Summary
ここでは、長尺の静電反発力 - 親水性相互作用クロマトグラフィー - タンデム質量分析（LERLIC-MS / MS）方法のステップバイステップのプロトコルを提示します。これは、ショットガンプロテオミクスによってグルタミンとアスパラギン脱アミド化アイソフォームを初めて定量および特徴付けのために有効に小説の方法論です。
Abstract
タンパク質脱アミド化の特性は、人間の病理および他の生化学的文脈におけるこのタンパク質の翻訳後の改変（PTM）の役割（複数可）と潜在的可能性を解読することが不可欠です。タンパク質の脱アミド化の特徴付けを行うために、我々は最近、グルタミン（Glnで）およびアスパラギン（ASN）アイソフォームを分離することができる新規な長尺静電反発力、親水性相互作用クロマトグラフィー - タンデム質量分析法（LERLIC-MS / MS）法を開発しました高度に複雑な生物学的サンプルにモデル化合物から脱アミドの製品。 LERLIC-MS / MSは、従って、Glnの脱アミド化アイソフォームの分離および定量のための最初のショットガンプロテオミクス戦略です。我々はまた、ここで概説試料処理プロトコルはLERLIC-MS / MSによって、その特徴付けを可能スクシンイミド中間体を安定化すること、ノベルティとして、実証します。この動画の記事に示されているようLERLIC-MS / MSの応用は、現在unknowを解明するのに役立つことができますタンパク質の脱アミドのN分子アレイ。また、LERLIC-MS / MSは、異なる生物学的背景に脱アミド化を包含する酵素反応のさらなる理解を提供します。
Introduction
脱アミド化は、タンパク質の翻訳後修飾アスパラギン（ASN）および/またはグルタミン（Glnの）残基1の変形を介してタンパク質主鎖に負電荷を導入する（PTM）です。 2：1の比率のAsn残基に影響を与える一方、この変形は、一般的な3で異性体生成物イソアスパラギン酸（isoAsp）およびN -アスパラギン酸（ASP）を生成します。それにもかかわらず、この比率は、修復酵素のL-イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ（PIMT）3、4の介入によって改変することができます。同様のGln残基の脱アミド化が期待1に異性体-γ-グルタミン酸（γ-Gluで）およびα-グルタミン酸アイソフォーム（α-Gluの）を生成する：7比3、 図5に示すように、この比は、の作用によってシフトさせることができますユビキタス酵素トランスグルタミナーゼ2及び他のトランスグルタミナーゼを含むトランスグルタミナーゼ1、E脳6の細胞外小胞に関連付けられているようnzyme最近同定されました。
脱アミド化の起点が自発的または酵素的のいずれかであることができ、前者は、トランスグルタミナーゼたのGln残基で特に一般的であり、他の酵素は、アミド交換を介して、内/分子間架橋を媒介する（いくつかの慢性中のGlnアミド交換とその影響について詳細については3を参照致命的なヒト疾患）。したがって、脱アミド化は影響を受け分子4、7、8の構造および機能に重大な波及を有し、9老化の分子時計としてのサービスなど、多様な生化学的結果に照らして、深い化学的特性3を必要とPTMであります。
アスパラギン残基の脱アミド化はされているが比較的ボトムアップショットガンプロテオミクスによって十分に特徴付け1、10、のGln残基の脱アミド化は、依然として電子系ラジカルフラグメンテーション11によってモデル化合物の困難な分析を越えて適切な特徴付け方法を持ちません。我々は最近、1回の分析で複雑な生物学的サンプルとモデル化合物からのGlnおよびAsn脱アミド化アイソフォームの分離を可能にする新規な一次元ショットガンプロテオミクス戦略（LERLIC-MS / MS）3を開発しました。 LERLIC-MS / MSは、長尺（50センチメートル）静電反発 - 親水性相互作用クロマトグラフィー（ERLIC）モードで作業イオン交換カラム（LAX）を用いてトリプシン消化ペプチドの分離に基づいており、タンデム質量分析に連結されています（LC- MS / MS）。この新しい分析戦略を特徴づけると、比較的人間の脳組織内の各脱アミド残基の度合いを定量するために使用されてきましたF "> 3。それにもかかわらず、ここで説明したプロトコルは、関心の生化学的文脈においてタンパク質脱アミド化の特殊性を研究することを目的としたLERLIC-MS / MSのビデオ画像を提供します。
倫理STATEMENT
このプロトコルのすべての手順は、シンガポールのナンヤン工科大学の施設内倫理委員会によって承認されていると制度のガイドラインに基づいて行われてきました。
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Protocol
ロング丈陰イオン交換（LAX）キャピラリカラムをパッキング1
（注：LAX列は家庭内、我々はこのプロトコルで説明したように充填し、LAX列も市販されていることができるが、詳細については材料および試薬の表を参照のこと）。
- スラリーを調製するために緩衝液 （ 表1） パッキングの3.5 mLの弱い陰イオン交換充填物質50mgを停止します。
- メス - メス金具、フェルールと雌ナットを使用して、 - キャピラリーカラム（200μmの内径（ID）チュービング長さ50cm）の端部を組み立てます。メス - メス継手内部の1ミクロンの細孔サイズの画面1/16" ODを置きます（注：ここで使用し、画面からの材料の漏れを防止するために梱包材の粒子径よりも小さな細孔径を持っている必要がありますカラム）。
- 4,500 psiで作動圧ポンプを用いてスラリーを毛細管を詰めます。 （注意：coluを梱包MN充填材がカラムのエントリに表示されるまで）。
- 点1.2に記載されているように、キャピラリカラムのもう一方の端を組み立てます。
2.試料の調製
このプロトコルは、モデルプロテオームとしてヒト脳組織を分析するためにLERLIC-MS / MSのアプリケーションの概要を示します。 （注：他の組織又はプロテオミクスサンプルを使用する場合には、サンプル調製手順を適合させるべきです。）
- 組織均質化：
A。三回5分間、1×リン酸緩衝溶液で洗浄脳組織（50から100mg）。
B。 1：1の組織をホモジナイズ2.5組織/金属ビーズ/ SDC均質化緩衝液 （ 表2）の比（W / w / v）の組織ホモジナイザーを使用して、最大強度で安全ロック管中、4℃で5分間。 （注：以前3に示すようにSDC均質化緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤を含んでいてもよいです）
C。あちこち得られ、組織ホモジネートを遠心10,000×gで、10分間、4℃で、前のステップを、mおよび新しい1.5mlチューブに上清を集めます。
D。残りのペレットのためのBCの手順を繰り返し、何のペレットが観察されなくなるまで、必要に応じて何度でも上清を兼ね備えています。 （注意：あなたが2倍以上のBCの手順を繰り返している場合は、遠心分離工程中にサンプルの損失を防ぐために、新たな安全ロックチューブにサンプルとビーズを移動させます）。
電子。ビシンコニン酸アッセイ（BCA）12により得られたホモジネートのタンパク質濃度を定量します。 - デオキシコール酸ナトリウム（SDC）は、脳ホモジネートの溶液内トリプシン消化13を -assisted。
A。タンパク質ジスルフィド結合の還元を開始するために得られたホモジネートに（ 表3の溶液5に示されているストック溶液を使用して）、10mMのジチオスレイトール（DTT）の最終濃度を加えます。
B。浴中で30分の間、ホモジネートをインキュベート60°Cで予備設定。
C。ホモジネートを、表4の液7に示されているストック溶液を用いて20mMのヨードアセトアミド（IAA）の最終濃度を加えます。
D。 45分間暗所で室温でIAAを含有ホモジネートをインキュベートします。
電子。脳ホモジネート希釈緩衝液を用いた2折り目（ 表3の溶液6）を希釈します。
F。 37℃で30分の間に第2還元工程のためにサンプルをインキュベートします。
グラム。 （w / w）のタンパク質対酵素比1：50で表2の溶液2中に溶解し、配列決定グレードの修飾トリプシンを加えます。
時間。 30°Cで一晩インキュベートすることによりトリプシンでホモジネートを消化。
私。ギ酸（FA）の0.5％の最終濃度を添加することにより、翌日に酵素消化をクエンチします。 （注意：FAの添加は酸性条件下でSDC塩の沈殿の原因となります。）
J。ゆっくりSDC precipiを含むサンプルをボルテックスtates。
K。 10分の間、12,000×gでサンプルを遠心分離することにより、SDC塩をダウンペレット4°C。
リットル。上清を収集し、きれいな新しいチューブに液体を移します。 （注：していない再懸濁および/またはSDCペレットから塩を収集するために、この段階のピペット操作の際に注意してください。）
メートル。 1分間激しくボルテックス下SDC再溶解バッファー （ 表5）におけるSDCペレットを再溶解させます。
n個。手順を繰り返し、沈殿したペプチドを回収し、上清を組み合わせることが二回JL。 （注：セラら見るここに適合SDC支援溶液内トリプシン消化プロトコルに関するさらなる詳細については、2016年13。）。 - トリプシンの脱塩は、サンプルを消化しました。
A。 1グラムC-18カートリッジを用いて消化した試料の脱塩を行います。 （注：独立してサンプル中の残りのSDC塩の保証適切な洗浄前に得られたタンパク質の量の大きな体積カートリッジ（5 mL）を使用しLC-MS / MSに注入します。）
B。アセトニトリル5ml（ACN）と1グラムC-18カートリッジのコンディショニングを行います。
C。残りの有機溶媒を除去するために条件付け1グラムC-18カートリッジによりクリーンアップバッファ （ 表6）を5mLを渡します。
D。 1グラムC-18カートリッジにサンプルをロードします。
電子。 クリーンアップバッファ 5mLの各ステップを使用して、1グラムC-18カラムで試料に5クリーンアップ手順- 3を実行します。
F。 溶出緩衝液の5mLの（ 表7）を使用して1グラムC-18カートリッジから脱塩したペプチドを溶出させます。
グラム。真空濃縮で溶出されたペプチドを乾燥させます。
C。 溶出緩衝液の200μLの最終体積で乾燥サンプルを再構成します。 （注：完全に注入緩衝液中で乾燥したペプチドを再懸濁するために30分の間、超音波処理浴内の後続の超音波処理に続いて使用活発と長い（> 10分）ボルテックスします。）
D。 ANAにLERLIC-MS / MSのための試料の注入量を調整しますタンパク質の1〜3μgの間lyze。
3.一次元LERLIC-MS / MS分離
- 液体クロマトグラフィー条件：
移動相：
A：水中の0.1％FA（ 表8）。
B：0.1％ACNでFA（ 表9）
流量：0.4μL/分
コラム：LAXのキャピラリカラム（長さ50cm - 200μmのID）
A。 - 434分間、85％のB、85から522分間、70％B、70から124分間、35％B 35 - 45分間、3％B 40分95％B、95：次の1200分の勾配を使用し、5分間、3％B、3での定組成 - 7分かけて95％Bおよび23分間、95％Bでの定組成保ちます。
B。セラ・Gallart-パラオらに示されているようにLAXキャピラリーを用いたペプチドの分離を行います。 3超高圧液体クロマトグラフィーを用いて。 - 質量分析計の設定：
A。 betweを交互にデータ収集を実行するためにスキャンイベントの詳細を設定しますENフルフーリエ変換質量分析（FT-MS）及びフーリエ変換 - タンデム質量分析（FT-MS / MS）を以下のパラメータで：
A.1。データ取得モード：正
A.2 FT-MSパラメータ：
質量範囲：350 - 2000メートル/ Z
解像度：60,000
マイクロスキャン：スペクトルあたり1
自動ゲイン制御：1×10 6
A.3 FT-MS / MSパラメータ：
断片化モード：高エネルギー衝突解離（HCD）
A.4質量範囲：150 - 2000メートル/ Z
A.5解像度30,000
10：トップNイオンA.6
マイクロスキャン：スペクトルあたり1
状態を充電してください：> 2+
分離幅：2ダ
A.7自動ゲイン制御：1×10 6
B。 1.5キロボルトで働くナノエレクトロスプレーイオン源を備えたオービトラップ質量分析計を用いて3に示されるように、ペプチドの質量分析検出を行います。
4.データ解析
- proteを実行しますLERLIC-MS / MSにデータベース検索で特定プロテオミクスソフトウェアを使用して、以下のパラメータを使用してデータを得た：（注：詳細については3を参照）。
A。イオン許容度：10 ppmの
B。フラグメントイオンの許容範囲：0.05ダ
C。偽発見率（FDR）：1％
D。データベース：UniProtの人間のデータベース
電子。修正された修正：CysでのCarbamydomethylation
F。可変修飾（ソフトウェアにより必要な場合）：酸化（MET）、脱アミド化（AsnおよびGlnの）。 - 自信特性とLERLIC-MS / MSデータで異性脱アミド産物の定量：
A。分析のためのspreedsheetソフトウェアにLERLIC-MS / MSからエクスポートしたデータベースの検索結果。
B。脱アミド化ペプチドおよびその非脱アミド化対応のリスト全体を検索して抽出します。
C。参照として得られたペプチドのリストを使用して、質量公差の5 ppmのappropiateソフトウェアを使用して、これらのペプチドのイオンクロマトグラム（XICs）を抽出します。 （注意：XICsの抽出に使用されているソフトウェアの更なる詳細については3を参照してください。）
D。視覚的に示されている3などの異性体生成物の分離された二重ピーク溶出を識別するために、得られたXICsを調べます。 （注：MS / MSレベルで同定されたペプチドの異性体生成物を容易にデータベース検索結果内の2つの異なる保持時間の存在によって導か見出すことができます。）
電子。各脱アミド化部位/ペプチドからの異性体生成物の相対的定量化は、得られたXICsで識別された各異性体のピーク面積に基づいて行わなければなりません。
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Representative Results
GlnおよびAsn残基の脱アミド化は、いくつかの慢性および致命的な病気14に関与する変性タンパク質修飾（DPM）であると考えられます。このPTMは、人体と同様の生物学的背景1、15に抗体および他の分子の半減期および分解状態を予測できることが実証されています。タンパク質脱アミド化の重要性は、実際には、生物医学的な文脈を超え、したがって、この変更は、17の多様なプロテオーム16中に存在し、いくつかの研究は、絵画や遺跡18の正確なデートを実行する時に脱アミド化の可能性を実証してきた、19 。重要性と多様な背景中のタンパク質脱アミド化の機能は、長い時間のために確認されているが、再ごく最近まで、このPTM 3の詳細な特性を達成するための方法に関する技術的な進歩の欠如でした。
図1に示すようにLERLIC-MS / MS 3のアプリケーション、 初めて提供およびGlnおよびAsnの単一ラン分解分離にも二つの独立AsnおよびGlnの脱アミド化を示すこれらのペプチドのための複雑なプロテオームまたはモデル化合物からアイソフォームを脱アミド化proteoforms。
図1：ショットガンプロテオミクスによるコンプレックスサンプルからの分離およびGln及びAsp脱アミド化産物の定量のためにLERLIC-MS / MSワークフローの図です。 LERLIC-MS / MSは、従来LAXキャピラリカラムを用いたLC-MS / MSによるペプチドの一次元分離にタンパク質抽出及び酵素消化を伴います。アナXICsの溶解は、それらの異なる酸度3、20、21に基づいて、異なる保持時間で溶出した脱アミド異性体生成物の同定を可能にします。 MS / MSは、脱アミド化および非脱アミド化ペプチドおよび脱アミド化残基の確信識別間の識別を可能にします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
神経変性疾患3における蛋白質症の研究に重要な意味を持っているかもしれない逆γ/αグルタミル比（ 図2）が発見とLERLIC-MS / MSによって特徴づけることができる表示アミド交換の酵素的に修飾された中間体のGln残基、22、23 、 24。以前セラ＆Gallart-パラオ2016年に報告されているようにまた、脱アミド化のAsn残基が反転isoAsp / ASP比を示すいくつかの未知のPIMT基質タンパク質はまたLERLIC-MS / MS 3によってヒト組織中で同定することができます。
図2： XICsおよび脱アミド化ペプチドのMS / MSレベルでのダブル保持時間の同定の検査は、脱アミド化で行わ決定的な酵素反応からのGlnおよびAsn脱アミド化異性体および製品の同定のキャラクタリゼーションを許可します。 A。脳タンパク質DPYL2からペプチドFQMPDQGMTSADDFFEQ＃1 GTKのγ/α-グルタミル異性体に対応する2つのピークを示したXICの詳細は、関連タンパク質2反転γ/α-グルタミル比detecteのジヒドロピリミジナーゼそのペプチド中のDは、トランスグルタミナーゼγグルタミル中間体としてグルタミン転移反応におけるγグルタミル含有種の潜在的な含意を示しています。脱アミド化残基は、両方の保持時間、BのMS / MSにより確認しました。 389.1分でα-グルタミル含有ペプチド及びCに対応します。 401.4分でγグルタミル含有ペプチドに対応します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
この論文の新規性として、我々はLERLIC-MS / MSは、スクシンイミド中間体（ 図3）の特徴付けを可能にすることを見出しました。サンプル処理中弱酸性のpHの使用は、改変のAsn残基25におけるスクシンイミド中間体を安定化させます。したがって、LERLIC-MS / MSはsucciniのプロテオームワイドな研究を可能に重要な生理学的および病理学的影響26と不安定とよくわかっていない変形、中間体アミド。
図3：LERLIC-MS / MSによってアスパラギン残基におけるスクシンイミド中間体の同定。 A。アスパラギンの脱アミド化スペクトルC.残基アルドラーゼ脳タンパク質ALDO Cフルクトース - ビスリン酸からペプチドYASICQQN＃GIVPIVEPEILPDGDHDLKRを脱アミド化はDEAM、アスパラギンとして示されています。 B。この場合、以前に起因スクシンイミド中間体の形成中に行わアンモニウム損失にAsn残基（SCC-Asnで）を脱アミド化で-17ダの質量シフトを示すペプチドYASICQQN＃GIVPIVEPEILPDGDHDLKR、スペクトル。 目の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図です。
| 成分 | 100ミリリットルのための金額 |
| イソプロパノール | 90ミリリットル |
| 水 | 10mLの |
表1パッキング緩衝液組成（90％イソプロパノール）。
| 溶液1：酢酸アンモニウムの1 M。 | |
| 成分 | 50mLのための量 |
| 酢酸アンモニウム | 3.86グラム |
| 水（50 mLに作ります） | 〜50mLの |
| 溶液2：酢酸アンモニウムの100 mmです。 | |
| 成分 | 50mLのための量 |
| ソリューション1 | 5ミリリットル |
| 水 | 45ミリリットル |
| 解決策3：10％デオキシコール酸ナトリウム。 | |
| 成分 | 1mLのための量 |
| デオキシコール酸ナトリウム | 0.1グラム |
| 水 | 1mLの |
| 溶液4：SDC均質化緩衝液（1％デオキシコール酸ナトリウムを含む100mM酢酸アンモニウム）。 | |
| 成分 | 10mLのための量 |
| 解決策2 | 9mLの |
| 解決策3 | 1mLの |
表2 SDC均質化緩衝液組成物（1％デオキシコール酸ナトリウムを含む100mM酢酸アンモニウム）。在庫ソルを準備酢酸アンモニウム（溶液1）の1 Mのンと酢酸アンモニウム（溶液2）の100mMのを取得するために希釈します。また、10％デオキシコール酸ナトリウム（溶液3）のストック溶液を調製します。溶液4で説明したようにSDC均質化緩衝液を調製します。
| 解決策5：1 M DTT | |
| 成分 | 10mLのための量 |
| ジチオスレイトール | 77 mgの |
| ソリューション2（ 表2を参照してください） | 0.5mLの |
| 解決策6：希釈バッファー | |
| 成分 | 10mLのための量 |
| ソリューション5 | 0.1mLの |
| ソリューション2（ 表2を参照してください） | 9.9 mLの |
表3に希釈緩衝液組成（10mMのジチオスレイトール（DTT）を含有する100mMの酢酸アンモニウム）。 1 M DTT（溶液5）のストック溶液を調製し、続いて溶液6に詳述されるように希釈緩衝液を調製します。
| 解決策7：1 M IAA | |
| 成分 | 10mLのための量 |
| IAA | 93 mgの |
| ソリューション2（ 表2を参照してください） | 0.5mLの |
表4アルキル化緩衝液組成（20mMのヨードアセトアミド（IAA）を含有する100mMの酢酸アンモニウム）。 1 M IAA（溶液7）のストック溶液を準備します。
| 成分 | 50mLのための量 |
| 水酸化アンモニウム | 0.25mLの |
| 水 | 24.75 mLの |
表5 SDC再溶解緩衝液組成（0.5％水酸化アンモニウム）。
| 成分 | 100ミリリットルのための金額 |
| トリフルオロ酢酸 | 0.1mLの |
| 水 | 99.9 mLの |
表6.クリーンアップ緩衝液（0.1％トリフルオロ酢酸）。
| 成分 | 100ミリリットルのための金額 |
| アセトニトリル | 75mLの |
| ギ酸 | 0.1mLの |
表7.溶出緩衝液（75％アセトニトリル、0.1％ギ酸）。
| 成分 | 1000mLのための金額 |
| ギ酸 | 1mLの |
| 水 | 999ミリリットル |
表8.移動相の組成物。
| 成分 | 1000mLのための金額 |
| ギ酸 | <TD> 1mLの|
| アセトニトリル | 999ミリリットル |
表9.移動相B組成物。
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Discussion
このビデオ記事では、LERLIC-MS / MS 3、深い特徴付けを実行し、正確タンパク質脱アミド化の程度およびこのタンパク質の修飾に関与する酵素プロセスを決定するための方法のステップバイステップのプロトコルを提示します。 LERLIC-MS / MSは、静電反発-親水性相互作用クロマトグラフィー（ERLIC）27の原理の下で長尺（50センチメートル）LAXの使用に基づいています。我々の研究3に示すように、長尺カラムの使用は、それらの等電点27に係る別ペプチドにERLICの可能性を最大化します。
LERLIC-MS / MSは、新規ショットガン一次元分離戦略3に示されるように、それは非常に複雑なプロテオームにおける最適な結果を得るために1200分の勾配を必要とするが、サンプル処理中に時間オン手を保存ワークフローを表します。 60分gradienLERLIC-MS / MSにおけるTはまた、ショットガンプロテオミクス3で初めてモデル化合物上のGlnの脱アミド化アイソフォームの最適な分離を達成することができます。これら二つのアプリケーションに基づいて、我々は、LAX毛細管による第2次元分離は、中間複雑さのサンプルを分析するための多次元クロマトグラフィーのアプローチの下で第一次元逆相クロマトグラフィー、以前に我々のグループ10によって使用されるワークフローに結合することができると推測しています。
タンパク質脱アミド化の分析のための試料調製は、かなりの程度1でのAsn残基上の人為的脱アミド化の発生を防止するために細心の注意を要する重要なステップです。ハオら。穏やかな酸性pH下でトリプシン消化を大幅にサンプル調製28の間に人為的脱アミド化の出現を防ぐことがわかりました。当社は、当社のソリューションの試みをSDC-支援本研究で使用していますPTIC消化13、試料処理が一方pHが6で行われる方法pHが6 29よりも低く保たれているときに、強い酸性条件は、トリプシンの消化能力に挑戦する可能性があります。 Liu ら 、ごく最近、この問題に対処します。 pHは4.5 30でのGlu-Cによってトリプシンを代入してのAsn残基上の人為的脱アミド化の発生の成功消化および防止することができる最適な消化戦略を報告しています。 Liu らにより報告消化方法の実装。 図30は実験的検証を必要とする可能性のある戦略であり得るLERLIC-MS / MSによるアスパラギンの脱アミド化を分析します。
このビデオ資料に概説したプロトコルをさらに特徴付け、老化およびヒト疾患におけるタンパク質の脱アミド化の関与を定義する現在未知のアイソフォーム比配列を定量するための大きな可能性を秘めています。毛皮thermore、他の生物学的な背景でLERLIC-MS / MSのアプリケーションは、分子時計の変更などの蛋白質脱アミド化の潜在的可能性とリスクを判断するのに役立ちます。
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Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
シンガポール国立医学研究評議会（NMRC-OF-IRG-0003から2016）、およびNTU-NHGエイジング研究助成（：この作品は、一部には教育のシンガポール省（/ 15 ARC9を付与ティア2）からの助成金によってサポートされていましたグラントARG / 14017）。私たちは感謝の意を表したいと親切に博士アンドリュー・アルパートとポリICチームに最も誠実な感謝は、この研究を可能にした梱包資材を提供してくれました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
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