Summary
Hier geven we een stap-voor-stap protocol van de lange lengte elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) methode. Dit is een nieuwe methode die het mogelijk maakt voor het eerst kwantificering en karakterisering van glutamine en asparagine deamidering isovormen door shotgun proteomics.
Abstract
Karakterisatie van eiwitdeamiderende is noodzakelijk om de rol (len) en de mogelijkheden van deze eiwitten posttranslationele modificatie (PTM) in humane pathologie en andere biochemische context ontcijferen. Ter karakterisering van eiwitten deamidatie voeren, hebben wij onlangs een nieuwe lange-length elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) werkwijze die het glutamine (Gln) en asparagine (Asn) isovorm kan scheiden producten van de deamidatie van modelverbindingen zeer complexe biologische monsters. LERLIC-MS / MS is dus de eerste shotgun proteomics strategie voor de scheiding en kwantificering van Gin deamidatie isovormen. We tonen ook als noviteit, dat het monster verwerkingsprotocol geschetste stabiliseert het succinimide tussenliggende waardoor de karakterisering van LERLIC-MS / MS. Toepassing van LERLIC-MS / MS zoals weergegeven in deze video artikel kan u helpen om op te helderen de op dat moment onbekenden moleculaire arrays van eiwit deamidatie. Bovendien LERLIC-MS / MS verschaft verder inzicht in de enzymatische reacties die deamidatie bij onderscheiden biologische achtergronden omvatten.
Introduction
Deamidering is een proteïne posttranslationele modificatie (PTM) dat een negatieve lading aan het eiwit skelet geïntroduceerd door middel van modificatie van asparagine (Asn) en / of glutamine (Gln) resten 1. Deze modificatie terwijl beïnvloeden Asn residuen genereert de isomere producten isoaspartaamzuur (isoAsp) en n -aspartic acid (Asp) bij een gemeenschappelijke 3: 1 verhouding 2. Ondanks deze verhouding kan worden gewijzigd door tussenkomst van de reparerende enzym L-isoaspartyl methyltransferase (PIMT) 3, 4. Evenzo deamidering van Gln residuen genereert isomere gamma-glutaminezuur (γ-Glu) en alfa-glutaminezuur isovormen (α-Glu) en een verwachte 1: 7 verhouding van 3, 5, doch deze verhouding kan worden geschoven door de werking van de alomtegenwoordige enzym transglutaminase 2 en andere transglutaminasen, zoals transglutaminase 1, enzyme onlangs geïdentificeerd als geassocieerd met extracellulaire blaasjes in de hersenen 6.
De oorsprong van deamidatie kan hetzij spontaan of enzymatisch worden, de eerste is vooral gebruikelijk op Gin residuen waarin transglutaminasen en andere enzymen mediëren inter / intramoleculaire verknoping via transamideringsprodukt (zie 3 voor meer details over Gin transamideringsprodukt en de implicaties verschillende chronische en dodelijke ziekten bij de mens). Daarom, deamidering is een doorvoermechanisme die een cruciale weerslag op de structuur en functie van de betrokken moleculen 4, 7, 8 heeft en vereist een uitgebreide chemische karakterisering 3 in het licht van de diverse biochemische gevolgen inbegrip van de service moleculaire klok van veroudering 9 .
Hoewel deamidering Asn residuen is relatief goed gekenmerkt door bottom-up shotgun proteomics 1, 10, deamidatie of Gln-residuen nog steeds geen geschikte karakteriseringsmethode buiten de uitdagende analyse van modelverbindingen door elektronen radicaal fragmentatie 11. We hebben onlangs een nieuwe één dimensie shotgun proteomics strategie (LERLIC-MS / MS) 3 die gescheiden Gin en Asn deamidering isovormen uit complexe biologische monsters en modelverbindingen maakt in een enkele analyse. LERLIC-MS / MS is gebaseerd op de scheiding van de tryptische peptiden gedigesteerd met behulp van een lange lengte (50 cm) ionenuitwisselingskolom (LAX) aan elektrostatische afstoting-hilic (Erlić) stand en gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (LC MS / MS). Deze nieuwe analytische strategie is toegepast voor het karakteriseren en kwantificeren betrekkelijk de omvang van elk gedeamideerd residuen in humane hersenweefselsf "> 3. Niettemin zal de hier geschetste protocol videobeelden van LERLIC-MS / MS doel de eigenaardigheden van eiwitdeamiderende bestuderen de biochemische context van belang.
ETHISCHE UITSPRAAK
Alle procedures van dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Nanyang Technological University in Singapore en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Verpakking de lange lengte Anion exchange (LAX) Capillaire kolom
(Noot: Hoewel de LAX kolom kan in-huis verpakt als we in dit protocol beschrijven LOS kolommen zijn ook commercieel verkrijgbaar, zie tabel van Materialen en Reagentia voor verdere details).
- Suspendeer 50 mg zwakke anionenuitwisselende pakkingsmateriaal in 3,5 ml verpakking buffer (tabel 1) aan de slurrie te bereiden.
- Monteer het uiteinde van de capillaire kolom (50 cm lengte - 200 urn inwendige diameter (ID) slang) met een vrouwelijk naar vrouwelijke koppeling, een plak en een moer. Plaats een scherm 1/16" OD van 1 micron poriegrootte in het vrouwelijk naar vrouwelijke koppeling (NB:. Het scherm hier gebruikt moet kleiner poriëngrootte dan de deeltjesgrootte van het verpakkingsmateriaal om lekkage van het materiaal te voorkomen hebben de kolom).
- Verpak de capillair met een slurrie onder een druk pomp bedreven bij 4.500 psi. (Let op: Verpak de Column totdat het verpakkingsmateriaal zichtbaar aan de ingang van de kolom).
- Monteer het andere uiteinde van de capillaire kolom zoals beschreven in punt 1.2.
2. Monstervoorbereiding
Dit protocol beschrijft de toepassing van LERLIC-MS / MS menselijke hersenweefsels als model proteoom analyse. (Opmerking: Als ander weefsel of proteomische samples, dient de monsterbereidingsprocedures worden aangepast.)
- Weefsel homogenisatie:
een. Wassen hersenweefsels (50-100 mg) met 1x fosfaatbufferoplossing gedurende vijf minuten driemaal.
b. Homogeniseren het weefsel 1: 1: 2,5 tissue / metallic kralen / SDC homogenisatiebuffer (Tabel 2) verhouding (w / w / v) gedurende 5 min bij 4 ° C in veiligheidskapjes buizen bij maximale intensiteit met een tissue homogenisator. (Noot: SDC homogenisatiebuffer kan proteaseremmers omvatten zoals hiervoor in 3 aangegeven)
c. Centrifugeer de weefselhomogenaat, fro verkregenm de vorige stap, bij 10.000 x g, 4 ° C gedurende 10 minuten en verzamel de supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis.
d. Herhaal stap bc voor de resterende pellets en combineer de supernatanten zo vaak als nodig totdat er geen korrel wordt waargenomen. (Let op: Als u de stappen bc meer dan twee keer te herhalen, beweegt het monster en de kralen aan een nieuwe safe-lock buis om het verlies van het monster tijdens de centrifugatiestap te voorkomen).
e. Kwantificeren van de eiwitconcentratie van de verkregen homogenaten door bicinchoninezuurbepaling (BCA) 12. - Natrium deoxycholaat (SDC) bijgestane in oplossing tryptische digestie 13 van hersenhomogenaten.
een. Voeg een eindconcentratie van 10 mM dithiothreïtol (DTT) (met de voorraadoplossing die in oplossing 5 van tabel 3) het verkregen homogenaat aan de vermindering van proteïne disulfidebindingen initiëren.
b. Incubeer het homogenaat gedurende 30 min in een badvooraf ingesteld op 60 ° C.
c. Toevoegen homogenaat een eindconcentratie van 20 mM joodacetamide (IAA) met de voorraadoplossing die in Oplossing 7 van tabel 4.
d. Incubeer het homogenaat met IAA bij kamertemperatuur in het donker gedurende 45 min.
e. Verdun het hersenhomogenaat twee vouwen behulp verdunningsbuffer (Oplossing 6 van tabel 3).
f. Incubeer het monster voor de tweede reductietrap gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
g. Add sequencing-grade modified trypsin opgelost in Oplossing 2 van tabel 2 aan eiwit tot enzym verhouding van 1:50 (w / w).
h. Digereer het homogenaat met trypsine door overnacht incubatie bij 30 ° C.
ik. Schrik de enzymatische digestie op de volgende dag door toevoeging van 0,5% eindconcentratie mierenzuur (FA). (NB: Toevoeging van FA wordt precipitatie van de zouten SDC onder zure condities leiden.)
j. Voorzichtig vortex de monsters die SDC precipiLIDSTATEN.
k. Pellet door het SDC zouten door centrifugeren van de monsters bij 12.000 x g, 4 ° C gedurende 10 min.
l. Verzamel de bovenstaande vloeistof en breng de oplossing op een schone nieuwe buis. (Let op: Zorg ervoor dat tijdens het pipetteren van deze stap om niet opnieuw op te schorten en / of het verzamelen van zouten uit de SDC pellet.)
m. Opnieuw oplossen SDC SDC pellet opnieuw oplossende buffer (tabel 5) onder krachtig vortexen gedurende 1 minuut.
n. Herhaal stap JL tweemaal neergeslagen peptiden herstellen en combineren de bovenstaande vloeistoffen. (NB:. Zie Serra et al 2016 13 voor meer informatie over de SDC ondersteunde in oplossing tryptische digestie protocol hier aangepast.) - Ontzouten van tryptische gedigereerde monsters.
een. Voeren ontzouten van gedigereerde monsters met behulp van een 1 g C-18 patroon. (Opmerking: het gebruik van een groot volume cassette (5 ml) onafhankelijk van de hoeveelheid eiwit verkregen garanties goede reiniging overgebleven SDC zouten in de monsters voorafgaandeLC-MS / MS injectie).
b. Voeren conditionering van de 1g C-18 cassette met 5 ml acetonitril (ACN).
c. Passeren 5 ml sanering buffer (Tabel 6) van het geconditioneerde 1g C-18 cartridge om eventueel achtergebleven organisch oplosmiddel te verwijderen.
d. Laad het monster op de 1g C-18 patroon.
e. Voeren 3-5 sanering stappen om het monster in de 1g C-18 kolom met 5 ml buffer sanering elke stap.
f. Elueer het ontzout peptiden uit de 1g C18 cartridge via 5 ml elutiebuffer (Tabel 7).
g. Droog de geëlueerde peptiden in een vacuümconcentrator.
c. Reconstitueer het gedroogde monster in een eindvolume van 200 pl elutiebuffer. (NB:. Gebruik krachtige en lange (> 10 min) vortexen, gevolgd door daaropvolgende sonicatie in een bad sonicatie gedurende 30 minuten volledig resuspenderen van de gedroogde peptiden in injectiebuffer)
d. Pas het injectievolume van het monster voor LERLIC-MS / MS analyseren tussen 1-3 ug eiwit.
3. Eén-dimensionale LERLIC-MS / MS Scheiding
- Vloeistofchromatografie voorwaarden:
Mobiele fasen:
A: 0,1% FA in water (tabel 8).
B: 0,1% FA in ACN (tabel 9)
Stroomsnelheid: 0,4 pL / min
Kolom: LAX capillaire kolom (50 cm lengte - 200 um ID)
een. Gebruik de volgende 1.200 min-gradiënt: 95% B gedurende 40 min, 95-85% B gedurende 434 min, 85-70% B gedurende 522 min, 70-35% B gedurende 124 min, 35-3% B gedurende 45 min , isocratisch 3% B gedurende 5 min, 3-95% B in 7 min en bewaard isocratisch bij 95% B gedurende 23 min.
b. Voeren scheiding van peptiden via de LAX capillaire zoals in Serra en Gallart-Palau et al. 3 met behulp van ultra-hoge druk vloeistofchromatografie. - Mass spectrometer configuratie:
een. Configureren scan gebeurtenisdetails aan gegevensverwerving alternerende betwe voerenen full Fourier-transformatie-massaspectrometrie (FT-MS) en Fourier transformatie-tandem massaspectrometrie (FT-MS / MS) met de volgende parameters:
a.1. Data acquisitie-modus: positief
a.2 FT-MS parameters:
Massagebied: 350 - 2.000 m / z
Resolutie: 60.000
Microscans: 1 per spectrum
Automatische versterkingsregeling: 1 x 10 6
a.3 FT-MS / MS-parameters:
Fragmentatie-modus: Hoog-energetische botsingen dissociatie (HCD)
a.4 massagebied: 150 - 2.000 m / z
A.5 Resolutie: 30.000
a.6 Top N ionen: 10
Microscans: 1 per spectrum
Laadtoestand:> 2+
Isolatie breedte: 2 Da
A.7 Automatische versterkingsregeling: 1 x 10 6
b. Uitvoeren van massaspectrometrie detecteren van peptiden zoals aangegeven in 3 via een orbitrap massaspectrometer uitgerust met een nanoelectrospray ionenbron die bij 1,5 kV.
4. Data Analysis
- Voer protein databankonderzoek de LERLIC-MS / MS gegevens verkregen met de volgende parameters behulp van een specifiek proteomics software: (Opmerking: Zie 3 voor meer details).
een. Ion tolerantie: 10 ppm
b. Fragmentionen tolerantie: 0,05 Da
c. False Discovery Rate (FDR): 1%
d. Database: UniProt menselijke database
e. Vaste modificaties: Carbamydomethylation bij Cys
f. Variabele modificaties (indien vereist door de software): Oxidatie (Met), Deamidatie (Asn en Gln). - Zekere karakterisering en kwantificering van gedeamideerd isomere produkten LERLIC-MS / MS gegevens:
een. Export databank zoekresultaten van LERLIC-MS / MS om een spreedsheet software voor analyse.
b. Zoek en pak de hele lijst van gedeamideerd peptiden en hun niet-deamidated tegenhangers.
c. Met de lijst van de verkregen peptiden als referentie, extraheer het ion chromatogrammen (XICs) van deze peptiden via een bestemde software bij 5 dpm massatolerantie. (Notitie:Zie 3 voor meer informatie over de software die wordt gebruikt voor de winning van XICs.)
d. Inspecteer de verkregen XICs de gescheiden dubbele piek elutie van de isomere producten te identificeren aangegeven 3. (Opmerking: Isomere producten van die peptiden die bij MS / MS niveau kan gemakkelijk gevonden worden geleid door de aanwezigheid van twee verschillende retentietijden in het zoekresultaatdatabase.)
e. Relatieve kwantificatie van de isomere producten uit elke gedeamideerd site / peptide moet worden uitgevoerd op basis van het piekgebied van elk element isomeer verkregen XICs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deamidatie of Gin en Asn residu wordt beschouwd als een degeneratieve eiwitmodificatie (DPM) betrokken bij een aantal chronische en dodelijke ziekten 14. Is aangetoond dat dit PTM de halfwaardetijd en afbrekende toestanden van antilichamen en andere moleculen kunnen voorspellen in het menselijk lichaam en soortgelijke biologische backgrounds 1, 15. De betekenis van eiwitdeamiderende, in feite, gaat verder dan de biomedische context, vandaar deze modificatie in diverse Proteoomwijde is 16, 17 en sommige studies hebben op het moment dat het potentieel van deamidatie aangetoond nauwkeurige datering van schilderijen uit te voeren en archeologische blijft 18, 19 . Hoewel de betekenis en de functionaliteit van eiwitdeamiderende in diverse achtergronden zijn bevestigd voor lange tijd, dere was tot voor kort een gebrek aan technische vooruitgang op de weg naar een diepgaande karakterisering van deze PTM 3 te bereiken.
Toepassing van LERLIC-MS / MS 3, zoals weergegeven in figuur 1, voorziet het eerst in één run gescheiden gescheiden Gin en Asn gedeamideerd isovormen uit complexe Proteoomwijde of modelverbindingen zelfs voor die peptiden die twee onafhankelijke Asn en Gin gedeamideerd proteoforms.
Figuur 1: Schema van LERLIC-MS / MS werkstroom voor scheiding en kwantificering van Gin en Asp Deamidatie Verwerkte complex samples op Shotgun Proteomics. LERLIC-MS / MS omvat eiwit-extractie en enzymatische digestie vóór één dimensiescheiding van peptiden door LC-MS / MS met de LAX capillaire kolom. Analysis van XICs de identificatie van deamidatie isomere producten geëlueerd bij verschillende retentietijden basis van hun verschillende zuurgraad 3, 20, 21. MS / MS maakt onderscheid tussen gedeamideerd en niet- gedeamideerd peptiden en zekere identificatie van de gedeamideerde residu. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Enzymatisch gemodificeerde tussenproduct Gin resten van transamideringsprodukt weergeven van een omgekeerde γ / α-glutamyl verhouding (figuur 2) kan worden blootgelegd en gekenmerkt door LERLIC-MS / MS, die bepalend zijn voor de studie van proteïnopathie kunnen hebben bij neurodegeneratieve ziekten 3, 22, 23 , 24. Zoals eerder gemeld Serra en Gallart-Palau 2016 verschillende onbekende PIMT substraateiwitten presenteert een omgekeerde isoAsp / Asp verhouding gedeamideerd Asn residuen kunnen ook in humane weefsels die door LERLIC-MS / MS 3.
Figuur 2: Inspectie van XICs en identificatie van Double retentietijden bij de MS / MS-niveau voor de gedeamideerd Peptiden toestaan Karakterisering van Gin en Asn gedeamideerd isomeren en identificatie van producten van Crucial enzymatische reacties die plaatsvinden in Deamidatie. een. Detail van de XIC toont de twee pieken die overeenkomen met de γ / α-glutamyl isomeren van het peptide FQMPDQGMTSADDFFEQ # GTK uit de hersenen eiwit DPYL2 Dihydropyrimidinase gerelateerd-eiwit 2. De omgekeerde γ / α-glutamyl verhouding detected doordat peptide geeft de mogelijke implicatie van de γ-glutamyl-bevattende specie in de transglutamination reactie als een transglutaminase γ-glutamyl tussenproduct. De gedeamideerde residu werd bevestigd met MS / MS zowel retentietijden, b. bij 389,1 min overeenkomend met de α-glutamyl bevattend peptide en c. bij 401,4 min correspondeert met het γ-glutamyl-bevattende peptide. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Als nieuwheid van dit document, vonden we dat LERLIC-MS / MS maakt karakterisering van de succinimide tussenproduct (figuur 3). Het gebruik van milde zure pH tijdens monster verwerking stabiliseert de succinimide tussenproduct in gewijzigde Asn residuen 25. Daarom LERLIC-MS / MS laat proteoom-brede studie van de succinimide tussenproduct, een labiel en slecht begrepen modificatie met belangrijke fysiologische en pathologische gevolgen 26.
Figuur 3: Identificatie van het succinimide Tussenproduct bij Asn residuen op LERLIC-MS / MS. een. Spectrum van het Asn geamideerd peptide YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR van de hersenen eiwit ALDO C aldolase C. gedeamideerd residu wordt aangeduid als Deam-Asn. b. Spectrum van het peptide YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, die in dit geval toont een massaverschuiving van -17 Da aan de eerder gedeamideerd Asn residu (Scc-Asn) door de ammonium verliezen die plaatsvinden tijdens de vorming van de succinimide tussenproduct. Klik hier om een grotere versie van th bekijkenis figuur.
| bestanddeel | Bedrag 100 mL |
| isopropanol | 90 mL |
| Water | 10 mL |
Tabel 1. Verpakking buffersamenstelling (90% isopropanol).
| Oplossing 1: 1 M ammoniumacetaat. | |
| bestanddeel | Bedrag 50 mL |
| ammoniumacetaat | 3,86 g |
| Water (vul tot 50 ml) | -50 mL |
| Oplossing 2: 100 mM ammoniumacetaat. | |
| bestanddeel | Bedrag 50 mL |
| oplossing 1 | 5 mL |
| Water | 45 ml |
| Oplossing 3: 10% Natriumdeoxycholaat. | |
| bestanddeel | Bedrag 1 mL |
| natriumdeoxycholaat | 0,1 g |
| Water | 1 mL |
| Oplossing 4: SDC homogenisatiebuffer (100 mM ammoniumacetaat dat 1% natrium deoxycholaat). | |
| bestanddeel | Bedrag 10 mL |
| oplossing 2 | 9 mL |
| oplossing 3 | 1 mL |
Tabel 2. SDC homogenisatiebuffer samenstelling (100 mM ammoniumacetaat bevattende 1% natriumdeoxycholaat). Bereid de voorraad solutie 1M ammoniumacetaat (oplossing 1) en verdun tot 100 mM ammoniumacetaat krijgen (Oplossing 2). Bovendien voorbereiding van de voorraadoplossing van 10% natriumdeoxycholaat (Oplossing 3). Bereid de SDC homogenisatiebuffer zoals beschreven in Oplossing 4.
| Oplossing 5: 1 M DTT | |
| bestanddeel | Bedrag 10 mL |
| dithiothreitol | 77 mg |
| Oplossing 2 (zie tabel 2) | 0,5 mL |
| Oplossing 6: Verdunningsbuffer | |
| bestanddeel | Bedrag 10 mL |
| oplossing 5 | 0,1 mL |
| Oplossing 2 (zie tabel 2) | 9,9 mL |
Tabel 3. Samenstelling verdunningsbuffer (100 mM ammoniumacetaat bevattende 10 mM dithiothreïtol (DTT)). Bereid de voorraadoplossing van 1 M DTT (oplossing 5) en vervolgens de verdunningsbuffer bereiden zoals beschreven in Oplossing 6.
| Oplossing 7: 1 M IAA | |
| bestanddeel | Bedrag 10 mL |
| IAA | 93 mg |
| Oplossing 2 (zie tabel 2) | 0,5 mL |
Tabel 4. Samenstelling Alkylering Buffer (100 mM ammoniumacetaat bevattende 20 mM Joodacetamide (IAA)). Bereid de voorraad oplossing van 1 M IAA (Oplossing 7).
| bestanddeel | Bedrag 50 mL |
| ammoniumhydroxide | 0,25 mL |
| Water | 24.75 mL |
Tabel 5. SDC opnieuw oplossen buffersamenstelling (0,5% ammoniumhydroxide).
| bestanddeel | Bedrag 100 mL |
| trifluorazijnzuur | 0,1 mL |
| Water | 99.9 mL |
Tabel 6. Clean-up buffer (0,1% trifluorazijnzuur).
| bestanddeel | Bedrag 100 mL |
| acetonitril | 75 mL |
| mierenzuur | 0,1 mL |
Tabel 7. elutiebuffer (75% acetonitril, 0,1% mierenzuur).
| bestanddeel | Bedrag 1000 mL |
| mierenzuur | 1 mL |
| Water | 999 mL |
Tabel 8. mobiele fase een compositie.
| bestanddeel | Bedrag 1000 mL |
| mierenzuur | <td> 1 mL|
| acetonitril | 999 mL |
Tabel 9. mobiele fase B Samenstelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video-artikel geven we een stap-voor-stap protocol van LERLIC-MS / MS 3, een werkwijze om diepgaande karakterisering voeren en nauwkeurig de mate van proteïne deamidering en enzymatische processen dit eiwitmodificatie. LERLIC-MS / MS is gebaseerd op het gebruik van een lange lengte (50 cm) LOS volgens het elektrostatische repulsie-hilic (Erlić) 27. Het gebruik van een lange-kolomlengte, zoals in onze studie 3, maximaliseert het potentieel van Erlić afzonderlijke peptiden volgens hun iso-elektrisch punt 27.
LERLIC-MS / MS vertegenwoordigt een nieuwe shotgun ééndimensionale scheiding strategie een workflow tijd op handen slaat tijdens staalverwerking maar het vergt 1.200 min verloop als aangegeven in 3 optimale resultaten over zeer complexe proteomen verkrijgen. Een 60 min gradient in LERLIC-MS / MS kan bereiken optimale scheiding van isovormen Gln deamidatie op modelverbindingen voor het eerst shotgun proteomics 3. Op basis van deze twee aanvragen We speculeren dat tweede dimensie scheiding uitgevoerd door LAX capillair een eerste dimensie omgekeerde-fasechromatografie kan worden gekoppeld onder een multidimensionale chromatografie benadering voor de analyse van monsters van lage complexiteit, een werkstroom voordien door onze fractie 10.
Monstervoorbereiding voor analyse van eiwit deamidering is een cruciale stap die aandacht vraagt om het optreden van artefactual deamidatie op Asn residuen op grotendeels voorkomen 1. Hao et al. gevonden dat tryptische digestie onder milde zure pH significant voorkomt verschijning van artefactual deamidatie tijdens monsterbereiding 28. We hebben in dit onderzoek gebruikte onze SDC ondersteunde in oplossing tryptic spijsvertering 13, waarbij een werkwijze van verwerking uitgevoerd bij pH 6 wordt gedragen Anderzijds kan sterker zure omstandigheden de vertering vermogen trypsine uitdaging wanneer de pH beneden 6 29 wordt gehouden. Het aanpakken van dit probleem, zeer recent Liu et al. Een optimale vertering strategie die succesvol spijsvertering en het voorkomen van het optreden van de artefact deamidatie op Asn residuen laat substitueren door trypsine Glu-C bij pH 4,5 30 gemeld. Uitvoering van de spijsvertering methode door Liu et al. 30 analyseren Asn deamidering door LERLIC-MS / MS mogelijke strategie die experimentele verificatie vereist zijn.
Het protocol beschreven in deze video-artikel een groot potentieel om verder te karakteriseren en kwantificeren nog onbekende isovorm verhouding arrays die de betrokkenheid van eiwitten deamidatie bij veroudering en ziekten bij de mens te bepalen. Vachtvendien toepassing van LERLIC-MS / MS in andere biologische achtergronden helpt de mogelijkheden en risico's van eiwitdeamiderende als moleculaire klok modificatie te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de Singapore ministerie van Onderwijs (Tier 2: Grant ARC9 / 15), National Medical Research Council van Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016) en NTU-NHG Aging Research Grant ( Grant ARG / 14017). We willen graag onze dankbaarheid en meest oprechte dank aan Dr. Andrew Alpert en PolyLC team uit te drukken voor vriendelijk voorzag ons van het verpakkingsmateriaal dat mogelijk deze studie gemaakt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
