Summary
Denne protokol beskriver in vitro sammenligning af to centrale funktionelle egenskaber af rituximab: targetbindende og komplement-afhængig cytotoksicitet (CDC) induktion. Metoderne blev anvendt til en side-til-side sammenligning mellem henvisning rituximab og en rituximab biosimilært. Disse assays kan anvendes under biosimilar udvikling eller som en kvalitetskontrol i deres produktion.
Abstract
Terapeutiske monoklonale antistoffer (mAb'er) er relevante for behandlingen af forskellige patologier, herunder cancere. Udviklingen af biosimilære monoklonale antistoffer af farmaceutiske virksomheder er en mulighed på markedet, men det er også en strategi for at øge narkotika tilgængelighed og reducere terapi-associerede omkostninger. Protokollerne beskrevet her beskriver evalueringen af målbindingsmedlemmet og CDC induktion ved rituximab i Daudi-celler. Disse to funktioner kræver forskellige strukturelle regioner af antistoffet og er relevante for den kliniske virkning induceret af rituximab. Protokollerne tillader side-til-side sammenligning af en reference rituximab og et markedsført rituximab biosimilært. De evaluerede produkter viste forskelle i såvel targetbindende og CDC induktion, hvilket antyder, at der er underliggende fysisk-kemiske forskelle og understreger behovet for at analysere virkningerne af disse forskelle i kliniske omgivelser. Metoderne rapporteret her udgør enkel og billig in vitro </ Em> modeller til evaluering af aktiviteten af rituximabbiosimilarer. Således kan de være nyttige under biosimilar udvikling, såvel som for kvalitetskontrol i biosimilar produktion. Desuden kan de fremlagte metoder ekstrapoleres til andre terapeutiske mAb'er.
Introduction
Terapeutiske antistoffer er rekombinante monoklonale antistoffer (mAbs) udviklet til behandling af forskellige patologier, herunder kræftformer, autoimmune og kroniske sygdomme, neurologiske lidelser og andre 1 . FDA har i øjeblikket godkendt mere end 40 terapeutiske mAbs, og flere forventes at nå markedet i de følgende år.
Rituximab er et high-affinitet kimært monoklonalt IgG1 antistof godkendt til behandling af CD20 + B-celle ikke-Hodgkins lymfom (NHL), CD20 + follikulært NHL, kronisk lymfocytisk leukæmi og reumatoid arthritis 2 , 3 . Anerkendelsen af CD20, som er overudtrykt i B-celler, ved rituximab inducerer apoptose; Komplement aktivering; Og antistofafhængig celle-medieret cytotoksicitet (ADCC) 3 . Patenterne af dette lægemiddel udløb i Europa og i USA i 2013 og 2016, henholdsvis. Således udvikler farmaceutiske virksomheder verden over rituximabbiosimilarer. Som i ethvert andet stof til konsum kræver biosimilarer godkendelse fra reguleringsorganer. Internationale retningslinjer tyder på, at biosimilaritet for mAbs skal påvises ved at sammenligne de fysisk-kemiske egenskaber, farmakokinetik, effektivitet og sikkerhed for de nye og referenceprodukter 4 .
Følgelig må de metoder, der anvendes i sådanne sammenligninger, vurdere de strukturelle og funktionelle egenskaber af mAb'erne, især dem med klinisk relevans. Til dette formål viser in vitro- analyser flere fordele i forhold til in vivo eksperimenter (gennemgået i Chapman et al. ) 5 : i) in vitro- undersøgelser er mere følsomme for forskelle mellem de foreslåede biosimilar og referenceproduktet; Ii) in vivo undersøgelser skal udføres i relevante arter, som for mange mAbs erprimater; og iii), da virkningsmekanismen, den prækliniske toksikologi, og de kliniske virkninger af referenceproduktet er velkendte, in vivo studier med biosimilars måske ikke giver yderligere nyttige oplysninger. I overensstemmelse hermed Den Europæiske Unions Vejledning til biosimilars giver kandidater til at indtaste kliniske forsøg baseret på solide in vitro-data alene 6.
Her præsenterer vi to hurtige, økonomiske og enkle analyser, der evaluerer den biologiske aktivitet af rituximab hjælp CD20 + dyrkede celler. Disse assays kan indgå som en del af sammenligneligheden øvelse for rituximab bioækvivalente kandidater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Evaluering af målbindingen ved flowcytometri
- Fremstilling af biologiske materialer og reagenser
- Lav 500 ml RPMI dyrkningsmedium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (H-IFBS).
- Kultur Daudi Burkitts lymfom (Daudi) celler og Daudi GFP + -celler under anvendelse af RPMI og 75 cm2 kulturflasker. Oprethold kulturerne ved 37 ° C i en 5% CO 2 fugtet atmosfære indtil de når 6 - 9 x 10 5 celler / ml.
- Lav 50 ml farvningsbuffer ved at fortynde 1/100 H-IFBS i PBS; Denne buffer er stabil ved 2-8 ° C i mindst en måned.
- Forbered testopløsningerne til reference og biosimilar mAbs. Lav ti 1: 2 seriefortyndinger (500 μl hver) i farvningsbuffer, startende fra 5 μg / ml.
- Brug farvningsbuffer til fortyndet human IgG (isotype kontrol) til 5 μg / ml og PE-Cy5 mus anti-humant IgG (sekundært antistof) til concentrering foreslået af producenten.
- Fremstilling af 4% paraformaldehyd i PBS (fiksering buffer).
- Target binding
- Indsamle Daudi og Daudi GFP + cellesuspensioner fra de 75 cm2 dyrkningskolber og overføre dem til en 15-ml centrifugerør. Centrifugere ved 400 xg i 5 minutter.
- Vask cellerne ved tilsætning af 5 ml PBS og centrifugere cellesuspensionen ved 400 xg i 5 minutter.
- Resuspendere cellerne i PBS og udføre en celletælling og levedygtighed analyse med trypanblåt. Brug kulturer med cellelevedygtighed niveauer ≥ 95% til analysen.
- Fortynd cellesuspensionen til 4 x 10 6 celler / ml med kold farvningsbuffer.
- I 1,5 ml-mikrocentrifugerør, tilsættes 50 pi af cellesuspensionen til 100 pi de forskellige test koncentrationer af reference eller bioækvivalente mAb'er. Omfatte gentagelser for hver eksperimentel betingelse.
- Forbered yderligere rør tilisotypekontrol (humant IgG1 stedet for rituximab) og negativ kontrol (sekundært antistof uden primært antistof).
- Inkuber ved 4 ° C i 20 - 30 min.
- Vask cellerne ved at tilsætte 1 ml PBS og centrifugere cellesuspensionen ved 400 xg i 5 minutter ved 10 ° C. Supernatanten kasseres.
- Suspendere cellerne i 100 pi af det sekundære antistof og inkuberes i 20 - 30 minutter ved 4 ° C, beskyttet mod lys.
- Vask cellerne to gange med PBS og suspendere dem i 200 pi af fiksering buffer.
- Analyser af cellerne på et flowcytometer.
BEMÆRK: Signalet forbliver stabil i flere dage, hvis de opbevares ved 4 ° C og beskyttet mod lys.
- Dataindsamling
- Åbne to dot-plots på et regneark af flowcytometeret drift software. Indstille FSC-A versus FSC-H i den første og FSC-A versus SSA-A i det andet. Åbn et histogram for PE-Cy5 kanal.
- I FSC-A versus FSC-H plot, lave en gate (R1) selektion singlet begivenheder (figur 1A).
- Indstil R1 befolkning i FSC-A versus SSA-A dot-plot og derefter foretage en ny gate (R2) udvælgelse målceller (figur 1B). Indstil R2 populationen i PE-Cy5 intensitet histogram for at se frekvensfordelingen af cellerne.
- Juster lavere fluorescensintensitet (FI) grænse for PE-Cy5 kanal ved brug af negativ og isotypekontrol (figur 1C).
- Erhverve 10.000 begivenheder inden R2 fra prøven med den højere koncentration af referenceproduktet. FI af denne prøve bør være den højeste forventede (figur 1C).
- Erhverve resten af prøverne.
- For hver prøve, får den mediane fluorescensintensitet (MFI) i PE-Cy5 kanal.
- For prøver med reference- eller biosimilært mAb beregnes differensen mellem prøve MFI og den af isotypekontrol (ΔMFI).
2. Vurdering af CDC
- Fremstilling af biologiske materialer og reagenser
- Forbered cellekulturmedium og kultur Daudi og Daudi GFP + -celler som beskrevet ovenfor (trin 1.1.1 - 1.1.2).
BEMÆRK: Desuden kræver CDC-analysen serumfri RPMI. - Fortynd normal human serum-komplement (NHSC) 1: 2 med serumfri RPMI. Tilbered 2,5 ml.
- Forbered 1 ml varmeinaktiveret (30 min / 56 ° C) NHSC fortyndet 1: 2 med RPMI.
- Forbered sæt af testløsninger til reference- og biosimilar mAbs i serumfri RPMI. Lav ti fortyndinger (200 μl hver) fra 1 til 0,025 μg / ml.
- Forbered cellekulturmedium og kultur Daudi og Daudi GFP + -celler som beskrevet ovenfor (trin 1.1.1 - 1.1.2).
- CDC-assay
- Saml Daudi- og Daudi GFP + -cellerne fra kulturerne og kvantificer cellelevedygtigheden (se trin 1.2.1 - 1.2.3).
- Forbered en celle suspension med 4 x 10 5 celler / ml i serumfri RPMI.
- Tilføje50 pi cellesuspension til 50 pi af hver reference eller biosimilært mAb testkoncentration i 96-brønds konisk (V) Bunden mikroplader. Omfatte gentagelser for hver eksperimentel betingelse.
- Forberede yderligere brønde for den negative kontrol (dvs. uden mAb), basal død kontrol (dvs. varmeinaktiveret NHSC i nærvær af mAb), og farvning positiv kontrol (dvs. celler udsat for 50 pi 70% EtOH).
- Inkubér cellerne i 20 - 30 minutter ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet atmosfære.
- Tilsættes 50 pi NHSC (fortyndet 1: 2) til hver brønd og inkuber opsoniserede celler i 2,5 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 fugtig atmosfære. Bruge varmeinaktiveret NHSC i de basale død kontrolbrønde.
- Centrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 10 ° C. Supernatanten kasseres.
- Vask cellerne ved tilsætning af 150 pi PBS og centrifugere cellesuspensionen i 5 minutter ved 400 xg og 10 ° C. DiScard supernatanten.
- Farv prøverne med 7-aminoactinomycin (7-AAD) som tidligere beskrevet 7 , 8 .
- Analyser cellerne på et flowcytometer på samme dag.
- Dataindsamling
- Åbn to punkter i et arbejdsark for flowcytometerets driftssoftware. Indstil disse punkter som i trin 1.3.1 - 1.3.3 ( Figur 2A-B ). Opret en tredje plot, der er en prik-plot for GFP versus 7-AAD på R2-befolkningen.
- Definer de passende FI grænser ved hjælp af Daudi celler, Daudi GFP + celler og død positiv kontrol ( Figur 2C ).
- For hver prøve måles procentdelen af 7-AAD + målceller. Erhverv mindst 5.000 begivenheder fra R2.
- Beregn den specifikke mAb-inducerede cytotoksicitet ved at subtrahere procentdelen af 7-AAD + i den basale dødskontrol fra procentdelen fundet i prøver med forskelligeent koncentrationer af mAb'er (figur 2D).
3. Biosimilarity Analyse
- Indtast koncentrations- og respons værdier i et graftegning software.
- Generere grafer og beregne ikke-lineære regressioner med følgende overvejelser: i) anvender log-transformation af mAb-koncentration som "X"; ii) anvender variabel hældning matematiske model (Y = minimal reaktion + (maksimal reaktion - minimum respons) / 1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * Hill hældning)); og iii) begrænser de nederste værdier til nul, eftersom den basale respons er blevet fratrukket.
BEMÆRK: Kurver med en symmetrisk formet form forventes. - Undersøg både ikke-lineære passer med en global pasform ved hjælp af en F-test (mange graftegning softwareprogrammer omfatter denne funktion).
BEMÆRK: Sådanne forsøg etablere som nulhypotesen, at det maksimale respons, logEC 50, og Hill hældningen er de samme for de to datasæt, som matcherbiologisk spørgsmål beregnet til at blive behandlet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under anvendelse af de ovenfor beskrevne protokoller målbinding og CDC induktion af henvisning rituximab blev sammenlignet parallelt med dem for et biosimilært rituximab fremstillet og kommercielt tilgængelige i Asien.
I Daudi-celler, begge mAb'er bundet CD20 i en koncentrationsafhængig måde (figur 1D). Ikke-lineære regressionsanalyse af bindingsdata vist en r2 af 0,978 og 0,848 for reference og biosimilære rituximab, (figur 1E). Statistisk analyse af koncentration-respons kurver viste, at de, og derfor farmakodynamiske parametre beregnes ud fra dem, er signifikant forskellig mellem mAb'er (P <0,0001). Det maksimale respons for biosimilære var 2,16 gange lavere end den for referenceproduktet. Disse resultater tyder på, at de to evaluerede mAbs har forskellige kapaciteter til at binde CD20 udtrykt på migmbrane af leukæmiceller.
CDC induktion var også sammenlignet med de to mAb'er. Reference- og kopiprodukter stimulerede CDC i Daudi-celler i en koncentrationsafhængig måde (figur 2E). Vigtigere, koncentrationer, hvor mAb'erne inducerede CDC var anderledes end dem, der kræves for target binding. Ikke-lineære regressionsanalyse af CDC data viste r2> 0.980 for begge produkter. Den statistiske sammenligning af koncentration-respons kurver fremgår, at de signifikant forskellige (P <0,01), hvilket gør det biosimilære mindre potent. Disse data indikerer, at evnen til at inducere CDC er forskellig for de analyserede mAb'er.
Figur 1. In vitro Target-binding af anti-CD20 Therapeutic mAb'er. Daudi GFP + -celler blev eksponeret for forskelligent koncentrationer af mAb'er (4,8 ng / ml til 5 ug / ml) og derefter farvet med PE-Cy5-konjugeret anti-humant sekundært antistof. Fluorescensintensitet (FI) blev målt ved flowcytometri på enkeltstående begivenheder (A), som i størrelse og granularitet svarende til dem af de Daudi-celler (B). Ufarvede celler (lysegrå), isotypekontroller (mørkegrå), og 5 ug / ml af referencen rituximab (blue) blev anvendt til at indstille FI grænser (C). Begge evaluerede mAb'er bundet Daudi-celler i en koncentrationsafhængig måde (D). Responser (ΔMFI; se tekst) blev anvendt til frembringelse koncentrationssvarkurver til reference (blå) eller biosimilært (sort) rituximab (E). Statistisk sammenligning af de ikke-lineære regressioner viste forskelle mellem mAb'er (P <0,0001, Fisher eksakt test). Klik her for at se et større versiPå denne figur.
Figur 2. CDC-induktion ved anti-CD20-terapeutiske mAbs. Daudi GFP + -celler opsoniseret med forskellige koncentrationer af mAbs blev udsat for det humane komplement. Celledød blev evalueret ved 7-AAD-farvning og flowcytometrisk analyse af fluorescensintensitet (FI) på enkelthændelser (A) med størrelse og granularitet svarende til Daudi-cellerne (B) . Ufarvede GFP- (sort) og GFP + (grønne) celler og ethanol-dræbte celler (rød) blev inkluderet som kontroller (C) . Kvantificering af 7-AAD + -cellerne i basal-dødskontrollen (grå) og rituximabprøverne (blå) tilladt til beregning af den mAb-inducerede cytotoksicitet (D) . Koncentrationsresponskurver opnået til reference (blå) eller biosimilar (sort) rituximab (E). Statistisk sammenligning af de ikke-lineære regressioner viste forskelle mellem responserne induceret af de to mAb'er (P <0,01; Fisher-eksakte test). Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1. Monoklonale antistoffer godkendt til terapeutisk anvendelse med målceller til CDC-analysen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Patentudløbet af et terapeutisk mAb fremmer udviklingen af biosimilars. Således er der et behov for enkle metoder, der kan identificere forskelle i klinisk relevante aktiviteter af disse produkter. CD20 + dyrkede celler blev anvendt til evaluering af to vigtige funktionelle egenskaber rituximab: targetbindende og CDC induktion. Den tidligere aktivitet kræver anerkendelse af CD20 af Fab-området af mAb'et, mens sidstnævnte afhænger hovedsageligt af interaktionen af Fc-regionen med dets komplement 9. Derfor er disse assays tilvejebringer en måde at forbinde de strukturelle og funktionelle karakteristika af mAb'er.
Målbindingsmedlemmet af terapeutiske mAb'er sædvanligvis evalueret ved isotermiske titrering kalorimetri (ITC), overfladeplasmonresonans (SPR) eller biolayer interferometri 10, 11, 12. Disse assays tillader ofFinity beregning, men de kræver specialiseret udstyr og uddannelse. Protokollen beskrevet her evaluerer targetbindende i en side-til-side sammenligning at identificere forskelle mellem produkterne, selv uden affinitet data. Metoden er enkel og beskæftiger en relevant cellulær kontekst for aktivitet vurdering. På den anden side, kan CDC induktion ved rituximab evalueres af ATP-måling 13, kvantificering af frigivet lactat dehydrogenase (LDH) 14 eller alamarBlue 15, og MTT-assays 16. Fremgangsmåden angivet her ved anvendelse af 7-AAD-farvning, har en lav baggrund og kan kombineres med andre pletter for multiparametric flowcytometrisk analyse.
I de repræsentative præsenterede forsøg, dosisresponskurver monteret fire parametre logistisk model, der giver mulighed for beregning af EC50, Hill hældning, og maksimale respons. Især, intervallerne for Concentrations anvendes til at generere sådanne kurver var forskellige for hvert assay, hvori betydningen af at analysere og definere passende serier i indledende forsøg. Ændringer i vigtige reagenser, såsom fluorochromer og komplementer eller anvendelsen af en cellelinie med et andet målniveau, kan forskyde det effektive område af koncentrationer.
Statistisk analyse identificerede forskelle mellem en batch af et biosimilært rituximab kommercielt tilgængelig i Asien og referenceproduktet, både i targetbindende og i CDC induktion. Det er vigtigt at overveje, at selv når fremstillingsprocessen for mAb'erne er tæt kontrolleret, hver attribut af referenceproduktet viser en række. Følgelig det mindste antal batcher, der skal afprøves under vurderingen af en lignende bioterapeutisk afhænger af omfanget af variabilitet af referenceproduktet og på assayvariabiliteten 4 .Thus, skal anvendes disse protokoller til Forskelnt partier i løbet af evalueringen af sammenlignelighed.
De præsenterede fremgangsmåder kan ekstrapoleres til andre par af terapeutiske mAbs-mål, så længe cellerne udtrykker antigenet er tilgængelige. Tabel 1 viser andre end rituximab, hvor CDC induktion er relevant for den kliniske virkning og indeholder en oversigt over de tidligere rapporterede cellulære modeller for hver mAb terapeutiske mAb'er.
Konklusionen er, de to assays beskrevet her, er enkel, hurtig og billig, så at de udføres i de fleste laboratorier. Fremgangsmåderne kan anvendes under tidlige trin i biosimilar udvikling eller efter myndighedsgodkendelse til batch-til-batch sammenligning under produktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
N. Salinas-Jazmín, E. González-González og SM Pérez-Tapia er medarbejdere i UDIBI, som udfører biosimilarity undersøgelser i flere medicinalvirksomheder.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
References
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a Proposed Biosimilar RTXM83 and the Originator Rituximab. Bio Drugs. 30 (3), 225-231 (2016).
- Iwamoto, N., et al. Validated LC/MS Bioanalysis of Rituximab CDR Peptides Using Nano-surface and Molecular-Orientation Limited (nSMOL) Proteolysis. Biol Pharm Bull. 39 (7), 1187-1194 (2016).
- World Health Organization. Guidelines on evaluation of monoclonal antibodies as similar biotherapeutic products (SBPs). , Available from: http://www.who.int/biologicals/expert_committee/mAb_SBP_GL-ECBS_review_adoption-2016.10.26-11.7post_ECBS-Clean_Version.pdf (2016).
- Chapman, K., et al. Waiving in vivo studies for monoclonal antibody biosimilar development: National and global challenges. MAbs. 8 (3), 427-435 (2016).
- EMA, EMEA/CHMP/BMWP/42832/2005 Rev1. Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: non-clinical and clinical issues. , Available from: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/01/WC500180219.pdf (2014).
- Zembruski, N. C., et al. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 429 (1), 79-81 (2012).
- Salinas-Jazmin, N., Hisaki-Itaya, E., Velasco-Velazquez, M. A. A flow cytometry-based assay for the evaluation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) in cancer cells. Methods Mol Biol. 1165, 241-252 (2014).
- Teeling, J. L., et al. The Biological Activity of Human CD20 Monoclonal Antibodies Is Linked to Unique Epitopes on CD20. J Immunol. 177 (1), 362-371 (2006).
- Miranda-Hernandez, M. P., et al. Assessment of physicochemical properties of rituximab related to its immunomodulatory activity. J Immunol Res. 2015, 910763 (2015).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Ylera, F., et al. Off-rate screening for selection of high-affinity anti-drug antibodies. Anal Biochem. 441 (2), 208-213 (2013).
- Broyer, L., Goetsch, L., Broussas, M. Evaluation of complement-dependent cytotoxicity using ATP measurement and C1q/C4b binding. Methods Mol Biol. 988, 319-329 (2013).
- Herbst, R., et al. B-cell depletion in vitro and in vivo with an afucosylated anti-CD19 antibody. J Pharm Exp Ther. 335 (1), 213-222 (2010).
- Lazar, G. A., et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (11), 4005-4010 (2006).
- Winiarska, M., et al. Statins impair antitumor effects of rituximab by inducing conformational changes of CD20. PLoS medicine. 5 (3), e64 (2008).
- Zhou, X., Hu, W., Qin, X. The role of complement in the mechanism of action of rituximab for B-cell lymphoma: implications for therapy. Oncologist. 13 (9), 954-966 (2008).
- Hayashi, K., et al. Gemcitabine enhances rituximab-mediated complement-dependent cytotoxicity to B cell lymphoma by CD20 upregulation. Cancer Sci. 107 (5), 682-689 (2016).
- Mossner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Lapalombella, R., et al. A novel Raji-Burkitt's lymphoma model for preclinical and mechanistic evaluation of CD52-targeted immunotherapeutic agents. Clin Cancer Res. 14 (2), 569-578 (2008).
- Mitoma, H., et al. Mechanisms for cytotoxic effects of anti-tumor necrosis factor agents on transmembrane tumor necrosis factor alpha-expressing cells: comparison among infliximab, etanercept, and adalimumab. Arthritis Rheum. 58 (5), 1248-1257 (2008).
- Kaymakcalan, Z., et al. Comparisons of affinities, avidities, and complement activation of adalimumab, infliximab, and etanercept in binding to soluble and membrane tumor necrosis factor. Clin Immunol. 131 (2), 308-316 (2009).
- Zent, C. S., et al. Direct and complement dependent cytotoxicity in CLL cells from patients with high-risk early-intermediate stage chronic lymphocytic leukemia (CLL) treated with alemtuzumab and rituximab. Leuk Res. 32 (12), 1849-1856 (2008).
- Goswami, M. T., et al. Regulation of complement-dependent cytotoxicity by TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 35 (15), 1888-1898 (2016).
- Wang, A., et al. Induction of anti-EGFR immune response with mimotopes identified from a phage display peptide library by panitumumab. Oncotarget. , (2016).
- Ueda, N., et al. The cytotoxic effects of certolizumab pegol and golimumab mediated by transmembrane tumor necrosis factor alpha. Inflamm Bowel Dis. 19 (6), 1224-1231 (2013).
- Nesbitt, A., et al. Mechanism of action of certolizumab pegol (CDP870): in vitro comparison with other anti-tumor necrosis factor alpha agents. Inflamm Bowel Dis. 13 (11), 1323-1332 (2007).
- Teeling, J. L., et al. Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas. Blood. 104 (6), 1793-1800 (2004).
