Summary
Ce protocole décrit la comparaison in vitro de deux caractéristiques fonctionnelles principales du rituximab: liant cible et l'induction de cytotoxicité dépendante du complément (CDC). Les méthodes ont été utilisées pour une comparaison côte-à-côte entre le rituximab de référence et un rituximab biosimilaire. Ces tests peuvent être utilisés pendant le développement biosimilaire ou comme un contrôle de qualité dans leur production.
Abstract
des anticorps monoclonaux thérapeutiques (mAb) sont pertinentes pour le traitement de différentes pathologies, y compris les cancers. Le développement d'anticorps monoclonaux biosimilaires par les entreprises pharmaceutiques est une opportunité de marché, mais il est aussi une stratégie pour accroître l'accès aux médicaments et de réduire les coûts associés à la thérapie. Les protocoles détaillés ici décrivent l'évaluation de la liaison cible et induction CDC par rituximab dans les cellules Daudi. Ces deux fonctions nécessitent différentes régions structurelles de l'anticorps et sont pertinents à l'effet clinique induite par le rituximab. Les protocoles permettent la comparaison côte à côte d'un rituximab de référence et un biosimilaire rituximab commercialisé. Les produits évalués ont montré des différences à la fois dans la liaison cible et l'induction CDC, ce qui suggère qu'il existe des différences physico-chimiques sous-jacentes et en soulignant la nécessité d'analyser l'impact de ces différences dans le cadre clinique. Les méthodes signalées constituent ici simples et peu coûteuses in vitro </ Em> modèles pour l'évaluation de l'activité des biosimilaires rituximab. Ainsi, ils peuvent être utiles au cours du développement de biosimilaires, ainsi que pour le contrôle de la qualité dans la production biosimilaire. En outre, les méthodes présentées peuvent être extrapolés à d'autres anticorps monoclonaux thérapeutiques.
Introduction
Les anticorps thérapeutiques sont des anticorps monoclonaux recombinants (mAbs) développés pour le traitement de différentes pathologies, y compris les cancers, les maladies auto-immunes et chroniques, les troubles neurologiques et autres 1 . À l'heure actuelle, la FDA a accordé l'approbation à plus de 40 hypothèses thérapeutiques, et d'autres devraient atteindre le marché au cours des années suivantes.
Le Rituximab est un anticorps IgG1 monoclonal chimère hautement affinité approuvé pour le traitement du lymphome non Hodgkinien (LNH) CD20 + , NHL folliculaire CD20 + , leucémie lymphocytaire chronique et arthrite rhumatoïde 2 , 3 . La reconnaissance du CD20, qui est surexprimé dans les cellules B, par rituximab induit l'apoptose; Activation du complément; Et la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) 3 . Les brevets de ce médicament ont expiré en Europe et aux États-Unis en 2013 et 2016, respectivement. Ainsi, les entreprises pharmaceutiques du monde entier développent des biosimilaires de rituximab. Comme dans tout autre médicament destiné à la consommation humaine, les biosimilaires doivent être approuvés par les organismes de réglementation. Les directives internationales indiquent que, pour les anticorps antirétroviraux, la biosimilarité devrait être démontrée en comparant les caractéristiques physico-chimiques, la pharmacocinétique, l'efficacité et la sécurité des produits nouveaux et de référence 4 .
En conséquence, les méthodologies utilisées dans ces comparaisons doivent évaluer les caractéristiques structurelles et fonctionnelles des mAbs, en particulier ceux ayant une pertinence clinique. À cette fin, les essais in vitro présentent plusieurs avantages par rapport aux expériences in vivo (revues dans Chapman et al. ) 5 : i) les études in vitro sont plus sensibles aux différences entre le biosimilaire proposé et le produit de référence; Ii) des études in vivo doivent être effectuées dans des espèces pertinentes, qui, pour de nombreux mAbs, sontles primates non humains; et iii) étant donné que le mécanisme d'action, la toxicologie préclinique et les effets cliniques du produit de référence sont bien connues, dans des études in vivo avec biosimilaires ne peuvent pas fournir des informations utiles supplémentaires. En conséquence, l'orientation de l' Union européenne pour les biosimilaires permet aux candidats d'entrer dans des essais cliniques basés sur des données robustes in vitro seuls 6.
Nous présentons ici deux tests rapides, économiques et simples qui évaluent l'activité biologique du rituximab en utilisant CD20 + cellules en culture. Ces tests peuvent être inclus dans le cadre de l'exercice de comparabilité pour les candidats biosimilaires rituximab.
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Protocol
1. Evaluation de la liaison cible par cytométrie de flux
- Préparation de matériaux biologiques et de réactifs
- Faire 500 ml de milieu de culture RPMI supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin inactivé par la chaleur (H-IFBS).
- Culture des cellules Daudi lymphome de Burkitt (Daudi) et Daudi cellules GFP + à l' aide de RPMI et 2 flacons de culture de 75 cm. Maintenir les cultures à 37 ° C dans 5% de CO 2 atmosphère humidifiée jusqu'à ce qu'ils atteignent 6 - 9 x 10 5 cellules / mL.
- Ajouter 50 ml de tampon de coloration par dilution de 1/100 H-IFBS dans du PBS; ce tampon est stable à 2 - 8 ° C pendant au moins un mois.
- Préparer les solutions de test pour la référence et les mAb biosimilaires. Faire dix 1: 2 dilutions en série (500 ul chacun) dans du tampon de coloration, à partir de 5 ug / mL.
- Utiliser un tampon pour diluer la coloration d'IgG humaine (témoin d'isotype) à 5 ug / mL et PE-Cy5 de souris anti-IgG humaine (anticorps secondaire) à la conQue suggère le fabricant.
- Préparer 4% de paraformaldéhyde dans du PBS (tampon de fixation).
- Reliure cible
- Recueillir les suspensions de cellules Daudi et Daudi GFP + dans les flacons de culture de 75 cm 2 et les transférer dans un tube centrifuge de 15 ml. Centrifuger à 400 xg pendant 5 min.
- Lavez les cellules en ajoutant 5 ml de PBS et en centrifugant la suspension cellulaire à 400 xg pendant 5 min.
- Remettre en suspension les cellules dans le PBS et effectuer un bilan cellulaire et une analyse de viabilité avec du bleu trypan. Utilisez des cultures avec des niveaux de viabilité cellulaire ≥ 95% pour l'analyse.
- Diluer la suspension cellulaire à 4 x 10 6 cellules / mL avec un tampon de coloration à froid.
- Dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml, ajouter 50 μL de suspension cellulaire à 100 μL des différentes concentrations d'essai de la référence ou des mAbs biosimilaires. Inclure des répliques pour chaque condition expérimentale.
- Préparez des tubes supplémentaires pourContrôle de l'isotype (IgG1 humain au lieu de rituximab) et contrôle négatif (anticorps secondaire sans anticorps primaire).
- Incuber à 4 ° C pendant 20 à 30 min.
- Lavez les cellules en ajoutant 1 mL de PBS et en centrifugant la suspension cellulaire à 400 xg pendant 5 min à 10 ° C. Jeter le surnageant.
- Suspendre les cellules dans 100 μL de l'anticorps secondaire et incuber pendant 20 à 30 minutes à 4 ° C, protégé de la lumière.
- Lavez les cellules deux fois avec du PBS et suspendez-les dans 200 μL de tampon de fixation.
- Analyser les cellules sur un cytomètre de flux.
NOTE: Le signal reste stable pendant plusieurs jours si les échantillons sont stockés à 4 ° C et protégés de la lumière.
- L'acquisition des données
- Ouvrez deux tableaux de points sur une feuille de calcul du logiciel d'exploitation du cytomètre de flux. Réglez le FSC-A contre le FSC-H dans le premier et le FSC-A contre le SSA-A dans le second. Ouvrez un histogramme pour le canal PE-Cy5.
- Dans la trame FSC-A versus FSC-H, faites une porte (R1) en sélectionnant des événements de sondage ( Figure 1A ).
- Définissez la population R1 dans le tracé de points FSC-A versus SSA-A, puis créez une nouvelle porte (R2) en sélectionnant des cellules cibles ( Figure 1B ). Réglez la population R2 dans l'histogramme d'intensité PE-Cy5 pour voir la répartition de la fréquence des cellules.
- Réglez la limite d'intensité de fluorescence inférieure (FI) pour le canal PE-Cy5 en utilisant le contrôle négatif et isotype ( Figure 1C ).
- Acquérir 10 000 événements dans R2 à partir de l'échantillon avec la concentration plus élevée du produit de référence. FI de cet échantillon devrait être le plus élevé attendu ( figure 1C ).
- Acquérir le reste des échantillons.
- Pour chaque échantillon, obtenir l'intensité médiane de fluorescence (IMF) dans le canal PE-Cy5.
- Pour les échantillons avec le mAb de référence ou biosimilaire, calculez la différence entre l'IMF d'échantillon et celle de la commande isotype (ΔMFI).
2. Évaluation de la CDC
- Préparation de matériaux biologiques et de réactifs
- Préparer des cellules du milieu de culture cellulaire et de culture Daudi et Daudi GFP + comme décrit ci - dessus (étapes 1.1.1 - 1.1.2).
NOTE: En outre, le test CDC exige RPMI sans sérum. - Diluer complément normal de sérum humain (LHNC) 1: 2 avec du RPMI sans sérum. Préparer 2,5 mL.
- Préparer 1 ml d'inactivé par la chaleur (30 min / 56 ° C) NHSC dilué à 1: 2 avec du milieu RPMI.
- Préparer des ensembles de solutions de tests pour la référence et les mAb biosimilaires dans RPMI sans sérum. Faire dix dilutions (200 ul chacun) de 1 à 0,025 ug / mL.
- Préparer des cellules du milieu de culture cellulaire et de culture Daudi et Daudi GFP + comme décrit ci - dessus (étapes 1.1.1 - 1.1.2).
- essai CDC
- Recueillir les cellules Daudi et Daudi GFP + à partir des cultures et de quantifier la viabilité cellulaire (voir les étapes 1.2.1 - 1.2.3).
- Préparer une suspension de cellules avec 4 x 10 5 cellules / ml dans du RPMI sans sérum.
- Ajouter50 μL de suspension de cellules à 50 μL de chaque concentration de test de référence ou de mAb biosimilaire dans des microplaques coniques (V) -bottom à 96 puits. Inclure des répliques pour chaque condition expérimentale.
- Préparer des puits supplémentaires pour le contrôle négatif ( c.-à-d. Sans mAb), le contrôle de la mort basale ( c.- à-d. Le NHSC inactivé par la chaleur en présence d'un mAb) et le contrôle positif de coloration ( c'est-à-dire les cellules exposées à 50 μL de 70% d'EtOH).
- Incuber les cellules pendant 20 à 30 minutes à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO 2 .
- Ajouter 50 μL de NHSC (dilué 1: 2) à chaque puits et incuber les cellules opsonisées pendant 2,5 h à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO 2 . Utiliser un NHSC inactivé par la chaleur dans les puits de contrôle de la mort basale.
- Centrifuger à 400 xg pendant 5 min à 10 ° C. Jeter le surnageant.
- Laver les cellules en ajoutant 150 μL de PBS et en centrifugant la suspension cellulaire pendant 5 min à 400 xg et 10 ° C. DiScard le surnageant.
- Colorer les échantillons avec 7-aminoactinomycine (7-AAD), comme décrit précédemment 7, 8.
- Analyser les cellules sur un cytomètre de flux le même jour.
- L'acquisition des données
- Ouvrez deux points-parcelles sur une feuille de calcul du flux cytomètre logiciel d'exploitation. Définir ces parcelles comme dans les étapes 1.3.1 - 1.3.3 (Figure 2A-B). Créer une troisième parcelle qui est un point-parcelle pour GFP contre 7 DAA sur la population R2.
- Définir les limites de FI adéquates en utilisant les cellules Daudi, les cellules Daudi GFP +, et la mort contrôle positif (figure 2C).
- Pour chaque échantillon, mesurer le pourcentage de 7 DAA + cellules cibles. Acquérir au moins 5000 événements de R2.
- Calculer la cytotoxicité spécifique induite par mAb en soustrayant le pourcentage de 7 DAA + dans le contrôle de la mort de base du pourcentage trouvé dans les échantillons avec différentsLes concentrations ent de mAbs (Figure 2D).
3. Analyse biosimilarité
- Entrez les valeurs de concentration et de réaction dans un logiciel graphique.
- Générer des graphiques et calculer des régressions non-linéaires avec les considérations suivantes: i) utiliser le log-transformation de la concentration du mAb comme « X »; ii) utiliser le modèle mathématique pente variable (Y = réponse minimum + (réponse maximale - réponse minimum) / 1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * pente de Hill)); et iii) contraindre les valeurs inférieures à zéro, étant donné que la réponse de base a été soustraite.
NOTE: Les courbes avec une forme sigmoïde symétrique sont attendus. - Comparer les ajustements non-linéaires avec un ajustement global à l'aide d'un test F (de nombreux logiciels graphiques incluent cette fonctionnalité).
NOTE: Ces tests établissent que l'hypothèse nulle que la réponse maximale, logEC 50, et la pente Hill sont les mêmes pour les deux ensembles de données, qui correspond à laQuestion biologique destinée à être abordée.
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Representative Results
En utilisant les protocoles décrits ci-dessus, la cible de liaison et l'induction CDC du rituximab de référence ont été comparés en parallèle avec celles d'un biosimilaire rituximab produit et disponible dans le commerce en Asie.
Dans les cellules de Daudi, les deux mAb CD20 liés d'une manière dépendante de la concentration (Figure 1D). Régressions non linéaires des données de liaison affichent un R 2 de 0,978 et 0,848 pour la référence et le rituximab biosimilar, respectivement (Figure 1E). L'analyse statistique des courbes concentration-réponse a montré qu'elles, et par conséquent les paramètres pharmacodynamiques calculés d'eux, sont significativement différentes entre les mAb (p <0,0001). La réponse maximale pour le biosimilar était 2,16 fois plus faible que celle du produit de référence. Ces résultats suggèrent que les deux anticorps monoclonaux évalués ont des capacités différentes pour lier CD20 exprimé sur le moiMécanisme des cellules leucémiques.
L'induction des CDC a également été comparée aux deux mAbs. Les produits de référence et biosimilaires ont stimulé la CDC dans les cellules Daudi de manière dépendant de la concentration ( figure 2E ). Fait important, les concentrations auxquelles les mAbs induisent des CDC étaient différentes de celles requises pour la liaison cible. Les régressions non linéaires des données CDC ont montré r 2 > 0,980 pour les deux produits. La comparaison statistique des courbes concentration-réponse indiquait qu'elles étaient significativement différentes (P <0,01), rendant le Biosimilar moins puissant. Ces données indiquent que la capacité d'induire des CDC est différente pour les mAbs analysés.
Figure 1. Liaison visuelle in vitro des mAbs thérapeutiques anti-CD20. Les cellules Daudi GFP + ont été exposées à différentesLes concentrations ent des mAbs (4,8 ng / ml à 5 pg / ml) et ensuite colorées avec un anticorps secondaire anti-humain PE-Cy5-conjugué. L' intensité de fluorescence (FI) a été mesurée par cytométrie en flux sur des événements uniques (A), dont la taille et la granularité correspondant à celles des cellules Daudi (B). Cellules non colorées (gris clair), contrôles isotypiques (gris foncé), et 5 pg / ml du rituximab de référence (bleu) ont été utilisées pour définir les limites de FI (C). Les deux mAb liés évalués cellules Daudi d'une manière dépendante de la concentration (D). Réponses (ΔMFI; voir texte) ont été utilisés pour générer des courbes de concentration-réponse de référence (bleu) ou biosimilar (noir) rituximab (E). La comparaison statistique des régressions non linéaires a montré des différences entre les mAbs (P <0,0001, test exact de Fisher). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une versi plus grandessur ce chiffre.
Figure 2. CDC par induction anti-CD20 thérapeutique des anticorps monoclonaux. Cellules Daudi GFP + opsonisées avec différentes concentrations de mAb ont été exposées au complément humain. La mort cellulaire a été évaluée par coloration au 7-AAD et l'analyse par cytométrie de flux de l' intensité de fluorescence (FI) sur des événements uniques (A), dont la taille et la granularité correspondant aux cellules Daudi (B). Unstained GFP (noir) et les cellules GFP + (vert) et les cellules tuées éthanol (rouge) ont été inclus comme témoins (C). Quantification des 7-AAD + cellules dans le contrôle basal-mort (gris) et des échantillons de rituximab (bleu) autorisées pour le calcul de la cytotoxicité induite par le mAb (D). Courbes concentration-réponse obtenues pour référence (bleu) ou biosimilar (noir) rituximab (E). La comparaison statistique des régressions non linéaires a montré des différences entre les réponses induites par les deux mAbs (P <0,01; test exact de Fisher). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau 1. Anticorps monoclonaux approuvés pour une utilisation thérapeutique, avec des cellules cibles pour le dosage CDC. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'expiration du brevet d'un mAb thérapeutique favorise le développement de biosimilaires. Ainsi, il y a un besoin de méthodes simples qui permettent d'identifier les différences dans les activités cliniques pertinentes de ces produits. Les cellules CD20 + cultivées ont été utilisées pour l'évaluation de deux caractéristiques fonctionnelles clés du rituximab: cible de liaison et l' induction CDC. L'ancienne activité nécessite la reconnaissance de CD20 par la région Fab de mAb, alors que celui - ci dépend principalement de l'interaction de la région Fc avec son complément 9. Par conséquent, ces tests offrent un moyen pour relier les caractéristiques structurelles et fonctionnelles des mAbs.
La cible de liaison d'anticorps monoclonaux thérapeutiques est habituellement évaluée par titration calorimétrique isotherme (ITC), résonance plasmonique de surface (SPR), ou biocouche interférométrie 10, 11, 12. Ces tests permettent afCalcul de finitude, mais ils nécessitent un équipement et une formation spécialisés. Le protocole décrit ici évalue la liaison cible dans une comparaison côte à côte pour identifier les différences entre les produits, même sans données d'affinité. La méthode est simple et utilise un contexte cellulaire pertinent pour l'évaluation de l'activité. D'autre part, l'induction de CDC par rituximab peut être évaluée par la mesure de l'ATP 13 , la quantification des essais de lactate déshydrogénase libérés (LDH) 14 ou alamarBlue 15 et MTT 16 . La méthode rapportée ici, utilisant la coloration 7-AAD, a un faible fond et peut être combinée avec d'autres taches pour l'analyse par cytométrie à flux multiparamétrique.
Dans les expériences représentatives présentées, les courbes dose-réponse ont adapté le modèle logistique à quatre paramètres, permettant le calcul de la CE 50 , de la pente de la colline et de la réponse maximale. Notamment, les gammes de concentrationLes employés utilisés pour générer de telles courbes étaient différents pour chaque essai, soulignant l'importance d'analyser et de définir des gammes adéquates dans les expériences préliminaires. Les changements dans les réactifs clés, tels que les fluorochromes et les compléments, ou l'utilisation d'une lignée cellulaire avec un niveau cible différent, peuvent déplacer la gamme efficace de concentrations.
L'analyse statistique a identifié les différences entre un lot d'un rituximab biosimilaire disponible dans le commerce en Asie et le produit de référence, à la fois dans la liaison cible et dans l'induction des CDC. Il est important de considérer que même lorsque le processus de fabrication des mAbs est étroitement contrôlé, chaque attribut du produit de référence affiche une gamme. En conséquence, le nombre minimum de lots qui devraient être testés lors de l'évaluation d'un biothérapeutique similaire dépend de l'étendue de la variabilité du produit de référence et de la variabilité du dosage 4. Ainsi, ces protocoles doivent être appliqués pour différerNt lots lors de l'évaluation de la comparabilité.
Les méthodes présentées peuvent être extrapolées à d'autres paires de mA-cibles thérapeutiques, pourvu que les cellules exprimant l'antigène soient accessibles. Le tableau 1 énumère les mAb thérapeutiques autres que le rituximab pour lequel l'induction des CDC est pertinente pour l'efficacité clinique et compile l'information sur les modèles cellulaires précédemment rapportés pour chaque mAb.
En conclusion, les deux essais décrits ici sont simples, rapides et peu coûteux, ce qui permet leur exécution dans la plupart des laboratoires. Les méthodes peuvent être utilisées pendant les premières étapes du développement biosimilaire ou après l'approbation réglementaire pour la comparaison lot-à-lot pendant la production.
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Disclosures
N. Salinas-Jazmín, E. González-González, et SM Pérez-Tapia sont des employés de UDIBI, qui effectue des études de biosimilarité pour plusieurs sociétés pharmaceutiques.
Acknowledgments
Les auteurs n'ont aucune reconnaissance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
References
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