Summary
Этот протокол описывает in vitro сравнение двух ключевых функциональных характеристик ритуксимаба: связывание с мишенью и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). Методы были использованы для сравнения между эталонным ритуксимабом и биоподобным ритуксимабом. Эти анализы можно использовать во время биоподобного развития или в качестве контроля качества в их производстве.
Abstract
Терапевтические моноклональные антитела (mAbs) имеют отношение к лечению различных патологий, включая раковые образования. Разработка биоподобных mAb фармацевтическими компаниями - это рыночная возможность, но это также стратегия увеличения доступности лекарств и снижения затрат, связанных с терапией. Протоколы, подробно описанные здесь, описывают оценку связывания мишеней и индукцию CDC ритуксимабом в клетках Daudi. Эти две функции требуют различных структурных областей антитела и имеют отношение к клиническому эффекту, индуцированному ритуксимабом. Протоколы позволяют проводить параллельное сравнение эталонного ритуксимаба и биодоступного ритуксимаба. Оцененные продукты демонстрировали различия как в связывании с мишенью, так и в индукции CDC, предполагая, что существуют фундаментальные физико-химические различия и подчеркивается необходимость анализа влияния этих различий в клинических условиях. Описанные здесь методы являются простыми и недорогими in vitro </ Em> для оценки активности биосимиляров ритуксимаба. Таким образом, они могут быть полезны при биоподобном развитии, а также для контроля качества в биоподобном производстве. Кроме того, представленные методы могут быть экстраполированы на другие терапевтические mAb.
Introduction
Терапевтические антитела представляют собой рекомбинантные моноклональные антитела (mAb), разработанные для лечения различных патологий, включая рак, аутоиммунные и хронические заболевания, неврологические расстройства и другие. 1 . В настоящее время FDA одобрило более 40 терапевтических моноклональных антител, и ожидается, что в последующие годы ожидается их появление на рынке.
Ритуксимаб - это высокоаффинное химерное моноклональное антитело IgG1, одобренное для лечения лимфомы CD20 + В-клеток неходжкинской лимфомы (NHL), CD20 + фолликулярной NHL, хронического лимфолейкоза и ревматоидного артрита 2 , 3 . Признание CD20, который сверхэкспрессируется в В-клетках ритуксимабом, индуцирует апоптоз; Активация комплемента; И антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) 3 . Патенты на этот препарат истекли в Европе и в США в 2013 и 2016 годахСоответственно. Таким образом, фармацевтические компании по всему миру разрабатывают ритуксимаб биоподобий. Как и в любом другом препарате для потребления человека, биоаналоги требуют одобрений регулирующих органов. Международные руководящие принципы показывают , что для МКИ, biosimilarity должна быть продемонстрированы путем сравнения физико - химические характеристики, фармакокинетика, эффективности и безопасности новых и эталонных продуктов 4.
Соответственно, методики, используемые в таких сравнениях должны оценить структурные и функциональные характеристики мАта, особенно с клинической значимостью. С этой целью, анализы в пробирке показывают несколько преимуществ по сравнению с экспериментами в естественных условиях (обзор в Chapman и др.) 5: I) в пробирке исследование более чувствительны к различиям между предлагаемым биоподобием и эталонным продуктом; б) в естественных условиях исследования должны быть выполнен в соответствующих видах, которые в течение многого мАта являютсянечеловеческие приматы; и III) , так как механизм действия, доклинической токсикологии, а также клинических эффектов эталонного продукта, хорошо известны, в естественных условиях исследования с биоподобий не могут обеспечить дополнительную полезную информацию. Соответственно, Руководство Европейского Союза по биоподобиям позволяет кандидатам ввести клинические испытания , основанные на надежном в одних только 6 лабораторных данных.
Здесь мы представляем два быстрых, экономические и простые анализы , которые оценивают биологическую активность ритуксимаба с использованием CD20 + культивируемых клеток. Эти анализы могут быть включены как часть сопоставимости упражнения для ритуксимаба биоподобных кандидатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Оценка связывания мишени с помощью проточной цитометрии
- Получение биологических материалов и реагентов
- Сделать 500 мл культуральной среды RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (H-IFBS).
- Лимфома (Даудите) клетка культуры Дауди Беркитта и Даудите GFP + клетки с использованием RPMI и 75-см 2 колбы с культурой. Поддерживать культуру при 37 ° С в 5% СО 2 увлажненной атмосфере , пока они не достигают 6 - 9 × 10 5 клеток / мл.
- Сделать 50 мл окрашивающего буфера путем разбавления 1/100 H-IFBS в PBS; этот буфер стабилен при 2 - 8 ° C в течение по крайней мере, одного месяца.
- Подготовка тестовых решений для справки и биоподобных моноклональных. Сделать десять 1: 2 серийных разведений (500 мкл каждого) в буфере окрашивания, начиная с 5 мкг / мл.
- С помощью окрашивания буфера для разбавления человеческого IgG (контроль изотипа) до 5 мкг / мл и РЕ-Су5 мыши против человеческого IgG (вторичного антитела) к концентровка предложенный производителем.
- Подготовьте 4% параформальдегида в PBS (фиксация буфера).
- Целевое связывание
- Сбор Дауди и суспензий Дауди GFP + клеток из колбы с культурой 75 см 2 и передавать их в центрифужную пробирку 15 мл. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин.
- Промывают клетки путем добавления 5 мл PBS и центрифугирование клеточной суспензии при 400 мкг в течение 5 мин.
- Ресуспендируют клеток в PBS и выполнять подсчет клеток и анализ жизнеспособности с трипановым синим. Использование культур с уровнями жизнеспособности клеток ≥ 95% для анализа.
- Развести клеточную суспензию до 4 × 10 6 клеток / мл с холодным буфером окрашивания.
- В микропробирок 1,5 мл, добавляют 50 мкл клеточной суспензии в 100 мкл различных концентраций испытании эталонного или биоподобных мАт. Включите повторы для каждого экспериментального условия.
- Подготовьте дополнительные трубки дляконтроль изотипа (IgG1 человека вместо ритуксимаба) и отрицательный контроль (вторичное антитело без первичного антитела).
- Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 20 - 30 мин.
- Промывают клетки путем добавления 1 мл PBS и центрифугирование клеточной суспензии при 400 мкг в течение 5 мин при 10 ° С. Жидкость над осадком сливают.
- Суспендирования клеток в 100 мкл вторичного антитела и инкубируют в течение 20 - 30 мин при 4 ° С, в защищенном от света месте.
- Вымойте клетки дважды с PBS и подвесить их в 200 мкл буфера фиксации.
- Анализ клеток на цитометр потока.
Примечание: Сигнал остается стабильным в течение нескольких дней, если образцы хранили при 4 ° С в защищенном от света.
- Получение данных
- Открыто два дот-участки на листе потока цитометрии операционного программного обеспечения. Установите FSC-A в сравнении с FSC-H в первой и FSC-A в сравнении с SSA-А во втором. Открыть гистограмму для канала PE-Cy5.
- На графике FSC-A и FSC-H сделайте выбор (R1) для выбора синглетных событий ( рисунок 1A ).
- Задайте населенность R1 в точках FSC-A и SSA-A, а затем создайте новый затвор (R2), выбрав целевые ячейки ( рисунок 1B ). Задайте населенность R2 в гистограмме интенсивности PE-Cy5 для просмотра частотного распределения ячеек.
- Отрегулируйте нижнюю интенсивность флуоресценции (FI) для канала PE-Cy5, используя отрицательный и изотипический контроль ( рисунок 1C ).
- Приобретите 10,000 событий в R2 из образца с более высокой концентрацией эталонного продукта. FI этого образца должен быть самым ожидаемым ( рис. 1С ).
- Приобрести остальные образцы.
- Для каждого образца получить среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) в канале PE-Cy5.
- Для образцов с эталонным или биоподобным mAb рассчитывают разницу между образцом MFI и контрольным образцом изотипа (ΔMFI).
2. Оценка CDC
- Получение биологических материалов и реагентов
- Приготовьте среду для культивирования клеток и культур Дауди и Даудите GFP + клетки , как описано выше (этапы 1.1.1 - 1.1.2).
Примечание: Кроме того, анализ CDC требует бессывороточной RPMI. - Развести нормальный человеческий сывороточный комплемент (NHSC) 1: 2 с бессывороточной RPMI. Подготовьте 2,5 мл.
- Подготовить 1 мл инактивированной нагреванием (30 мин / 56 ° C) NHSC разводили 1: 2 RPMI.
- Подготовка наборов тестов решений для справки и биоподобного мАт в бессывороточной среде RPMI. Сделать десять разведений (200 мкл каждого) от 1 до 0,025 мкг / мл.
- Приготовьте среду для культивирования клеток и культур Дауди и Даудите GFP + клетки , как описано выше (этапы 1.1.1 - 1.1.2).
- CDC анализ
- Сбор клеток Дауди и Даудите GFP + из культур и количественное определение жизнеспособности клеток (см шагов 1.2.1 - 1.2.3).
- Приготовьте суспензию клеток с 4 × 10 5 клеток / мл в бессывороточной среде RPMI.
- Добавить50 мкл клеточной суспензии до 50 мкл каждой контрольной или биоподобной концентрации mAb-теста в 96-луночных конических (V) -базовых микропланшетах. Включите повторы для каждого экспериментального условия.
- Приготовьте дополнительные лунки для отрицательного контроля ( т.е. без mAb), контроля основной гибели ( т.е. инактивированного нагреванием NHSC в присутствии mAb) и окрашивания положительным контролем ( т.е. клеток , подвергнутых воздействию 50 мкл 70% EtOH).
- Инкубируйте клетки в течение 20-30 мин при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО 2 .
- Добавить 50 мкл NHSC (разбавленный 1: 2) в каждую лунку и инкубировать опсонизированные клетки в течение 2,5 ч при 37 ° С в 5% CO 2 -увлажненной атмосфере. Используйте Инактивированную теплом NHSC в базальных скважинах контроля смертности.
- Центрифуга при 400 xg в течение 5 мин при 10 ° C. Отбросьте супернатант.
- Промойте клетки, добавив 150 мкл PBS и центрифугируя клеточную суспензию в течение 5 мин при 400 xg и 10 ° C. диSCard супернатант.
- Пятно образцы с 7-aminoactinomycin (7-AAD), как описано ранее , 7, 8.
- Анализ клеток на цитометр потока в тот же день.
- Получение данных
- Открыто два дот-участки на листе потока цитометрии операционного программного обеспечения. Установите эти участки как на этапах 1.3.1 - 1.3.3 (рис 2A-B). Создайте третий сюжет, который является точка-участок для GFP в сравнении с 7-AAD на население R2.
- Определить адекватные пределы FI с использованием клеток Дауди, Дауди GFP + клеток, и смерть положительный контроль (фиг.2С).
- Для каждого образца, измеряют процент 7-AAD + клеток - мишеней. Приобретение по меньшей мере, 5000 событий из R2.
- Рассчитать удельную мАт-индуцированную цитотоксичность путем вычитания процентного содержания 7-АСР + в базальном контроле смертности от процентного найденных в образцах с отличаютсяКонцентрации ЛОР мАт (фигура 2D).
3. Анализ Biosimilarity
- Введите значение концентрации и реагирования в графическом программное обеспечение.
- Генерация графики и вычислить нелинейные регрессии с учетом следующих соображений: я) использовать лог-преобразование концентрации МКА как «X»; б) использовать переменную крутизну математическую модель (Y = минимальный ответ + (максимальный ответ - минимальный ответ) / 1 + 10 ^ ((LogEc 50 -X) * Хилл склон)); и III) ограничивают нижние значения к нулю, так как базальной ответ был вычитали.
Примечание: Кривые с симметричной сигмовидной формой, как ожидается. - Сравните оба нелинейных припадки с глобальной посадкой с использованием F-тест (компьютерные программ многих графических включить эту функцию).
Примечание: Такие испытания устанавливают в качестве нулевой гипотезы о том , что максимальный ответ, LogEc 50, а наклон Хилла являются одинаковыми для двух наборов данных, который соответствуетБиологический вопрос, который предполагается решить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя протоколы, описанные выше, сравнение с мишенью и индукцию CDC эталонного ритуксимаба сравнивали с таковыми для биоподобного ритуксимаба, полученного и коммерчески доступного в Азии.
В клетках Daudi оба mAb связывали CD20 зависимым от концентрации образом ( фиг. 1D ). Нелинейные регрессии данных связывания отображали r 2 из 0,978 и 0,848 для эталонного и биоподобного ритуксимаба, соответственно ( Рисунок 1E ). Статистический анализ кривых концентрация-реакция показал, что они, а следовательно, и рассчитанные на их основе фармакодинамические параметры, значительно отличаются между mAb (P <0,0001). Максимальный отклик на биоподобие был в 2,16 раза ниже, чем у эталонного продукта. Эти результаты указывают на то, что два оцененных mAb имеют разные способности связывать CD20, экспрессированные на мнеMbrane лейкозных клеток.
Индукция CDC также сравнивалась с двумя mAb. Ссылочные и биоподобные продукты стимулировали CDC в клетках Daudi в зависимости от концентрации ( рисунок 2E ). Важно отметить, что концентрации, при которых индуцированные mAb CDC были разными, чем концентрации, необходимые для связывания мишеней. Нелинейные регрессии данных CDC показали r 2 > 0,980 для обоих продуктов. Статистическое сравнение кривых концентрация-реакция показало, что они значительно отличаются (P <0,01), делая биоподобное менее сильным. Эти данные показывают, что способность индуцировать CDC различна для проанализированных mAb.
Рисунок 1. In vitro Target-binding анти-CD20 терапевтических mAbs. Дауди GFP + клетки подвергались различной(4,8 нг / мл до 5 мкг / мл), а затем окрашивали конъюгированным с PE-Cy5 антителом против человеческих вторичных антител. Интенсивность флуоресценции (FI) измеряли проточной цитометрией по отдельным событиям (A) с размером и гранулярностью, соответствующими размерам клеток Дауди (B) . Для установки пределов FI (C) использовали неокрашенные клетки (светло-серый), изотипические контроли (темно-серый) и 5 мкг / мл эталонного ритуксимаба (синий ) . Оба оцененных mAb связывали клетки Daudi в зависимости от концентрации (D) . Ответы (ΔMFI, см. Текст) использовали для получения кривых зависимости концентрации-ответа для эталонного (синего) или биоподобного (черного) ритуксимаба (E) . Статистическое сравнение нелинейных регрессий показало различия между mAbs (P <0,0001, точный критерий Фишера). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версиюна этой фигуре.
Рисунок 2. CDC индукция анти-CD20 моноклональных антител терапевтических. Даудите GFP + клетка опсонированную с различными концентрациями мАта воздействия комплемента человека. Гибель клеток оценивали с помощью 7-AAD окрашивания и анализа проточной цитометрии интенсивности флуоресценции (FI) на единичных событиях (А), с размером и зернистость , соответствующие клетки Даудите (B). Необработанный GFP- (черный) и GFP + (зеленый) клетки и этанол убитых клеток (красный) , были включены в качестве контрольных (C). Количественный из 7-AAD + клеток в контроле базально-смерти (серый) и образцы ритуксимаба (синий) , разрешенных для расчета мАта-индуцированной цитотоксичности (D). Кривые зависимости ответа от концентрации , полученные для справки (синий) или биоподобие (черный) ритуксимаб (E), Статистическое сравнение нелинейных регрессий показало различия между ответами, вызванными двумя mAb (P <0,01, точный критерий Фишера). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1. Моноклональные антитела, одобренные для терапевтического использования, с клетками-мишенями для анализа CDC. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Патентная истечение терапевтического МАБ способствует развитию биоподобий. Таким образом, существует потребность в простых методов, которые могут выявить различия в клинически значимых деятельности этих продуктов. CD20 + культивируемые клетки были использованы для оценки два ключевых функциональных характеристик ритуксимаба: мишень связывания и CDC индукции. Прежняя деятельность требует признаний CD20 по ливерпульской области МКИ, а последние зависит в основном от взаимодействия Fc области с его дополнением 9. Таким образом, эти анализы обеспечивают способ связать структурные и функциональные характеристики мАта.
Связывающийся с мишенью терапевтических моноклональных антител обычно оценивается с помощью изотермической калориметрии титрования (ITC), поверхностного плазмонного резонанса (SPR), или бислоя интерферометрии 10, 11, 12. Эти анализы позволяют афРасчет Finity, но они требуют специального оборудования и подготовки. Протокол, описанный здесь, оценивает цель связывания в сравнении стороны в сторону, чтобы определить различия между продуктами, даже без данных сродства. Метод прост и использует соответствующий клеточный контекст для оценки деятельности. С другой стороны, CDC индукция ритуксимаба может быть оценена путем измерения АТФ 13, количественное определение высвобожденного лактатдегидрогеназы (ЛДГ) 14 или 15 AlamarBlue и МТТЫ анализов 16. Способ сообщался здесь, с использованием 7-AAD окрашивания, имеет низкий фон и может быть объединен с другими пятнами для многопараметрического анализа проточной цитометрии.
В представительных экспериментах , представленных, кривые доза-ответ установлен на четыре параметра логистическую модель, что позволяет для расчета EC 50, наклон Хилла, и максимальный ответ. Следует отметить, что диапазоны КонцентрацаИспользуемые для создания таких кривых, были разными для каждого анализа, подчеркивая важность анализа и определения адекватных диапазонов в предварительных экспериментах. Изменения ключевых реагентов, таких как флуорохромы и добавки, или использование клеточной линии с другим целевым уровнем могут вытеснить эффективный диапазон концентраций.
Статистический анализ выявил различия между одной партией биоподобного ритуксимаба, коммерчески доступного в Азии, и эталонного продукта, как при целевом связывании, так и при индукции CDC. Важно учитывать, что даже когда производственный процесс для mAb жестко контролируется, каждый атрибут эталонного продукта отображает диапазон. Соответственно, минимальное количество партий, которые должны быть проверены во время оценки аналогичного биотерапевтического воздействия, зависит от степени изменчивости эталонного продукта и от изменчивости анализа 4. Таким образом, эти протоколы должны применяться к differeнт партии в процессе оценки сопоставимости.
Представленные методы могут быть экстраполированы на другие пары терапевтических МАт-мишеней, до тех пор, как клетки, экспрессирующие антиген доступны. В таблице 1 приведена терапевтическая , кроме ритуксимаба , для которых CDC индукция имеет отношение к клинической эффективности и компилирует информацию о ранее сообщенных клеточных моделях для каждой МКИ МКА.
В заключение отметим, что два анализы, описанные здесь, просто, быстро и недорого, что позволяет их выполнение в большинстве лабораторий. Эти методы могут быть использованы во время ранних стадий развития биоподобия или после нормативного утверждения для сравнения партии к партии в процессе производства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Н. Салинас-Джазмин, Э. Гонсалес-Гонсалес и С. М. Перес-Тапиа являются сотрудниками UDIBI, которая проводит исследования биоподобности для нескольких фармацевтических компаний.
Acknowledgments
У авторов нет подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
References
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a Proposed Biosimilar RTXM83 and the Originator Rituximab. Bio Drugs. 30 (3), 225-231 (2016).
- Iwamoto, N., et al. Validated LC/MS Bioanalysis of Rituximab CDR Peptides Using Nano-surface and Molecular-Orientation Limited (nSMOL) Proteolysis. Biol Pharm Bull. 39 (7), 1187-1194 (2016).
- World Health Organization. Guidelines on evaluation of monoclonal antibodies as similar biotherapeutic products (SBPs). , Available from: http://www.who.int/biologicals/expert_committee/mAb_SBP_GL-ECBS_review_adoption-2016.10.26-11.7post_ECBS-Clean_Version.pdf (2016).
- Chapman, K., et al. Waiving in vivo studies for monoclonal antibody biosimilar development: National and global challenges. MAbs. 8 (3), 427-435 (2016).
- EMA, EMEA/CHMP/BMWP/42832/2005 Rev1. Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: non-clinical and clinical issues. , Available from: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/01/WC500180219.pdf (2014).
- Zembruski, N. C., et al. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 429 (1), 79-81 (2012).
- Salinas-Jazmin, N., Hisaki-Itaya, E., Velasco-Velazquez, M. A. A flow cytometry-based assay for the evaluation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) in cancer cells. Methods Mol Biol. 1165, 241-252 (2014).
- Teeling, J. L., et al. The Biological Activity of Human CD20 Monoclonal Antibodies Is Linked to Unique Epitopes on CD20. J Immunol. 177 (1), 362-371 (2006).
- Miranda-Hernandez, M. P., et al. Assessment of physicochemical properties of rituximab related to its immunomodulatory activity. J Immunol Res. 2015, 910763 (2015).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Ylera, F., et al. Off-rate screening for selection of high-affinity anti-drug antibodies. Anal Biochem. 441 (2), 208-213 (2013).
- Broyer, L., Goetsch, L., Broussas, M. Evaluation of complement-dependent cytotoxicity using ATP measurement and C1q/C4b binding. Methods Mol Biol. 988, 319-329 (2013).
- Herbst, R., et al. B-cell depletion in vitro and in vivo with an afucosylated anti-CD19 antibody. J Pharm Exp Ther. 335 (1), 213-222 (2010).
- Lazar, G. A., et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (11), 4005-4010 (2006).
- Winiarska, M., et al. Statins impair antitumor effects of rituximab by inducing conformational changes of CD20. PLoS medicine. 5 (3), e64 (2008).
- Zhou, X., Hu, W., Qin, X. The role of complement in the mechanism of action of rituximab for B-cell lymphoma: implications for therapy. Oncologist. 13 (9), 954-966 (2008).
- Hayashi, K., et al. Gemcitabine enhances rituximab-mediated complement-dependent cytotoxicity to B cell lymphoma by CD20 upregulation. Cancer Sci. 107 (5), 682-689 (2016).
- Mossner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Lapalombella, R., et al. A novel Raji-Burkitt's lymphoma model for preclinical and mechanistic evaluation of CD52-targeted immunotherapeutic agents. Clin Cancer Res. 14 (2), 569-578 (2008).
- Mitoma, H., et al. Mechanisms for cytotoxic effects of anti-tumor necrosis factor agents on transmembrane tumor necrosis factor alpha-expressing cells: comparison among infliximab, etanercept, and adalimumab. Arthritis Rheum. 58 (5), 1248-1257 (2008).
- Kaymakcalan, Z., et al. Comparisons of affinities, avidities, and complement activation of adalimumab, infliximab, and etanercept in binding to soluble and membrane tumor necrosis factor. Clin Immunol. 131 (2), 308-316 (2009).
- Zent, C. S., et al. Direct and complement dependent cytotoxicity in CLL cells from patients with high-risk early-intermediate stage chronic lymphocytic leukemia (CLL) treated with alemtuzumab and rituximab. Leuk Res. 32 (12), 1849-1856 (2008).
- Goswami, M. T., et al. Regulation of complement-dependent cytotoxicity by TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 35 (15), 1888-1898 (2016).
- Wang, A., et al. Induction of anti-EGFR immune response with mimotopes identified from a phage display peptide library by panitumumab. Oncotarget. , (2016).
- Ueda, N., et al. The cytotoxic effects of certolizumab pegol and golimumab mediated by transmembrane tumor necrosis factor alpha. Inflamm Bowel Dis. 19 (6), 1224-1231 (2013).
- Nesbitt, A., et al. Mechanism of action of certolizumab pegol (CDP870): in vitro comparison with other anti-tumor necrosis factor alpha agents. Inflamm Bowel Dis. 13 (11), 1323-1332 (2007).
- Teeling, J. L., et al. Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas. Blood. 104 (6), 1793-1800 (2004).
