Summary
Dieses Protokoll beschreibt den in vitro - Vergleich von zwei wichtigen funktionellen Eigenschaften von Rituximab: Zielbindungs und Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) Induktion. Die Verfahren wurden für eine Seite-an-Seite-Vergleich zwischen Referenz Rituximab und einem Rituximab biosimilar eingesetzt. Diese Assays kann während der Biosimilar Entwicklung oder als Qualitätskontrolle in der Produktion eingesetzt werden.
Abstract
Therapeutische monoklonale Antikörper (mAbs) sind für die Behandlung von verschiedenen Pathologien, einschließlich Krebs, relevant. Die Entwicklung von biosimilaren mAbs von Pharmaunternehmen ist eine Marktchance, aber es ist auch eine Strategie zur Erhöhung der Arzneimittelzugänglichkeit und zur Verringerung der Therapiekosten. Die hier beschriebenen Protokolle beschreiben die Auswertung der Zielbindung und CDC-Induktion durch Rituximab in Daudi-Zellen. Diese beiden Funktionen erfordern unterschiedliche Strukturregionen des Antikörpers und sind für den durch Rituximab induzierten klinischen Effekt relevant. Die Protokolle erlauben den Seiten-zu-Seite-Vergleich eines Referenz-Rituximab und ein vermarktetes Rituximab-Biosimilar. Die ausgewerteten Produkte zeigten Unterschiede sowohl bei der Zielbindung als auch bei der CDC-Induktion, was darauf hindeutet, dass es physikalisch-chemische Unterschiede gibt und die Notwendigkeit, die Auswirkungen dieser Unterschiede in der klinischen Einstellung zu analysieren, hervorheben. Die hier berichteten Methoden sind in vitro einfach und kostengünstig/ Em> Modelle für die Bewertung der Aktivität von Rituximab Biosimilars. So können sie bei der Biosimilar-Entwicklung sowie bei der Qualitätskontrolle bei der Biosimilar-Produktion nützlich sein. Weiterhin können die vorgestellten Methoden auf andere therapeutische mAbs extrapoliert werden.
Introduction
Therapeutische Antikörper sind rekombinante monoklonale Antikörper (mAbs) für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten entwickelt, einschließlich Krebs, Autoimmun- und chronischen Krankheiten, neurologische Störungen und andere 1. Derzeit hat die FDA-Zulassung in mehr als 40 therapeutischen mAb gewährt, und mehr wird erwartet, dass der Markt in den kommenden Jahren zu erreichen.
Rituximab ist ein hochaffine chimäre monoklonale IgG1 - Antikörper für die Behandlung von CD20 + B-Zell - Non-Hodgkin-Lymphom zugelassen (NHL), CD20 + follikulärem NHL, chronischer lymphatischer Leukämie und Gelenkrheumatismus 2, 3. Die Erkennung von CD20, die in B-Zellen überexprimiert wird, die von Rituximab Apoptose induziert; Komplementaktivierung; und antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) 3. Die Patente dieser Droge in Europa ausgelaufen und in den USA im Jahr 2013 und 2016, beziehungsweise. So weltweit Pharmaunternehmen Rituximab Biosimilars entwickeln. Wie in jedem anderen Medikament für den menschlichen Verzehr, erfordern Biosimilars Zustimmung von Aufsichtsbehörden. Internationale Richtlinien zeigen , dass für mAbs, biosimilarity sollte durch einen Vergleich der physikalisch - chemischen Eigenschaften, Pharmakokinetik, Wirksamkeit und Sicherheit der neuen und Referenzprodukten 4 gezeigt werden.
Dementsprechend sind die in solchen Vergleichen verwendeten Methoden müssen die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der mAbs, insbesondere solche mit klinischer Relevanz bewerten. Zu diesem Zweck werden in vitro - Tests zeigen mehrere Vorteile gegenüber den in - vivo - Experimenten (rezensiert in Chapman et al.) , 5: i) In - vitro - Studien sind empfindlicher auf Unterschiede zwischen dem vorgeschlagenen biosimilar und das Referenzprodukt; ii) in vivo Studien müssen in entsprechenden Arten durchgeführt werden, die für viele mAbs sindnicht-menschliche Primaten; und iii) Da der Wirkmechanismus, der präklinischen Toxikologie und klinischen Wirkungen des Referenzprodukts , sind gut bekannt, in - vivo - Studien mit biosimilars nicht zusätzliche nützliche Informationen liefern. Dementsprechend ermöglicht die Europäische Union Guidance für Biosimilars Kandidaten klinische Studien in - vitro - Daten allein 6 basierend auf robustes einzugeben.
Hier präsentieren wir zwei schnelle, wirtschaftliche und einfache Tests , die die biologische Aktivität von Rituximab mit CD20 + kultivierten Zellen zu bewerten. Diese Assays können als Teil der Vergleichbarkeit Übung für Rituximab-Biosimilar Kandidaten aufgenommen werden.
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Protocol
1. Bewertung der Zielbindung durch Durchflusszytometrie
- Herstellung von biologischen Materialien und Reagenzien
- Stellen 500 ml RPMI-Kulturmedium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum (H-IFBS) ergänzt.
- Kultur Daudi Burkitt-Lymphom (Daudi) Zellen und Daudi GFP + Zellen unter Verwendung von RPMI und 75-cm 2 Kulturflaschen. Pflegen die Kulturen bei 37 ° C in einer 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre , bis sie ausge 6 - 9 x 10 5 Zellen / ml.
- Make 50 ml Färbepuffer durch Verdünnung 1/100 H-IFBS in PBS; Dieser Puffer wird bei 2 stabil - 8 ° C für mindestens einen Monat.
- Bereiten Sie die Testlösungen für die Referenz- und Biosimilar-mAb. Macht zehn 1: 2-Reihenverdünnungen (jeweils 500 ul) in Puffer Anfärben, ausgehend von 5 & mgr; g / mL.
- Verwenden Färbepuffer Human-IgG (Isotyp-Kontrolle) bis 5 & mgr; g / ml, und PE-Cy5 Maus-anti-human IgG (sekundärer Antikörper) an die con zu verdünnenVom Hersteller vorgeschlagene Zentrierung
- 4% Paraformaldehyd in PBS (Fixierungspuffer) vorbereiten.
- Zielbindung
- Sammeln Sie die Daudi und Daudi GFP + Zellsuspensionen aus den 75-cm 2 Kulturkolben und übertragen sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 400 xg für 5 min.
- Die Zellen werden durch Zugabe von 5 ml PBS und Zentrifugieren der Zellsuspension bei 400 xg für 5 min gewaschen.
- Resuspendieren der Zellen in PBS und Durchführung einer Zellzahl und Lebensfähigkeitsanalyse mit Trypanblau. Verwenden Sie Kulturen mit Zelllebensfähigkeitsstufen ≥ 95% für die Analyse.
- Die Zellsuspension auf 4 x 10 6 Zellen / ml mit kaltem Färbepuffer verdünnen.
- In 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden 50 μl der Zellsuspension auf 100 μl der verschiedenen Testkonzentrationen der Referenz oder biosimilaren mAbs gegeben. Include-Replikate für jede experimentelle Bedingung.
- Vorbereiten zusätzlicher Rohre für dieIsotyp-Kontrolle (humanes IgG1 anstelle von Rituximab) und negative Kontrolle (sekundärer Antikörper ohne primäre Antikörper).
- Inkubieren bei 4 ° C für 20 - 30 min.
- Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml PBS und die Zellsuspension bei 400 × g für 5 min bei 10 ° C zentrifugiert. Überstand verwerfen.
- Suspendiert die Zellen in 100 & mgr; l des sekundären Antikörpers und Inkubation für 20 - 30 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt.
- Wasche die Zellen zweimal mit PBS und suspendieren sie in 200 ul Fixierungspuffer.
- Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer.
HINWEIS: Das Signal bleibt mehrere Tage stabil, wenn die Proben bei 4 ° C gelagert und vor Licht geschützt.
- Datenerfassung
- Öffnen Sie zwei Punkt Plots auf einem Arbeitsblatt des Durchflusszytometers Betriebssoftware. Stellen Sie den FSC-A im Vergleich zu FSC-H in der ersten und der FSC-A im Vergleich zu SSA-A in der zweiten. Öffnen Sie ein Histogramm für das PE-Cy5-Kanal.
- In dem FSC-A im Vergleich zu FSC-H - Plot, stellt ein Tor (R1) Auswählen Singulett Ereignisse (1A).
- Stellen Sie die R1 Bevölkerung in dem FSC-A im Vergleich zu SSA-Einem Punkt-Plot und dann ein neues Gate machen (R2) Auswählen von Zielzellen (1B). Stellen Sie die R2 Bevölkerung in dem PE-Cy5 Intensitätshistogramm der Häufigkeitsverteilung der Zellen anzuzeigen.
- Stellen Sie die niedrigere Fluoreszenzintensität (FI) Grenze für den PE-Cy5 - Kanal die negativen und Isotypkontrolle (1C) verwendet wird .
- Acquire 10.000 Ereignisse innerhalb R2 aus der Probe mit der höheren Konzentration des Referenzproduktes. FI dieser Probe sollte die höchste erwartete (1C) sein.
- Erwerben Sie den Rest der Proben.
- Für jede Probe erhalten, die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) in dem PE-Cy5-Kanal.
- Für die Proben mit der Referenz oder biosimilar mAb, die Berechnung die Differenz zwischen den Proben MFI und der der Isotyp-Kontrolle (ΔMFI).
2. Bewertung von CDC
- Vorbereitung von biologischen Materialien und Reagenzien
- Bereiten Sie Zellkulturmedium und Kultur Daudi und Daudi GFP + Zellen vor, wie oben beschrieben (Schritte 1.1.1 - 1.1.2).
HINWEIS: Zusätzlich benötigt der CDC-Assay serumfreies RPMI. - Verdünnen Sie normales menschliches Serum-Komplement (NHSC) 1: 2 mit serumfreiem RPMI. 2,5 ml vorbereiten.
- 1 ml wärmeinaktiviertes (30 min / 56 ° C) NHSC 1: 2 mit RPMI verdünnen lassen.
- Bereiten Sie Sätze von Testlösungen für die Referenz- und Biosimilar-mAbs in serumfreiem RPMI vor. Mischen Sie zehn Verdünnungen (jeweils 200 μl) von 1 bis 0,025 μg / ml.
- Bereiten Sie Zellkulturmedium und Kultur Daudi und Daudi GFP + Zellen vor, wie oben beschrieben (Schritte 1.1.1 - 1.1.2).
- CDC-Assay
- Sammeln Sie die Daudi und Daudi GFP + Zellen aus den Kulturen und quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit (siehe Schritte 1.2.1 - 1.2.3).
- Bereiten Sie eine Zellsuspension mit 4 x 10 5 Zellen / ml in serumfreiem RPMI vor.
- Hinzufügen50 & mgr; l Zellsuspension auf 50 & mgr; l jeder Referenz- oder Biosimilar-mAb-Testkonzentration in 96-well-konischen (V) -Botom-Mikroplatten. Include-Replikate für jede experimentelle Bedingung.
- Vorbereiten zusätzlicher Vertiefungen für die Negativkontrolle ( dh ohne mAb), Basal-Todeskontrolle ( dh hitzeinaktiviertes NHSC in Gegenwart von mAb) und Färben einer positiven Kontrolle ( dh Zellen, die 50 μl 70% EtOH ausgesetzt sind).
- Inkubieren Sie die Zellen für 20 - 30 min bei 37 ° C in einer 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre.
- Füge 50 μl NHSC (verdünnt 1: 2) zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere die opsonisierten Zellen für 2,5 h bei 37 ° C in einer 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre. Verwenden Sie Hitze-inaktivierte NHSC in der Basal Tod Kontrolle Brunnen.
- Zentrifugieren bei 400 xg für 5 min bei 10 ° C. Den Überstand verwerfen.
- Die Zellen werden durch Zugabe von 150 & mgr; l PBS und Zentrifugieren der Zellsuspension für 5 min bei 400 × g und 10 ° C gewaschen. DiDen Überstand zertrümmern.
- Färben Sie die Proben mit 7-Aminoactinomycin (7-AAD), wie zuvor beschrieben 7 , 8 .
- Analysieren Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer am selben Tag.
- Datenerfassung
- Öffnen Sie zwei Dot-Plots auf einem Arbeitsblatt der Durchflusszytometer-Betriebssoftware. Setzen Sie diese Plots wie in den Schritten 1.3.1 - 1.3.3 ( Abbildung 2A-B ). Erstellen Sie eine dritte Kurve, die ein Punkt-Diagramm für GFP gegenüber 7-AAD auf der R2-Population ist.
- Definieren Sie die adäquaten FI-Grenzwerte mit den Daudi-Zellen, Daudi-GFP + -Zellen und der Todes-Positivkontrolle ( Abbildung 2C ).
- Für jede Probe den Prozentsatz der 7-AAD + Zielzellen messen. Erwerben Sie mindestens 5.000 Veranstaltungen von R2.
- Berechnen Sie die spezifische mAb-induzierte Zytotoxizität durch Subtraktion des Prozentsatzes von 7-AAD + in der Basal-Todeskontrolle aus dem Prozentsatz, der in den Proben mit unterschiedlich gefunden wirdent Konzentrationen von mAbs (2D).
3. Biosimilarity Analyse
- Geben Sie die Konzentration und Reaktionswerte in eine Grafik-Software.
- Erzeugung von Diagrammen und berechnen nicht-lineare Regressionen mit den folgenden Überlegungen: i) die Log-Transformation der mAb-Konzentration als „X“; ii) die variable Steigung mathematische Modell (Y = minimale Antwort + (maximale Reaktion - minimale Antwort) / 1 + 10 ^ ((LogEC 50 -x) * Hill slope)); und iii) begrenzen die unteren Werte auf Null, da die basale Antwort subtrahiert wurde.
HINWEIS: Die Kurven mit einer symmetrischen S-Form erwartet. - Vergleichen Sie die beide nicht-lineare Anpassungen mit einer globalen Passform mit einem F-Test (viele Grafiksoftwareprogramme enthalten diese Funktion).
HINWEIS: Solche Tests herzustellen als der Nullhypothese , dass die maximale Reaktion, logEC 50 und der Hill - Anstieg das gleiche für die zwei Datensätze sind, die die ÜbereinstimmungenBiologische Frage soll behandelt werden.
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Representative Results
Unter Verwendung der oben beschriebenen Protokolle, und die Zielbindungs CDC Induktion von Referenz Rituximab wurden parallel mit denen einem biosimilar Rituximab hergestellt und im Handel erhältlich in Asien verglichen.
In Daudi - Zellen, CD20 in einer konzentrationsabhängigen Weise (Figur 1D) gebunden beide mAbs. Nicht-lineare Regressionen von Bindungsdaten zeigten ein R 2 von 0,978 und 0,848 für die Referenz und biosimilar Rituximab, bzw. (Figur 1E). Die statistische Analyse der Konzentrations-Wirkungs-Kurve zeigte, daß sie und damit die pharmakodynamischen Parameter aus ihnen berechnet, sind signifikant unterschiedlich zwischen mAbs (P <0,0001). Die maximale Reaktion für das Biosimilar war 2,16-fach niedriger als die des Referenzprodukts. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die beiden ausgewertet mAbs unterschiedliche Kapazitäten haben zu binden CD20 auf der mich ausgedrücktmbrane von leukämischen Zellen.
CDC Induktion war auch im Vergleich zu den beiden mAbs. Referenz- und Biosimilarprodukten stimulierte CDC in Daudi - Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise (Figur 2E). Wichtig ist, bei der die Konzentrationen der CDC waren unterschiedlich induzierten mAbs als diejenigen, die für Zielbindungs. Nicht-lineare Regressionen der CDC - Daten zeigten , r 2> 0,980 für beide Produkte. Der statistische Vergleich der Konzentrations-Wirkungs-Kurve angegeben, dass sie signifikant unterschiedlich (P <0,01) sind, so dass die biosimilar weniger potent. Diese Daten zeigen, dass die Fähigkeit zur Induktion CDC für die analysierten mAbs verschieden ist.
Abbildung 1 : In Vitro-Ziel Bindung von Anti-CD20 - mAbs Therapeutic. Daudi GFP + -Zellen wurden exponiert abweichenent Konzentrationen der mAbs (4,8 ng / ml bis 5 ug / ml) und dann mit PE-Cy5-konjugiertem anti-human sekundärem Antikörper gefärbt. Die Fluoreszenzintensität (FI) wurde durch Durchflusszytometrie auf Einzelereignisse (A) gemessen wird , mit der Größe und Granularität , die die der Daudi - Zellen entsprechen (B). Ungefärbte Zellen (hellgrau), Isotypkontrollen (dunkelgrau) und 5 & mgr; g / ml des Referenz Rituximab (blau) wurden verwendet , um die Grenzen zu setzen FI (C). Beide mAbs ausgewertet Daudi - Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise (D) gebunden ist . Antworten (ΔMFI; siehe Text) wurden verwendet , um Konzentrations-Wirkungs - Kurve für die Referenz (blau) oder biosimilar (schwarz) Rituximab (E) zu erzeugen. Der statistische Vergleich der nicht-linearen Regressionen zeigten Unterschiede zwischen den mAb (P <0,0001; Fisher-Exact-Test). Bitte klicken Sie hier einen größeren versi anzuzeigenauf dieser Figur.
Abbildung 2. CDC Induktion von anti-CD20 Therapeutische mAbs. Daudi GFP + Zellen opsonisierter mit verschiedenen Konzentrationen von mAbs wurden das menschliche Komplement ausgesetzt. Der Zelltod wurde durch 7-AAD - Färbung und die durchflusszytometrischen Analyse der Fluoreszenzintensität (FI) auf Einzelereignisse (A), mit der Größe und Granularität entsprechend die Daudi - Zellen (B) bewertet. Ungefärbten GFP- (schwarz) und GFP + (grün) Zellen und Ethanol-abgetöteten Zellen (rot) wurden als Kontrollen (C) enthalten. Quantifizierung der 7-AAD + Zellen im basalen-death Steuerung (grau) und Rituximab Proben (blau) für die Berechnung der mAb-induzierten Zytotoxizität (D) erlaubt. Konzentrations-Wirkungs - Kurve für die Referenz (blau) oder biosimilar (schwarz) erhalten Rituximab (E). Der statistische Vergleich der nichtlinearen Regressionen zeigte Unterschiede zwischen den durch die beiden mAbs induzierten Reaktionen (P <0,01; Fisher exakter Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1. Monoklonale Antikörper, die für die therapeutische Verwendung zugelassen sind, mit Zielzellen für den CDC-Assay. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Der Patentablauf eines therapeutischen mAb fördert die Entwicklung von Biosimilars. So besteht ein Bedarf an einfachen Methoden, die Unterschiede in den klinisch relevanten Aktivitäten dieser Produkte identifizieren können. CD20 + kultivierte Zellen wurden für die Bewertung von zwei wichtigsten funktionellen Eigenschaften von Rituximab: Zielbindung und CDC-Induktion eingesetzt. Die frühere Aktivität erfordert die Erkennung von CD20 durch die Fab-Region des mAb, während letztere hauptsächlich von der Wechselwirkung der Fc-Region mit ihrem Komplement 9 abhängt. Daher bieten diese Assays einen Weg, um die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von mAbs zu verknüpfen.
Die Zielbindung von therapeutischen mAbs wird üblicherweise durch isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), Oberflächenplasmonresonanz (SPR) oder Biolayer-Interferometrie 10 , 11 , 12 ausgewertet. Diese Assays erlauben afFinale Berechnung, aber sie benötigen spezialisierte Ausrüstung und Ausbildung. Das hier beschriebene Protokoll bewertet die Zielbindung in einem Side-to-Side-Vergleich, um Unterschiede zwischen Produkten zu identifizieren, auch ohne Affinitätsdaten. Die Methode ist einfach und verwendet einen relevanten zellularen Kontext für die Aktivitätsbewertung. Andererseits kann die CDC-Induktion durch Rituximab durch ATP-Messung 13 , die Quantifizierung der freigesetzten Lactatdehydrogenase (LDH) 14 oder alamarBlue 15 und MTT-Assays 16 ausgewertet werden. Die hier beschriebene Methode, die 7-AAD-Färbung verwendet, hat einen geringen Hintergrund und kann mit anderen Flecken für die multiparametrische Durchflusszytometrie kombiniert werden.
In den dargestellten repräsentativen Experimenten platzierten die Dosis-Response-Kurven das Vier-Parameter-Logistikmodell, das die Berechnung der EC 50 , Hill Slope und maximale Response ermöglicht. Bemerkenswert, die Bereiche der KonzentrationDie zur Erzeugung solcher Kurven verwendet wurden, waren für jeden Assay unterschiedlich und betonten die Bedeutung der Analyse und Definition von adäquaten Bereichen in Vorversuchen. Änderungen der Schlüsselreagenzien wie Fluorochrome und Komplemente oder die Verwendung einer Zelllinie mit einem anderen Zielniveau können den effektiven Konzentrationsbereich verschieben.
Statistische Analyse identifiziert Unterschiede zwischen einer Charge eines Biosimilar Rituximab im Handel erhältlich in Asien und dem Referenzprodukt, sowohl in der Zielbindung und in CDC-Induktion. Es ist wichtig zu bedenken, dass, selbst wenn der Herstellungsprozess der mAbs eng gesteuert wird, jedes Attribut des Referenzprodukts einen Bereich anzeigt. Dementsprechend hängt die minimale Anzahl von Chargen, die bei der Bewertung eines ähnlichen Biotherapeutikers getestet werden sollten, von dem Ausmaß der Variabilität des Referenzprodukts und von der Assayvariabilität 4 ab . Daher müssen diese Protokolle auf differe angewendet werdenBei der Bewertung der Vergleichbarkeit.
Die dargestellten Methoden können auf andere Paare von therapeutischen mAbs-Targets extrapoliert werden, solange die Zellen, die das Antigen exprimieren, zugänglich sind. Tabelle 1 listet therapeutische mAbs außer Rituximab, für die CDC-Induktion für die klinische Wirksamkeit relevant ist, und kompiliert Informationen über die zuvor berichteten zellulären Modelle für jeden mAb.
Abschließend sind die beiden hier beschriebenen Assays einfach, schnell und kostengünstig und erlauben ihre Ausführung in den meisten Labors. Die Methoden können in frühen Schritten der Biosimilar-Entwicklung oder nach der Zulassung für den Batch-to-Batch-Vergleich während der Produktion verwendet werden.
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Disclosures
N. Salinas-Jazmín, E. González-González und SM Pérez-Tapia sind Angestellte von UDIBI, die Biosimilaritätsstudien für mehrere Pharmaunternehmen durchführen.
Acknowledgments
Die Autoren haben keine Anerkennung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
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