Summary
Her presenterer vi en trinn-for-trinn-protokollen for lang lengde elektrostatiske avstøtning-hydrofil interaksjonskromatografi-tandem massespektrometri (LERLIC-MS / MS) -metoden. Dette er en roman metode som gjør det mulig for første gang kvantifisering og karakterisering av glutamin og asparagin deamideringsseter isoformer av hagle proteomikk.
Abstract
Karakterisering av protein deamidering er viktig å dechiffrere rollen (e) og potensialene til dette proteinet posttranslasjonell modifikasjon (PTM) i humane patologi, og andre biokjemiske sammenhenger. For å utføre karakterisering av protein deamidering, har vi nylig utviklet en ny lang lengde elektrostatiske avstøtning-hydrofil interaksjonskromatografi-tandem massespektrometri (LERLIC-MS / MS) -metoden som kan skille glutamin (Gin) og asparagin (Asn) isoform produkter av deamidering fra modellforbindelser for å svært komplekse biologiske prøver. LERLIC-MS / MS er derfor den første hagle proteomforskning strategi for separasjon og kvantifisering av GLN deamideringsseter isoformer. Vi viser også, som en nyhet, at prøvebehandlingsprotokollen beskrevet her stabiliserer succinimidet mellomliggende tillater dens karakterisering av LERLIC-MS / MS. Bruk av LERLIC-MS / MS som vist i denne videoen artikkelen kan bidra til å belyse tiden unknown molekylære sammensetninger av protein deamidering. I tillegg gir LERLIC-MS / MS ytterligere forståelse av de enzymatiske reaksjoner som omfatter deamidering i forskjellige biologiske bakgrunn.
Introduction
Deamidering er et protein posttranslasjonell modifikasjon (PTM) som innfører en negativ ladning til selve proteinryggraden gjennom modifikasjon av asparagin (Asn) og / eller glutamin (Gin) residier 1. Denne modifikasjon mens påvirker Asn-restene genererer isomere produkter isoaspartic syre (isoAsp) og n-asparaginsyre (Asp) ved et felles forholdet 3: 1 2. Ikke desto mindre kan dette forhold endres ved intervensjon av reparasjon enzymet L-isoaspartyl metyltransferase (PIMT) 3, 4. På lignende måte, deamidering av Gln-rester genererer isomere gamma-glutaminsyre (γ-Glu) og alfa-glutaminsyre-isoformer (α-Glu) til en forventet 1: 7-forhold 3, 5, men dette forhold kan forskyves ved virkningen av den allestedsnærværende enzymet transglutaminase 2 og andre transglutaminases, inkludert transglutaminase en, en enzyme nylig identifisert som assosiert med ekstracellulære vesikler i hjernen 6.
Opprinnelsen av deamidering kan enten være spontan eller enzymatisk, den førstnevnte er spesielt vanlig på Gln-rester i hvilke transglutaminases og andre enzymer som medierer den inter / intra-molekylære tverrbinding via transamidering (se 3 for nærmere informasjon om Gln transamidering og dens konsekvenser i flere kroniske og dødelige sykdommer hos mennesker). Derfor er deamideringen en PTM som har en avgjørende ettervirkning på strukturen og funksjonen til berørte molekyler 4, 7, 8 og krever en grundig kjemisk karakterisering 3 i lys av dens forskjellige biokjemiske konsekvenser med sin tjeneste som molekylære klokke av aldring 9 .
Selv om deamidering av Asn-restene har vært forholdsvis godt karakterisert ved nedenfra og opp hagle proteomforskning 1, 10, deamidering av Gln-rester fremdeles ikke har en passende karakteristikk metode utover utfordrende analyse av modellforbindelser ved elektron-radikal fragmentering 11. Vi har nylig utviklet en ny ett-dimensjon hagle proteomforskning strategi (LERLIC-MS / MS) 3 som muliggjør separasjon av Gin og Asn deamideringsseter isoformer fra komplekse biologiske prøver og modell-forbindelser i en enkelt analyse. LERLIC-MS / MS er basert på separasjon av tryptiske peptider nedbrytes ved hjelp av en lang lengde (50 cm) ionebytterkolonne (SFO) arbeider på modus elektrostatiske avstøtning-hydrofile interaksjoner kromatografi (ERLIC) og koplet til tandem massespektrometri (LC MS / MS). Denne nye analyse strategi har blitt brukt for å karakterisere og forholdsvis kvantifisere utstrekningen av hver isoaspartatholdig rest i menneskelige hjernen vevf "> 3. Ikke desto mindre vil protokollen beskrevet her gi videobilder av LERLIC-MS / MS forsøkte å studere de særegenheter protein deamidering i den biokjemiske forbindelse av interesse.
ETIKK ERKLÆRING
Alle prosedyrer i denne protokollen er godkjent av Institutional Review Board av Nanyang Technological University i Singapore, og er utført i henhold til de institusjonelle retningslinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Emballasjen Long-lengde Anion-utveksling (LAX) kapillarkolonnen
(Merk: Selv om LAX kolonnen kan være i hjemmet pakket som vi beskriver i denne protokollen, LAX kolonner er også kommersielt tilgjengelig, se tabell over Materialer og reagenser for ytterligere detaljer).
- Suspender 50 mg svak anionbytter pakkemateriale i 3,5 ml pakkingsbuffer (tabell 1) for å fremstille oppslemmingen.
- Monter enden av den kapillære kolonne (50 cm lengde - 200 um innvendig diameter (ID) tubing) ved hjelp av en hunn-til-hunn montering, en ferule og en hunn mutter. Plasser en skjerm 1/16" OD på 1 mikron porestørrelse inne i hunn-til-hunn beslaget (Merk:. Metoden anvendes her skjermen må ha mindre porestørrelse enn partikkelstørrelsen av materialet for å hindre lekkasje av materiale fra kolonne).
- Pakk kapillar med slurryen ved hjelp av en trykkpumpe som drives ved 4500 kPa. (Merk: Pakk column inntil emballasjen er synlig ved oppføring av kolonnen).
- Montere den andre enden av den kapillære kolonne som beskrevet i punkt 1.2.
2. Prøvepreparering
Denne protokollen beskriver anvendelsen av LERLIC-MS / MS for å analysere menneskelige hjerne vev som modell proteome. (Bemerk: Ved å bruke andre vev eller proteomic prøvene, bør prøvefremstillings-prosedyrer bli tilpasset).
- Tissue homogenisering:
en. Vask hjernevev (50 til 100 mg) med 1 x fosfatbufferoppløsning i fem minutter tre ganger.
b. Homogenisering av vevet i forholdet 1: 1: 2,5 vev / metallkuler / SDC homogenisert buffer (tabell 2) forhold (w / w / v) i 5 minutter ved 4 ° C i safe-lock rør med maksimal intensitet ved anvendelse av en vevshomogenisator. (Merk: SDC homogeniseringsbuffer kan inkludere proteaseinhibitorer som tidligere angitt i 3)
c. Sentrifuger vevhomogenatet, oppnådd from det foregående trinn, ved 10 000 x g, 4 ° C i 10 min, og samle supernatanten til et nytt 1,5 ml rør.
d. Gjenta trinnene bc for de resterende pellets og kombinere supernatantene så mange ganger som nødvendig inntil ingen pellet blir observert. (Merk: Hvis man har å gjenta trinnene bc mer enn to ganger, bevege prøve og perlene til en ny sikker låseøret for å hindre tap av prøven under sentrifugeringstrinnet).
e. Kvantifisere proteinkonsentrasjonen av de oppnådde homogenater av Bicinchoninic Acid-analyse (BCA) 12. - Natriumdeoksycholat (SDC) -assisted in-løsning tryptisk fordøying 13 av hjernehomogenater.
en. Legg til en sluttkonsentrasjon på 10 mM ditiotreitol (DTT) (ved bruk av stamløsningen angitt i løsning 5 i tabell 3) til den oppnådde homogenat å initiere reduksjon av protein disulfidbindinger.
b. Inkuber homogenatet i løpet av 30 minutter i et badforhåndsinnstilt ved 60 ° C.
c. Legg til homogenatet en sluttkonsentrasjon på 20 mM jodacetamid (IAA) ved hjelp av lagerløsningen er angitt i Løsning 7 i tabell 4.
d. Inkuber homogenat inneholdende IAA ved romtemperatur i mørket i løpet av 45 min.
e. Fortynn hjernehomogenat to folder ved hjelp av fortynningsbuffer (Løsning 6 i tabell 3).
f. Inkuber prøven for en andre reduksjonstrinn i løpet av 30 minutter ved 37 ° C.
g. Legg sekvense-grade-modifisert trypsin oppløst i Løsning 2 i tabell 2 ved protein-til-enzym-forhold 01:50 (vekt / vekt).
h. Fordøye homogenatet med trypsin ved inkubering over natten ved 30 ° C.
Jeg. Slukke enzymatisk fordøyelse på den neste dag ved tilsetning av 0,5% sluttkonsentrasjon av maursyre (FA). (Merk: Tilsetning av FA vil forårsake utfelling av SDC salter under sure betingelser).
j. Forsiktig vortex prøver som inneholdt SDC fellingsTates.
k. Pellet ned SDC saltene ved sentrifugering av prøvene ved 12 000 x g, 4 ° C i løpet av 10 min.
l. Samle supernatanten og overføring av væsken til en ren nytt rør. (Merk: Vær forsiktig under pipettering av dette trinnet for å ikke re-suspendere og / eller samle salter fra SDC pellet.)
m. Re-oppløse SDC pellet i SDC re-oppløsende buffer (tabell 5) under kraftig virvling i 1 min.
n. Gjenta trinn jl to ganger for å utvinne utfelte peptider og kombinere supernatantene. (Merk:. Se Serra et al 2016 13 for ytterligere detaljer om SDC-assistert in-løsning tryptisk fordøying protokollen tilpasses her.) - Avsalting av tryptiske fordøyd prøver.
en. Utføre avsalting av fordøyde prøver ved å bruke en 1 g C-18 patron. (Merk: Bruken av et stort volum patron (5 ml), uavhengig av mengden av protein fremstilt garanterer riktig rengjøring av gjenværende SDC salter i prøvene førLC-MS / MS-injeksjon).
b. Utføre kondisjonering av 1 g C-18 patron med 5 ml acetonitril (ACN).
c. Passere 5 ml opprydding buffer (tabell 6) ved det kondisjonerte 1 g C-18-patron for å fjerne eventuelt gjenværende organisk oppløsningsmiddel.
d. Laste prøven til 1 g C-18-patron.
e. Utfør 3 - 5 opprenskningstrinn for å prøven i 1 g C-18 kolonne ved anvendelse av 5 ml av rensebuffer hvert trinn.
f. Eluer Avsaltet peptidene fra 1 g C-18-patron ved anvendelse av 5 ml elueringsbuffer (tabell 7).
g. Tørk de eluerte peptider i en vakuum-konsentrator.
c. Rekonstituer den tørkede prøve i et sluttvolum på 200 ul elueringsbuffer. (Merk:. Bruk sterk og lang (> 10 minutter), etterfulgt av vortex-blanding påfølgende ultralydbehandling i et lydbad i løpet av 30 minutter til fullstendig re-suspendere de tørkede peptider i injeksjonsbuffer)
d. Juster injeksjonsvolum av prøven for LERLIC-MS / MS for å anaLyze mellom 1 og 3 pg protein.
3. En-dimensjon LERLIC-MS / MS-separasjon
- Liquid Chromatography betingelser:
Mobile faser:
A: 0,1% FA i vann (tabell 8).
B: 0,1% FA i ACN (tabell 9)
Strømningshastighet: 0,4 mL / min
Kolonne: LAX kapillar kolonne (50 cm lengde - 200 um ID)
en. Brukes følgende 1,200 min-gradient: 95% B i 40 min, 95 - 85% B i 434 minutter 85 - 70% B i 522 minutter, 70-35% B i 124 min, 35-3% B i 45 min , isokratisk ved 3% B i 5 minutter med 3 - 95% B i løpet av 7 minutter og holdt isokratisk ved 95% B i 23 min.
b. Utføre separasjon av peptider ved hjelp av kapillar-LAX som angitt i Serra & Gallart-Palau et al. 3 ved hjelp av ultra-høytrykksvæskekromatografi. - Massespektrometer konfigurasjon:
en. Konfigurer skannehendelsesdetaljene for å utføre datainnsamling alternerende between fullstendig Fourier transform-massespektrometri (FT-MS) og Fourier-transformasjonen-tandem massespektrometri (FT-MS / MS) med de følgende parametere:
A.1. Datainnsamling modus: positiv
A.2 FT-MS parametere:
Masseområde: 350 - 2.000 m / z
Oppløsning: 60000
Microscans: 1 per spektrum
Automatisk forsterkningskontroll: 1 x 10 6
A.3 FT-MS / MS parametere:
Fragmentering modus: Høy energi kollisjons dissosiasjon (HCD)
A.4 Masseområde: 150 - 2.000 m / z
A.5 Oppløsning: 30000
A.6 Top N ioner: 10
Microscans: 1 per spektrum
Lad tilstand:> 2+
Isolering bredde: 2 Da
A.7 Automatisk forsterkningskontroll: 1 x 10 6
b. Utføre massespektrometri påvisning av peptider som er anført i 3 under anvendelse av en orbitrap massespektrometer utstyrt med en nanoelectrospray ione-kilde som arbeider ved 1,5 kV.
4. Data Analysis
- Utfør beskytti databasen søke LERLIC-MS / MS innhentet data ved hjelp av følgende parametere ved hjelp av en bestemt proteomikk programvare: (Merk: Se 3 for ytterligere detaljer.)
en. Ion toleranse: 10 ppm
b. Fragment ion toleranse: 0.05 Da
c. Falsk Discovery Rate (FDR): 1%
d. Database: Uniprot Menneskelig database
e. Faste modifikasjoner: Carbamydomethylation ved Cys
f. Variable modifikasjoner (hvis det er nødvendig ved den programvare): Oksidasjon (Met), Deamidering (Asn og Gin). - Trygg karakterisering og kvantifisering av isomere deamiderte produkter i LERLIC-MS / MS-data:
en. Eksport database søkeresultater fra LERLIC-MS / MS til en erte regnearket programvare for analyse.
b. Finne og utvinne hele listen over deamiderte peptider og deres ikke-deamiderte kolleger.
c. Ved hjelp av en liste av de oppnådde peptider som referanse, ekstrahere ionekromatogrammer (XICs) av disse peptidene med en egnet programvare ved 5 ppm av massen toleranse. (Merk:Se 3 for ytterligere informasjon om programvaren som brukes til utvinning av XICs.)
d. Visuelt inspisere de oppnådde XICs for å identifisere den separerte dobbelt-topp eluering av de isomere produkter som antydet tre. (Merk: Isomere produkter av disse peptider er identifisert ved MS / MS-nivå kan lett finnes styres ved tilstedeværelsen av to forskjellige oppholdstider i databasen søkeresultatet.)
e. Relativ kvantifisering av de isomere produktene fra hver deamidert site / peptid har til å bli utført på grunnlag av toppområdet til hver identifisert isomer i de oppnådde XICs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deamidering av Gln og Asn-restene er ansett som en degenerativ proteinmodifisering (DPM) implisert i en rekke kroniske og dødelige sykdommer 14. Det er blitt vist at denne PTM kan forutsi halveringstid og nedbrytnings tilstander av antistoffer og andre molekyler i det menneskelige legeme og lignende biologiske bakgrunn 1, 15. Betydningen av protein deamidering, faktisk går utover biomedisinsk sammenheng, derfor denne endringen er til stede i ulike proteom 16, 17 og noen studier har vist potensialet i deamidering på den tiden til å utføre nøyaktig datering av malerier og arkeologiske gjenstår 18, 19 . Selv betydning og funksjonaliteten til proteinet deamidering i ulike bakgrunner har blitt bekreftet i lang tid,re var inntil meget nylig en mangel på teknisk fremskritt på den måten å oppnå en inngående karakterisering av denne PTM 3.
Anvendelse av LERLIC-MS / MS 3, som vist i figur 1, gir for første gang og i en enkelt kjøring løst separasjon av Gin og Asn deamidert isoformer fra komplekse proteom eller modellforbindelser selv for de peptider som viser to uavhengige Asn og Gin deamidert proteoforms.
Figur 1: Diagram av LERLIC-MS / MS-arbeidsflyt for separasjon og kvantifisering av Gin og Asp-deamidering produkter fra Prøver som etter Shotgun Proteomics. LERLIC-MS / MS innebærer proteinekstraksjon og enzymatisk spalting forut for ett-dimensjon separasjon av peptider ved hjelp av LC-MS / MS ved å bruke LAX kapillar-kolonne. Analysis av XICs tillate identifisering av deamideringsseter isomere produkter eluerte ved forskjellige oppholdstider på grunnlag av deres forskjellige surhet 3, 20, 21. MS / MS tillater diskriminering mellom deamiderte og ikke-deamiderte peptider og trygg identifisering av deamidert rest. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Enzymatisk modifiserte mellomliggende Gln-rester av transamideringsproduktet viser en invertert γ / α-glutamyl-forhold (figur 2) kan bli avdekket og karakterisert ved LERLIC-MS / MS, som kan ha betydelig innvirkning på studiet av proteinopathy i neurodegenerative sykdommer 3, 22, 23 , 24. Videre, som tidligere er rapportert i Serra & Gallart-Palau 2016, flere ukjente PIMT substratproteiner som representerer en invertert isoAsp / Asp-forholdet i deamiderte Asn-restene kan også bli identifisert i humane vev med LERLIC-MS / MS tre.
Figur 2: Inspeksjon av XICs og identifisering av Double Retention Times på MS / MS nivå for deamiderte peptider Tillat Karakterisering av Gin og Asn deamiderte isomerer og identifikasjon av produkter fra Crucial enzymatiske reaksjoner som foregår i Deamidering. en. Detalj av XIC viser de to topper tilsvarende de γ / α-glutamyl-isomerer av peptidet FQMPDQGMTSADDFFEQ # GTK fra hjerneprotein DPYL2 Dihydropyrimidinase relatert protein 2. Den inverterte γ / α-glutamyl-forhold detected at peptidet indikerer den potensielle innblanding av γ-glutamyl-inneholdende specie i transglutamination reaksjonen som en transglutaminase γ-glutamyl-mellomprodukt. Den deamiderte Resten ble bekreftet ved MS / MS på begge oppholdstider, f. ved 389,1 min som tilsvarer den α-glutamyl-inneholdende peptid og c. ved 401,4 min som tilsvarer den γ-glutamyl-inneholdende peptid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som en nyhet av dette papir, har vi funnet at LERLIC-MS / MS tillater karakterisering av succinimid-mellomproduktet (figur 3). Bruken av mild sur pH i løpet av prøvebehandling stabiliserer succinimid mellomprodukt i modifisert Asn-restene 25. Derfor tillater LERLIC-MS / MS proteom- omfattende studie av succinimide mellomprodukt, en labil og dårlig forstått modifisering med store fysiologiske og patologiske konsekvenser 26.
Figur 3: Identifikasjon av Succinimid mellomprodukt i Asn-restene ved LERLIC-MS / MS. en. Spektrum for Asn-deamidert peptid YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR fra hjernen protein ALDO C Fructose-aldolase C. Deamidert rest er angitt som Deam-Asn. b. Spektrum av peptidet YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, som i dette tilfellet viser en masseforskyvning på -17 Da ved den tidligere deamidert Asn rest (Scc-Asn) på grunn av ammonium tapet som finner sted under dannelse av succinimid-mellomproduktet. Klikk her for å se en større versjon av ther figur.
| Komponent | Mengde for 100 ml |
| isopropanol | 90 mL |
| Vann | 10 mL |
Tabell 1. Emballasje buffersammensetning (90% isopropanol).
| Løsning 1: 1 M ammoniumacetat. | |
| Komponent | Mengde for 50 mL |
| ammoniumacetat | 3,86 g |
| Vann (fyll opp til 50 ml) | ~ 50 mL |
| Løsning 2: 100 mM ammoniumacetat. | |
| Komponent | Mengde for 50 mL |
| løsning 1 | 5 mL |
| Vann | 45 mL |
| Løsning 3: 10% Sodium deoxycholate. | |
| Komponent | Mengden for 1 mL |
| natriumdeoksycholat | 0,1 g |
| Vann | 1 mL |
| Løsning 4: SDC homogenisert buffer (100 mM ammoniumacetat inneholdende 1% natriumdeoksycholat). | |
| Komponent | Mengde for 10 mL |
| løsning 2 | 9 mL |
| løsning 3 | 1 mL |
Tabell 2. SDC homogenisert buffer Sammensetning (100 mM Ammoniumacetat inneholdende 1% natriumdeoksycholat). Forbered aksje solusjon av 1 M ammoniumacetat (oppløsning 1), og fortynnet for å få 100 mM ammoniumacetat (oppløsning 2). I tillegg fremstille den stamløsning på 10% natriumdeoksycholat (oppløsning 3). Klargjør SDC homogeniseringsbufferen som beskrevet i Løsning 4.
| Løsning 5: 1 M DTT | |
| Komponent | Mengde for 10 mL |
| ditiotreitol | 77 mg |
| Løsning 2 (se tabell 2) | 0,5 mL |
| Løsning 6: fortynningsbuffer | |
| Komponent | Mengde for 10 mL |
| løsning 5 | 0,1 mL |
| Løsning 2 (se tabell 2) | 9,9 mL |
Tabell 3. fortynningsbuffer Sammensetning (100 mM Ammoniumacetat inneholdende 10 mM ditiotreitol (DTT)). Klargjør stamløsning av 1 M DTT (oppløsning 5) og deretter fremstille den fortynningsbuffer som beskrevet i Løsning 6.
| Løsning 7: 1 M IAA | |
| Komponent | Mengde for 10 mL |
| IAA | 93 mg |
| Løsning 2 (se tabell 2) | 0,5 mL |
Tabell 4. Alkylering buffersammensetning (100 mM Ammonium ester, som inneholder 20 mM Jodacetamid (IAA)). Klargjør stamløsning av 1 M IAA (Løsning 7).
| Komponent | Mengde for 50 mL |
| ammoniumhydroksid | 0,25 mL |
| Vann | 24.75 mL |
Tabell 5. SDC oppløst buffer Sammensetning (0,5% ammoniumhydroksid).
| Komponent | Mengde for 100 ml |
| trifluoreddiksyre | 0,1 mL |
| Vann | 99,9 mL |
Tabell 6. Opprensking buffer (0,1% trifluoreddiksyre).
| Komponent | Mengde for 100 ml |
| acetonitril | 75 mL |
| maursyre | 0,1 mL |
Tabell 7. elueringsbuffer (75% acetonitril, 0,1% maursyre).
| Komponent | Beløpet for 1000 ml |
| maursyre | 1 mL |
| Vann | 999 mL |
Tabell 8. Mobile Fase A sammensetning.
| Komponent | Beløpet for 1000 ml |
| maursyre | <td> 1 mL|
| acetonitril | 999 mL |
Tabell 9. Mobile Fase B sammensetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne video-artikkelen presenterer vi en trinn-for-trinn-protokollen for LERLIC-MS / MS 3, en fremgangsmåte utføre grundig karakterisering og for nøyaktig å bestemme graden av protein deamidering og de enzymatiske prosesser som er involvert i denne proteinmodifisering. LERLIC-MS / MS er basert på bruken av en lang lengde (50 cm) LAX henhold til prinsippet om elektrostatiske avstøtning-hydrofile interaksjoner kromatografi (ERLIC) 27. Bruken av en lang lengde kolonne, slik det er vist i vårt studium 3, maksimerer potensialet i ERLIC til separate peptider i henhold til deres isoelektriske punkt 27.
LERLIC-MS / MS representerer en ny hagle en-dimensjonal separasjon strategi, en arbeidsflyt som sparer tid-på-hendene under prøvebehandling, selv om det krever en 1,200 min gradient som indikert i tre for å oppnå optimale resultater med svært komplekse proteom. En 60 min gradient i LERLIC-MS / MS kan også oppnå optimal separasjon av GLN deamideringsseter isoformer på modellforbindelser for første gang i hagle proteomforskning 3. Basert på disse to søknader, spekulere vi at andre dimensjon separasjon utføres ved LAX kapillar kan være koplet til en første dimensjon revers-fase-kromatografi under et flerdimensjonal kromatografi tilnærming for analyse av prøver av middels kompleksitet, en arbeidsflyt som tidligere ble brukt av vår gruppe 10.
Prøvepreparering for analyse av protein deamidering er et viktig trinn som krever nøye oppmerksomhet for å forhindre forekomsten av arte deamidering av Asn-restene i en stor utstrekning 1. Hao et al. funnet at tryptisk fordøying under svak sur pH-verdi hindrer betydelig tilsynekomst av arte deamidering under tillagingen 28. Vi har brukt i denne studien vår SDC-assistert in løsning forsøkptic fordøyelse 13, en metode hvor prøven behandlingen utføres ved pH 6. På den annen side, kan sterkere sure betingelser utfordre fordøyelse evne trypsin når pH holdes lavere enn 6. 29. Ta opp dette problemet, ganske nylig Liu et al. har rapportert en optimal fordøyelse strategi som tillater vellykket fordøyelse og forebygging av forekomsten av en kunstig deamidering av Asn-restene ved substituering av trypsin ved Glu-C ved pH 4,5 30. Gjennomføring av fordøyelsen metoden som er angitt av Liu et al. 30 å analysere Asn deamidering av LERLIC-MS / MS kan være en potensiell strategi som krever eksperimentell verifisering.
Protokollen beskrevet i denne video-artikkelen har et stort potensial for ytterligere å karakterisere og kvantifisere i dag ukjente isoform forholds matriser som definerer involvering av protein deamidering i aldring og humane sykdommer. Pelsthermore, anvendelse av LERLIC-MS / MS i andre biologiske bakgrunn vil bidra til å bestemme potensialer og risikoen for deamidering protein som en molekylær klokke modifikasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra Singapore Ministry of Education (Tier 2: Grant ARC9 / 15), National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016), og NTU-NHG Aging stipend ( Grant ARG / 14017). Vi ønsker å uttrykke vår takknemlighet og mest oppriktige takk til Dr. Andrew Alpert og PolyLC team for vennlig gitt oss med den originale emballasjen gjort mulig denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
