несет высокий риск заражения и является технически более сложной задачей. Одним из основных недостатков является тшапка большое количество сфероидов могут быть введены только в просторные полости тела, такие, как брюшной полости, так как сопротивление против передачи сферы через катетер высок в суженных зонах.

Недавно мы также показали, что тот же уровень активации MSC в сфероидов может быть достигнуто путем использования конкретного коммерчески доступный носитель XF, называемый здесь XFM-1, до тех пор, как она была дополнена HSA, полученный из человеческой крови или получены с помощью методов рекомбинантной ^14. Важно отметить, что MSC сфероиды не производят высокие уровни PGE2 и TSG6 во всех типах сред ¹⁴ XF, вероятно потому , что большинство средств массовой информации для XF ПКЦ первоначально были разработаны для оптимального расширения ячеек в 2D. Важно также отметить , что различные типы АСП различаются по своей потенции ^14. Кроме того, абсолютный уровень ПГЕ2 обнаружен в СМ активированных сфероиды могут варьироваться в небольшоеLY как ELISA, применяемого для PGE2 действительно конкурентный анализ. Таким образом, крайне важно, чтобы включить надлежащего контроля в каждом ELISA PGE2 и избежать сравнения данных непосредственно между образцами, проанализированных в разное время или в разных пластинах. Кроме того, должны быть MSCs тщательно промывают в среде XF до подготовки висячей капли, чтобы удалить остаточный ССМ и, следовательно, предел унос компонентов FBS. Протоколы, описанные здесь, могут быть легко приняты для оценки других составов средств массовой информации по формированию сферы и экспрессии терапевтического гена.

Очевидно, что множество клеточных сигнальных событий, которые обычно не встречаются в 2D ПКЦ устанавливаются в движение, когда MSCs культивируют в 3D. Cell-к клетке и клетка-матрица взаимодействий, опосредованный образованием сфероида кадгерины и интегрины направляющей и уплотнением ^{24, 25, 26} и, вероятно , важное значение для сфероида терапии. По мере того как клетки агрегировать и совместноMPACT в сфероиды, различных стрессовых сигналов, в том числе незначительные апоптоза, помощь в процессе активации MSC , что приводит к получению многочисленных потенциально терапевтических факторов ^{4, 5.} Ранее мы показали критическую роль аутокринном IL-1 сигнализации в активации и производстве PGE2 и TSG6 ¹² MSC. Хотя многое остается неизвестным о различных сигнальных путей, которые помогают в активации MSC, повешение падение культуры платформа дает практический способ для изучения этого явления и улучшить MSC на основе терапии. В целом, мы описали, в протоколах здесь, средство активации или грунтовки MSCs в 3D культурах, при химически определенных условиях XF, производить противовоспалительное, иммуномодулирующее и факторы противораковые. Мы также описали , каким образом эти нетронутые MSC сфероиды могут быть доставлены в естественных условиях.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling