Summary
该协议描述了利妥昔单抗的两个关键功能特征的体外比较：靶结合和补体依赖性细胞毒性（CDC）诱导。该方法用于参考利妥昔单抗和利妥昔单抗生物仿制药之间的对侧比较。这些测定可以在生物仿制发展过程中使用或作为其生产中的质量控制。
Abstract
治疗性单克隆抗体（mAb）与治疗不同病理学，包括癌症有关。制药公司开发生物仿制药是一个市场机会，但也是增加药物可及性并减少治疗相关成本的策略。这里详述的方案描述了利多西他单抗在Daudi细胞中的靶标结合和CDC诱导的评估。这两个功能需要抗体的不同结构区域，并且与由利妥昔单抗引起的临床效果相关。协议允许参考利妥昔单抗和市售的利妥昔单抗生物仿制药的对侧比较。评估的产品显示靶结合和CDC诱导的差异，表明存在潜在的物理化学差异，并强调需要分析这些差异在临床环境中的影响。这里报道的方法在体外构成简单且便宜/ em>评估利妥昔单抗生物仿制药活性的模型。因此，它们在生物仿制发展过程中是有用的，也可用于生物仿制品的质量控制。此外，所提出的方法可以外推到其他治疗性mAbs。
Introduction
治疗性抗体是开发用于治疗不同病理学，包括癌症，自身免疫性和慢性疾病，神经系统疾病等的重组单克隆抗体（mAb）。目前，FDA批准了超过40种治疗性单克隆抗体，预计在接下来的几年内将有更多的药物进入市场。
利妥昔单抗是批准用于治疗CD20 + B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL），CD20 +滤泡性NHL，慢性淋巴细胞白血病和类风湿性关节炎2,3的高亲和力嵌合单克隆IgG1抗体。由利妥昔单抗对B细胞过度表达的CD20的识别诱导细胞凋亡;补体激活;和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC） 3 。该药物的专利于2013年和2016年在欧洲和美国期满， 分别。因此，制药公司全球正在开发的生物仿制药利妥昔单抗。与在其他任何药物用于人类消费，生物仿制药需要监管机构的批准。国际准则指出，对单克隆抗体，biosimilarity应通过比较理化性质，药代动力学，药效，以及新产品的参考4安全证明。
因此，在这样的比较所使用的方法必须评估mAb的结构和功能特征，特别是那些具有临床相关性。为此目的， 在体外测定法显示在体内实验几个优点（在Chapman 等人综述）。5：1） 体外研究是所提出的生物仿制药和参照产品之间的差异更加敏感; ⅱ） 在体内研究必须相关物种，这对于许多单克隆抗体是被执行非人灵长类和iii）由于作用机制，临床前毒理学和参考产品的临床效果是众所周知的，所以与生物仿制药的体内研究可能不提供额外的有用信息。因此，欧盟生物仿制药指南允许候选人基于稳健的体外数据进入临床试验6 。
在这里，我们提供两个快速，经济和简单的测定，评估使用CD20 +培养细胞的利妥昔单抗的生物活性。这些测定可以作为利妥昔单抗生物仿制药候选物的可比性研究的一部分。
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Protocol
通过流式细胞术评价靶标结合
- 制备生物材料和试剂
- 制备500mL补充有10％热灭活胎牛血清（H-IFBS）的RPMI培养基。
- 使用RPMI和75-cm 2培养瓶培养Daudi Burkitt's淋巴瘤（Daudi）细胞和Daudi GFP +细胞。将培养物保持在37℃，5％CO 2加湿气氛中，直到达到6 - 9×10 5个细胞/ mL。
- 通过在PBS中稀释1/100 H-IFBS制备50 mL染色缓冲液;该缓冲液在2-8℃下稳定至少一个月。
- 为参考和生物仿制mAb准备测试解决方案。在染色缓冲液中制备10个1：2系列稀释液（各500μL），从5μg/ mL开始。
- 使用染色缓冲液将人IgG（同种型对照）稀释至5μg/ mL和PE-Cy5小鼠抗人IgG（二抗）至con制造商建议的中心。
- 在PBS（固定缓冲液）中制备4％多聚甲醛。
- 目标绑定
- 从75 cm 2培养瓶中收集Daudi和Daudi GFP +细胞悬液，并将其转移到15 mL离心管中。以400 xg离心5分钟。
- 通过加入5毫升PBS洗涤细胞，并以400×g离心细胞悬浮液5分钟。
- 将细胞重悬于PBS中，并用台盼蓝进行细胞计数和活力分析。使用细胞活力水平≥95％的培养物进行分析。
- 用冷染色缓冲液将细胞悬浮液稀释至4×10 6个细胞/ mL。
- 在1.5 mL微量离心管中，将50μL细胞悬浮液加入100μL不同测试浓度的参考或生物仿制mAb。包括每个实验条件的重复。
- 准备额外的管同种型对照（人IgG1而不是利妥昔单抗）和阴性对照（无抗体的二抗）。
- 在4℃下孵育20-30分钟。
- 通过加入1mL PBS洗涤细胞，并在10℃下以400×g离心细胞悬浮液5分钟。丢弃上清液。
- 将细胞悬浮在100μL的二抗中，并在4℃下孵育20-30分钟，免受光照。
- 用PBS洗涤细胞两次，并将其悬浮于200μL固定缓冲液中。
- 分析流式细胞仪上的细胞。
注意：如果样品储存在4°C并保护光线，信号保持稳定数天。
- 数据采集
- 在流式细胞仪操作软件的工作表上打开两个点图。 FSC-A 与 FSC-H在第一和FSC-A与SSA-A中的设置。打开PE-Cy5通道的直方图。
- 在FSC-A与FSC-H图中，制作选择单线事件的门（R1）（ 图1A ）。
- 将FSC-A中的R1群体设置为SSA-A点阵图，然后选择新的门（R2）选择目标单元格（ 图1B ）。设置PE-Cy5强度直方图中的R2群体，以查看细胞的频率分布。
- 使用阴性和同种型对照调节PE-Cy5通道的较低荧光强度（FI）极限（ 图1C ）。
- 从参考产品浓度较高的样品中获取R2内的10,000个事件。该样品的FI应该是预期的最高值（ 图1C ）。
- 获取其余的样品。
- 对于每个样品，得到PE-Cy5通道中的中值荧光强度（MFI）。
- 对于具有参考或生物仿制mAb的样品，计算样品MFI与同种型对照（ΔMFI）的差异。
2. CDC的评估
- 生物材料和试剂的制备
- 制备细胞培养基和培养的Daudi和Daudi GFP +细胞，如上所述（步骤1.1.1 - 1.1.2）。
注：此外，CDC测定需要无血清RPMI。 - 稀释的正常人血清补体（NHSC）1：2用无血清的RPMI中。准备2.5毫升。
- 制备1毫升的热灭活（30分钟/ 56℃）的NHSC 1:2稀释用RPMI。
- 准备套基准测试解决方案和单克隆抗体生物仿制药在无血清RPMI。使从1 10倍稀释液（每200μL）至0.025微克/毫升。
- 制备细胞培养基和培养的Daudi和Daudi GFP +细胞，如上所述（步骤1.1.1 - 1.1.2）。
- CDC检测
- 收集从培养物中的Daudi和Daudi GFP +细胞和量化细胞活力（参见步骤1.2.1 - 1.2.3）。
- 在无血清RPMI制备细胞悬浮液与4×10 5细胞/ mL。
- 加将50μL细胞悬浮液加入到96孔圆锥形（V）底部微量培养板中的50μL每个参考或生物仿制mAb测试浓度。包括每个实验条件的重复。
- 为阴性对照（ 即没有mAb）准备额外的孔，基础死亡控制（ 即在mAb存在下的热灭活NHSC）和染色阳性对照（ 即暴露于50μL70％EtOH的细胞）。
- 在37℃，5％CO 2加湿气氛中孵育细胞20-30分钟。
- 向每个孔中加入50μLNHSC（稀释1:2），并在37℃下在5％CO 2加湿气氛中孵育调理细胞2.5小时。在基础死亡控制井中使用热灭活的NHSC。
- 在10℃下以400xg离心5分钟。丢弃上清液。
- 通过加入150μLPBS洗涤细胞，并在400xg和10℃离心细胞悬浮液5分钟。迪清除上清液。
- 用7-氨基生动生霉素（7-AAD）染色样品，如前所述7,8 。
- 在同一天分析流式细胞仪上的细胞。
- 数据采集
- 在流式细胞仪操作软件的工作表上打开两个点图。根据步骤1.3.1 - 1.3.3（ 图2A-B ）设置这些图。创建第三个图，这是G2群体上GFP与7-AAD的点阵图。
- 使用Daudi细胞，Daudi GFP +细胞和死亡阳性对照来定义足够的FI限制（ 图2C ）。
- 对于每个样品，测量7-AAD +靶细胞的百分比。从R2获取至少5,000个事件。
- 通过从基础死亡对照中减去7-AAD +的百分比来计算具体的mAb诱导的细胞毒性，浓度的mAb（ 图2D ）。
生物相似性分析
- 将浓度和响应值输入图形软件。
- 生成图形并计算非线性回归，具有以下考虑：i）使用mAb浓度的对数转换为“X”; ii）使用可变斜率数学模型（Y =最小响应+（最大响应 - 最小响应）/ 1 + 10 ^（（LogEC 50 -X）*山坡））;和iii）将底部值限制为零，因为已经减去了基础响应。
注意：预计有一个对称的S形曲线。 - 使用F检验比较非线性拟合与全局拟合（许多图形软件程序包括此功能）。
注意：这样的测试建立为零假设，两个数据集的最大响应logEC 50和Hill斜率是相同的，这与预期生物学问题加以解决。
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Representative Results
使用上面描述的协议中，靶结合和参考利妥昔单抗的CDC诱导与产生的生物仿制药利妥昔单抗的和可商购于亚并行进行比较。
在Daudi细胞，两种mAb浓度依赖的方式（ 图1D）结合CD20。结合数据的非线性回归显示的0.978和0.848的R 2为参考和利妥昔单抗生物仿制药，分别（ 图1E）。浓度 - 响应曲线的统计分析表明，它们，因此由它们计算的药效学参数，是单克隆抗体（P <0.0001）之间显著不同。用于生物仿制药的最大反应是比参考产品的2.16倍以下。这些结果表明，两种评价mAb具有不同的能力结合CD20的表达我白血病细胞的mbrane。
CDC诱导作用还比较两个单克隆抗体。参考和生物仿制药产品中的浓度依赖的方式（ 图2E）刺激CDC在Daudi细胞。重要的是，在该诱导CDC的单克隆抗体的浓度比为靶结合所需的不同。在CDC数据的非线性回归分析表明R 2> 0.980这两种产品。浓度 - 响应曲线的统计比较表明，它们是不同的显著（P <0.01），使生物仿制药效力较低。这些数据表明，以诱导CDC的能力是所分析的单克隆抗体不同。
图1. 体外抗CD20治疗mAb的靶标结合。将Daudi GFP +细胞暴露于不同浓度的mAb（4.8ng / mL至5μg/ mL），然后用PE-Cy5缀合的抗人二抗染色。荧光强度（FI）通过流式细胞术测量单事件（A） ，大小和粒度对应于Daudi细胞（B）的大小和粒度。使用未染色细胞（浅灰色），同种型对照（深灰色）和5μg/ mL参考利妥昔单抗（蓝色）来设定FI限制（C） 。两者均以浓度依赖性方式评估mAb结合的Daudi细胞（D） 。使用响应（ΔMFI;见文本）产生参考（蓝色）或生物仿制（黑色）利妥昔单抗（E）的浓度 - 反应曲线。非线性回归的统计比较显示mAbs之间的差异（P <0.0001; Fisher精确检验）。 请点击这里查看更大的经文在这个数字上。
图2.抗CD20治疗性mAbs的CDC诱导。用不同浓度的mAb调理的Daudi GFP +细胞暴露于人补体。通过7-AAD染色和单次事件（A）的荧光强度（FI）的流式细胞术分析评估细胞死亡，其大小和粒度对应于Daudi细胞（B） 。包括未染色的GFP-（黑色）和GFP + （绿色）细胞和乙醇杀死的细胞（红色）作为对照（C） 。基础 - 死亡对照（灰色）和利妥昔单抗样品（蓝色）中的7-AAD +细胞的定量允许计算mAb诱导的细胞毒性（D） 。获得的参考（蓝色）或生物仿制（黑色）利妥昔单抗（E）的浓度 -。非线性回归的统计比较显示两种mAb引起的反应差异（P <0.01; Fisher精确检验）。 请点击此处查看此图的较大版本。
表1.批准用于治疗用途的单克隆抗体，用于CDC测定的靶细胞。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
治疗性单克隆抗体的专利期限正在促进生物仿制药的开发。因此，需要简单的方法来识别这些产品的临床相关活动的差异。 CD20 +培养细胞用于评估利妥昔单抗的两个关键功能特征：目标结合和CDC诱导。前一种活性需要通过mAb的Fab区域识别CD20，而后者主要取决于Fc区与其互补序列9的相互作用。因此，这些检测提供了一种链接mAbs的结构和功能特征的方法。
治疗性mAbs的目标结合通常通过等温滴定量热法（ITC），表面等离子体共振（SPR）或生物层干涉测量法评估10,11,12 。这些测定允许af资金计算，但需要专门的设备和培训。这里描述的协议评估目标绑定在一个侧面比较，以识别产品之间的差异，即使没有亲和力数据。该方法简单，并采用相关的细胞环境进行活动评估。另一方面，可以通过ATP测量13 ，释放的乳酸脱氢酶（LDH） 14或alamarBlue 15的定量和MTT测定法16来评估利妥昔单抗的CDC诱导。本文报道的方法使用7-AAD染色，背景低，可与其他染色剂结合进行多参数流式细胞术分析。
在提出的代表性实验中，剂量反应曲线拟合了四参数逻辑模型，允许计算EC 50 ，Hill斜率和最大响应。值得注意的是，集中的范围用于产生这种曲线的ons对于每个测定是不同的，突出了在初步实验中分析和定义足够范围的重要性。关键试剂（如荧光染料和补体）或使用不同目标水平的细胞系的变化可能会取代有效的浓度范围。
统计分析确定了一批在亚洲市售的生物相似利妥昔单抗与目标结合和CDC诱导中的参考产品之间的差异。重要的是要考虑到，即使严格控制mAbs的制造过程，参考产品的每个属性都会显示一个范围。因此，在评估类似的生物治疗药物期间应该测试的批次的最小数量取决于参考产品的变异程度和测定变异性4。因此，这些方案必须应用于不同nt批次在评估可比性时。
只要表达抗原的细胞是可接近的，所提出的方法可以外推到其他对的治疗性mAb靶。 表1列出除了利妥昔单抗以外的治疗性mAb，其中CDC诱导与临床疗效相关，并且编制关于每个mAb的先前报道的细胞模型的信息。
总之，这里描述的两种测定是简单，快速和便宜的，允许在大多数实验室中执行。该方法可以在生物仿制发展的早期步骤中或在生产过程中进行批次间比较的监管批准后使用。
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Disclosures
N. Salinas-Jazmín，González-González和SMPérez-Tapia是UDIBI的员工，负责为几家制药公司进行生物仿制研究。
Acknowledgments
作者没有确认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
References
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