Summary
Denne protokollen beskriver in vitro-sammenligning av to viktige funksjonelle egenskaper rituximab: målbindingsdomene og komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) induksjon. Metodene som ble benyttet for en side-til-side-sammenligning mellom referanse rituximab rituximab og en biosimilar. Disse analyser kan anvendes under biosimilar utvikling eller som en kvalitetskontroll i sin produksjon.
Abstract
Terapeutiske monoklonale antistoffer (mAbs) er relevant ved behandling av forskjellige sykdommer, inkludert kreft. Utviklingen av biosimilar mAbs av farmasøytiske selskaper er en markedsmulighet, men det er også en strategi for å øke narkotika tilgjengelighet og redusere behandlingsrelaterte kostnader. Protokollene som beskrevet her beskriver evalueringen av target-binding og CDC-induksjon med rituximab i Daudi-celler. Disse to funksjonene krever forskjellige strukturelle regioner av antistoff og er relevante for den kliniske virkning indusert av rituximab. Protokollene side-til-side-sammenligning av et referanse rituximab og et markedsført rituximab biosimilar. De evaluerte produktene viste forskjeller både i target-binding og CDC induksjon, noe som antyder at det er underliggende fysikalsk-kjemiske forskjeller, og fremhever behovet for å analysere virkningen av disse forskjeller i klinisk sammenheng. De metoder beskrevet her utgjør enkel og billig in vitro </ Em> modeller for evaluering av aktiviteten til rituximabbiosimilarer. Dermed kan de være nyttige under biosimilar utvikling, så vel som for kvalitetskontroll i biosimilar produksjon. Videre kan de fremstilte metoder ekstrapoleres til andre terapeutiske mAbs.
Introduction
Terapeutiske antistoffer rives rekombinante monoklonale antistoffer (mAbs) som er utviklet for behandling av forskjellige sykdommer, inkludert kreft, autoimmune og kroniske sykdommer, nevrologiske lidelser, og andre 1. Foreløpig har FDA gitt godkjenning til mer enn 40 terapeutiske mAbs, og flere er ventet å komme på markedet i de neste årene.
Rituximab er et høy-affinitet kimært monoklonalt IgG1 antistoff godkjent for behandling av CD20 + B-celle-non-Hodgkins lymfom (NHL), CD20 + follikulær NHL, kronisk lymfocytisk leukemi, og reumatoid artritt 2, 3. Erkjennelsen av CD20, som er overuttrykt i B-celler, ved rituximab induserer apoptose; komplement aktivering; og antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC) 3. Patentene av dette stoffet utløpt i Europa og i USA i 2013 og 2016, Henholdsvis. Dermed utvikler farmasøytiske selskaper over hele verden rituximabbiosimilarer. Som i ethvert annet legemiddel til konsum, krever biosimilarer godkjenning fra reguleringsorganer. Internasjonale retningslinjer indikerer at for mAbs bør biosimilaritet påvises ved å sammenligne de fysisk-kjemiske egenskapene, farmakokinetikken, effekten og sikkerheten til de nye og referanseproduktene 4 .
Følgelig må metodene som brukes i slike sammenligninger vurdere de strukturelle og funksjonelle egenskapene til mAbs, spesielt de med klinisk relevans. Til det formål viser in vitro- analyser flere fordeler i forhold til in vivo- eksperimenter (gjennomgått i Chapman et al. ) 5 : i) in vitro- studier er mer sensitive for forskjeller mellom de foreslåtte biosimilar og referanseproduktet; Ii) in vivo studier må utføres i relevante arter, som for mange mAbs erikke-humane primater; og iii) siden virkningsmekanisme, den prekliniske toksikologi, og de kliniske virkningene av referanseproduktet er vel kjent in vivo-studier med biosimilars kan ikke gi ytterligere nyttig informasjon. Følgelig EUs Veiledning for biosimilars gjør kandidatene til å gå inn kliniske studier basert på robust in vitro-data alene seks.
Her presenterer vi to raske, økonomiske og enkle analyser som evaluerer den biologiske aktiviteten til rituximab ved hjelp av CD20 + dyrkede celler. Disse analysene kan inngå som en del av sammenlignbarhet øvelsen for rituximab biosimilar kandidater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Evaluering av målbinding ved hjelp av flytcytometri
- Fremstilling av biologiske materialer og reagenser
- Lag 500 ml RPMI-dyrkningsmedium tilsatt 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (H-IFBS).
- Kultur Daudi Burkitts lymfom (Daudi) celler og Daudi GFP + celler ved bruk av RPMI og 75 cm 2 kulturflasker. Opprettholde kulturer ved 37 ° C i en 5% CO 2 fuktig atmosfære til de når 6 - 9 x 10 5 celler / ml.
- Lag 50 ml fargebuffer ved å fortynne 1/100 H-IFBS i PBS; Denne bufferen er stabil ved 2-8 ° C i minst en måned.
- Forbered testløsningene for referanse og biosimilar mAbs. Lag ti 1: 2 seriefortynninger (500 μl hver) i fargebuffer, startende fra 5 μg / ml.
- Bruk fargebuffer til å fortynne human IgG (isotype kontroll) til 5 μg / mL og PE-Cy5-mus anti-humant IgG (sekundært antistoff) til konsollensentreforeslått av produsenten.
- Fremstille 4% paraformaldehyd i PBS (fikseringsbuffer).
- Target bindende
- Samle Daudi og Daudi-GFP + cellesuspensjoner fra den 75 cm2 kulturflasker, og overføre dem til en 15-mL sentrifugerør. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter.
- Vask cellene ved tilsetning av 5 ml PBS og sentrifugering av cellesuspensjonen ved 400 xg i 5 minutter.
- Resuspender cellene i PBS og utføre en celletallet og levedyktigheten analyse med trypanblått. Bruk kulturer med cellelevedyktighetsnivået ≥ 95% for analyse.
- Fortynn cellesuspensjon til 4 x 10 6 celler / ml med kald buffer flekker.
- I 1,5 ml mikrosentrifugerør, tilsett 50 ul av cellesuspensjonen og 100 ul av de forskjellige testkonsentrasjoner på referanse- eller biosimilar mAb'er. Inkluder replikater for hver eksperimentell tilstand.
- Fremstille ytterligere rør forIsotype kontroll (human IgG1 i stedet for rituximab) og negativ kontroll (sekundært antistoff uten primært antistoff).
- Inkuber ved 4 ° C i 20 - 30 min.
- Vask cellene ved å tilsette 1 ml PBS og sentrifugere cellesuspensjonen ved 400 xg i 5 minutter ved 10 ° C. Kast supernatanten.
- Suspensere cellene i 100 ul av sekundær antistoff og inkuber i 20 - 30 min ved 4 ° C, beskyttet mot lys.
- Vask cellene to ganger med PBS og suspendere dem i 200 μl fikseringsbuffer.
- Analyser cellene på et flytcytometer.
MERK: Signalet forblir stabilt i flere dager dersom prøvene lagres ved 4 ° C og beskyttes mot lys.
- Datainnsamling
- Åpne to punktum på et regneark av operasjonsprogrammet for flowcytometer. Sett FSC-A mot FSC-H i den første og FSC-A versus SSA-A i den andre. Åpne et histogram for PE-Cy5-kanalen.
- I FSC-A versus FSC-H-plottet, gjør en gate (R1) å velge singlet-hendelser ( figur 1A ).
- Sett R1-befolkningen i FSC-A versus SSA-A punktplot, og gjør deretter en ny gate (R2) som velger målceller ( Figur 1B ). Sett R2-befolkningen i PE-Cy5-intensitetshistogrammet for å se frekvensfordelingen av cellene.
- Juster grensen for lavere fluorescensintensitet (FI) for PE-Cy5-kanalen ved hjelp av negativ og isotype-kontroll ( figur 1C ).
- Oppnå 10 000 hendelser innen R2 fra prøven med høyere konsentrasjon av referanseproduktet. FI av denne prøven skal være den høyest forventede ( figur 1C ).
- Skaff resten av prøvene.
- For hver prøve får du median fluorescensintensiteten (MFI) i PE-Cy5-kanalen.
- For prøver med referanse eller biosimilar mAb, beregne forskjellen mellom sample MFI og den for isotype kontrollen (ΔMFI).
2. Vurdering av CDC
- Fremstilling av biologiske materialer og reagenser
- Klargjør cellekulturmedium og kultur Daudi og Daudi GFP + -celler som beskrevet ovenfor (trinn 1.1.1 - 1.1.2).
MERK: I tillegg krever CDC-analysen serumfri RPMI. - Fortynn normalt humant serum komplement (NHSC) 1: 2 med serumfritt RPMI. Tilbered 2,5 ml.
- Forbered 1 ml varmeinaktivert (30 min / 56 ° C) NHSC fortynnet 1: 2 med RPMI.
- Klargjør sett med testløsninger for referanse- og biosimilar mAbs i serumfritt RPMI. Lag ti fortynninger (200 μl hver) fra 1 til 0,025 μg / ml.
- Klargjør cellekulturmedium og kultur Daudi og Daudi GFP + -celler som beskrevet ovenfor (trinn 1.1.1 - 1.1.2).
- CDC-analyse
- Samle Daudi- og Daudi-GFP + -cellene fra kulturen og kvantifiser cellens levedyktighet (se trinn 1.2.1 - 1.2.3).
- Forbered en cellesuspensjon med 4 x 10 5 celler / mL i serumfritt RPMI.
- Legg til50 ul cellesuspensjon til 50 pl av hver referanse eller biosimilar mAb testkonsentrasjon på 96-brønn konisk (V) -bottom mikroplater. Inkluder replikater for hver eksperimentell tilstand.
- Fremstille ytterligere brønner for den negative kontrollen (dvs. uten mAb), basal død kontroll (dvs. varme-inaktivert NHSC i nærvær av mAb), og farging positiv kontroll (dvs. celler som eksponeres til 50 ul av 70% EtOH).
- Cellene inkuberes i 20 - 30 For minutter ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet atmosfære.
- Tilsett 50 ul NHSC (fortynnet 1: 2) til hver brønn og inkuber opsoniserte cellene i 2,5 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktig atmosfære. Bruk varme inaktivert NHSC i basal død kontrollbrønnene.
- Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 10 ° C. Kast supernatanten.
- Vask cellene ved tilsetning av 150 ul av PBS og sentrifugering av cellesuspensjonen i 5 min ved 400 x g og 10 ° C. diSkjære supernatanten.
- Farg prøvene med 7-aminoaktinomycin (7-AAD), som tidligere beskrevet 7 , 8 .
- Analyser cellene på et flytcytometer på samme dag.
- Datainnsamling
- Åpne to punktum på et regneark av operasjonsprogrammet for flowcytometer. Sett disse tomtene som i trinn 1.3.1 - 1.3.3 ( Figur 2A-B ). Opprett et tredje plott som er et punkt-plott for GFP versus 7-AAD på R2-befolkningen.
- Definer de tilstrekkelige FI-grensene ved bruk av Daudi-celler, Daudi GFP + -celler og dødspositiv kontroll ( Figur 2C ).
- For hver prøve måle prosentandelen av 7-AAD + målceller. Oppnå minst 5000 hendelser fra R2.
- Beregn den spesifikke mAb-indusert cytotoksisiteten ved å subtrahere prosentandelen av 7-AAD + i den basale dødskontrollen fra prosentandelen funnet i prøver med forskjelligeent konsentrasjoner av mAb (figur 2D).
3. Biosimilarity Analyse
- Tast konsentrasjonen og responsverdier inn i en grafisk fremstilling programvare.
- Generer grafer og beregne ikke-lineære regresjoner med følgende betraktninger: i) å bruke log-transformasjon av mAb-konsentrasjon som "X"; ii) å bruke den fø matematiske modellen (Y = minimal respons + (maksimal respons - minimum respons) / 1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * Hill helling)); og iii) å begrense de nedre verdiene til null, ettersom det basale responsen er blitt subtrahert.
MERK: Kurver med en symmetrisk sigmoidal form er forventet. - Sammenligne både ikke-lineære passer med et globalt passform ved hjelp av en F-test (mange grafiske programmer har denne funksjonen).
MERK: Slike tester etablere som nullhypotesen at den maksimale respons, logEC 50, og den Hills stignings er de samme for de to datasett, som samsvarer medbiologisk spørsmålet skal tas opp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av de protokoller som er beskrevet ovenfor, mål-binding og CDC induksjon av referanse rituximab ble sammenlignet i parallell med de til en biosimilar rituximab produsert og kommersielt tilgjengelig i Asia.
I Daudi-celler, både mAbs bundet CD20 på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 1D). Ikke-lineære regresjoner av bindingsdataene viste en r 2 på 0,978 og 0,848 for referanse og biosimilar rituximab, henholdsvis (figur 1E). Statistisk analyse av konsentrasjon-responskurvene viste at de, og dermed de farmakodynamiske parametere beregnet fra dem, er signifikant forskjellige mAb'er (p <0,0001). Den maksimale responsen for den biosimilar var 2,16 ganger lavere enn den til referanseproduktet. Disse resultatene tyder på at de to evaluert mAbs har forskjellig kapasitet til å binde CD20 uttrykt på megmbrane av leukemiceller.
CDC induksjon ble også sammenlignet med de to mAb'er. Referanse og biosimilar produkter stimulert CDC i Daudi-celler på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 2E). Viktig er det at konsentrasjonene ved hvilke mAb induserte CDC var annerledes enn de som er nødvendig for mål-binding. Ikke-lineære regresjoner av CDC-data viste r2> 0.980 for begge produkter. Den statistiske sammenligning av konsentrasjon-respons kurver indikerte at de er signifikant forskjellige (P <0,01), noe som gjør det biosimilar mindre potent. Disse data indikerer at evnen til å indusere CDC er forskjellig for de analyserte mAb.
Figur 1. In vitro Target-binding av anti-CD20-mAb Terapeutisk. Daudi-GFP + celler ble eksponert for forskjelligEnt-konsentrasjoner av mAbene (4,8 ng / ml til 5 ug / ml) og deretter farget med PE-Cy5-konjugert anti-humant sekundært antistoff. Fluorescensintensitet (FI) ble målt ved hjelp av strømningscytometri på enkelthendelser (A) , med størrelse og granularitet tilsvarende dem fra Daudi-cellene (B) . Ufarvede celler (lysegrå), isotype kontroller (mørk grå) og 5 μg / ml av referanse rituximab (blå) ble anvendt for å sette FI-grensene (C) . Begge evaluerte mAbs bundet Daudi-celler på en konsentrasjonsavhengig måte (D) . Respons (ΔMFI; se tekst) ble brukt til å generere konsentrasjon-respons kurver for referanse (blå) eller biosimilar (svart) rituximab (E) . Statistisk sammenligning av de ikke-lineære regresjonene viste forskjeller mellom mAbs (P <0,0001; Fisher eksakte test). Vennligst klikk her for å se en større versjonPå denne figuren.
Figur 2. CDC-induksjon av anti-CD20 terapeutiske mAbs. Daudi GFP + -celler opsonisert med forskjellige konsentrasjoner av mAbs ble eksponert for humant komplement. Celledød ble evaluert ved 7-AAD-farging og strømningscytometrisk analyse av fluorescensintensitet (FI) på enkelte hendelser (A) , med størrelse og granularitet tilsvarende Daudi-celler (B) . Ufarget GFP- (svart) og GFP + (grønn) celler og etanoldøde celler (rødt) ble inkludert som kontroller (C) . Kvantifisering av 7-AAD + -cellene i basal-dødsregulering (grå) og rituximabprøver (blå) tillatt for beregning av mAb-indusert cytotoksisitet (D) . Konsentrasjon-responskurver oppnådd for referanse (blå) eller biosimilar (svart) rituximab (E). Statistisk sammenligning av de ikke-lineære regresjonene viste forskjeller mellom responsene indusert av de to mAbs (P <0,01; Fisher eksakte test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1. Monoklonale antistoffer godkjent for terapeutisk bruk, med målceller for CDC-analysen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Patentutløpet av et terapeutisk mAb er å fremme utviklingen av biosimilarer. Dermed er det behov for enkle metoder som kan identifisere forskjeller i klinisk relevante aktiviteter av disse produktene. CD20 + dyrkede celler ble benyttet for evaluering av to sentrale funksjonelle karakteristika ved rituximab: målbinding og CDC-induksjon. Den tidligere aktiviteten krever anerkjennelse av CD20 av Fab-regionen av mAb, mens sistnevnte hovedsakelig avhenger av samspillet mellom Fc-regionen og dets komplement 9 . Derfor gir disse analysene en måte å knytte strukturelle og funksjonelle egenskaper til mAbs.
Målbindingen av terapeutiske mAbs blir vanligvis evaluert ved isotermisk titreringskalorimetri (ITC), overflateplasmonresonans (SPR) eller biolag-interferometri 10 , 11 , 12 . Disse analysene tillater avFinitetsberegning, men de krever spesialutstyr og trening. Protokollen beskrevet her evaluerer målbinding i en side til side sammenligning for å identifisere forskjeller mellom produkter, selv uten tilhørende data. Metoden er enkel og benytter en relevant cellulær kontekst for aktivitetsvurdering. På den annen side kan CDC-induksjon ved rituximab evalueres ved ATP-måling 13 , kvantifiseringen av frigjort laktatdehydrogenase (LDH) 14 eller alamarBlue 15 og MTT-analyser 16 . Metoden som rapporteres her, ved bruk av 7-AAD-farging, har lav bakgrunn og kan kombineres med andre flekker for multiparametrisk strømningscytometrisk analyse.
I de representative eksperimenter som ble presentert, satte dose-respons-kurver 4-parameter logistikkmodellen, slik at man kunne beregne EC 50 , Hill-skråningen og maksimal respons. Spesielt, konsentrasjonsområdeneVi som var ansatt for å generere slike kurver, var forskjellige for hver analyse, og understreket betydningen av å analysere og definere tilstrekkelige områder i foreløpige eksperimenter. Endringer i nøkkelreagenser, for eksempel fluorokrom og komplementer, eller bruk av en cellelinje med et annet målnivå, kan forskyve det effektive konsentrasjonsområdet.
Statistisk analyse identifiserte forskjeller mellom en batch av en biosimilar rituximab som er kommersielt tilgjengelig i Asia og referanseproduktet, både i målbinding og ved CDC-induksjon. Det er viktig å vurdere at selv om produksjonsprosessen til mAbs er tett kontrollert, viser hver attributt av referanseproduktet et område. Følgelig skal det minste antall batcher som skal testes under evalueringen av en lignende bioterapeutisk avhenger av omfanget av variabiliteten til referanseproduktet og på analysevarianten 4. Derfor må disse protokollene anvendes for å differensiereNt-batchene under evalueringen av sammenligneligheten.
De presenterte metodene kan ekstrapoleres til andre par av terapeutiske mAbs-mål, så lenge celler som uttrykker antigenet er tilgjengelige. Tabell 1 viser terapeutiske mAbs annet enn rituximab, for hvilken CDC-induksjon er relevant for den kliniske effekten og samler informasjon om de tidligere rapporterte cellemodellene for hvert mAb.
Som konklusjon er de to analysene beskrevet her enkle, raske og billige, slik at de utføres i de fleste laboratorier. Metodene kan brukes i tidlige trinn av biosimilar utvikling eller etter regulatorisk godkjenning for batch-to-batch sammenligning under produksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
N. Salinas-Jazmín, E. González-González og SM Pérez-Tapia er ansatte i UDIBI, som utfører biosimilarity studier i flere farmasøytiske selskaper.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
References
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a Proposed Biosimilar RTXM83 and the Originator Rituximab. Bio Drugs. 30 (3), 225-231 (2016).
- Iwamoto, N., et al. Validated LC/MS Bioanalysis of Rituximab CDR Peptides Using Nano-surface and Molecular-Orientation Limited (nSMOL) Proteolysis. Biol Pharm Bull. 39 (7), 1187-1194 (2016).
- World Health Organization. Guidelines on evaluation of monoclonal antibodies as similar biotherapeutic products (SBPs). , Available from: http://www.who.int/biologicals/expert_committee/mAb_SBP_GL-ECBS_review_adoption-2016.10.26-11.7post_ECBS-Clean_Version.pdf (2016).
- Chapman, K., et al. Waiving in vivo studies for monoclonal antibody biosimilar development: National and global challenges. MAbs. 8 (3), 427-435 (2016).
- EMA, EMEA/CHMP/BMWP/42832/2005 Rev1. Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: non-clinical and clinical issues. , Available from: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/01/WC500180219.pdf (2014).
- Zembruski, N. C., et al. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 429 (1), 79-81 (2012).
- Salinas-Jazmin, N., Hisaki-Itaya, E., Velasco-Velazquez, M. A. A flow cytometry-based assay for the evaluation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) in cancer cells. Methods Mol Biol. 1165, 241-252 (2014).
- Teeling, J. L., et al. The Biological Activity of Human CD20 Monoclonal Antibodies Is Linked to Unique Epitopes on CD20. J Immunol. 177 (1), 362-371 (2006).
- Miranda-Hernandez, M. P., et al. Assessment of physicochemical properties of rituximab related to its immunomodulatory activity. J Immunol Res. 2015, 910763 (2015).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Ylera, F., et al. Off-rate screening for selection of high-affinity anti-drug antibodies. Anal Biochem. 441 (2), 208-213 (2013).
- Broyer, L., Goetsch, L., Broussas, M. Evaluation of complement-dependent cytotoxicity using ATP measurement and C1q/C4b binding. Methods Mol Biol. 988, 319-329 (2013).
- Herbst, R., et al. B-cell depletion in vitro and in vivo with an afucosylated anti-CD19 antibody. J Pharm Exp Ther. 335 (1), 213-222 (2010).
- Lazar, G. A., et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (11), 4005-4010 (2006).
- Winiarska, M., et al. Statins impair antitumor effects of rituximab by inducing conformational changes of CD20. PLoS medicine. 5 (3), e64 (2008).
- Zhou, X., Hu, W., Qin, X. The role of complement in the mechanism of action of rituximab for B-cell lymphoma: implications for therapy. Oncologist. 13 (9), 954-966 (2008).
- Hayashi, K., et al. Gemcitabine enhances rituximab-mediated complement-dependent cytotoxicity to B cell lymphoma by CD20 upregulation. Cancer Sci. 107 (5), 682-689 (2016).
- Mossner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Lapalombella, R., et al. A novel Raji-Burkitt's lymphoma model for preclinical and mechanistic evaluation of CD52-targeted immunotherapeutic agents. Clin Cancer Res. 14 (2), 569-578 (2008).
- Mitoma, H., et al. Mechanisms for cytotoxic effects of anti-tumor necrosis factor agents on transmembrane tumor necrosis factor alpha-expressing cells: comparison among infliximab, etanercept, and adalimumab. Arthritis Rheum. 58 (5), 1248-1257 (2008).
- Kaymakcalan, Z., et al. Comparisons of affinities, avidities, and complement activation of adalimumab, infliximab, and etanercept in binding to soluble and membrane tumor necrosis factor. Clin Immunol. 131 (2), 308-316 (2009).
- Zent, C. S., et al. Direct and complement dependent cytotoxicity in CLL cells from patients with high-risk early-intermediate stage chronic lymphocytic leukemia (CLL) treated with alemtuzumab and rituximab. Leuk Res. 32 (12), 1849-1856 (2008).
- Goswami, M. T., et al. Regulation of complement-dependent cytotoxicity by TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 35 (15), 1888-1898 (2016).
- Wang, A., et al. Induction of anti-EGFR immune response with mimotopes identified from a phage display peptide library by panitumumab. Oncotarget. , (2016).
- Ueda, N., et al. The cytotoxic effects of certolizumab pegol and golimumab mediated by transmembrane tumor necrosis factor alpha. Inflamm Bowel Dis. 19 (6), 1224-1231 (2013).
- Nesbitt, A., et al. Mechanism of action of certolizumab pegol (CDP870): in vitro comparison with other anti-tumor necrosis factor alpha agents. Inflamm Bowel Dis. 13 (11), 1323-1332 (2007).
- Teeling, J. L., et al. Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas. Blood. 104 (6), 1793-1800 (2004).
