Summary
Här presenterar vi en steg-för-steg-protokoll av den lång längd elektrostatisk repulsion-hydrofil interaktionskromatografi-tandemmasspektrometri metoden (LERLIC-MS / MS). Detta är en ny metod som gör det möjligt för första gången kvantifiering och karakterisering av glutamin och asparagin deamidering isoformer genom shotgun proteomics.
Abstract
Karaktärisering av protein deamidering är absolut nödvändigt att dechiffrera roll (er) och möjligheter av detta protein posttranslationell modifiering (PTM) i human patologi och andra biokemiska sammanhang. För att utföra karaktärisering av protein deamidering, har vi nyligen utvecklat en ny lång längd elektrostatisk repulsion-hydrofil interaktionskromatografi-tandemmasspektrometri (LERLIC-MS / MS) metod som kan separera den glutamin (Gin) och asparagin (Asn) isoform produkterna av deamidering från modellföreningar för att mycket komplexa biologiska prover. LERLIC-MS / MS är därför den första hagelgevär proteomik strategi för separation och kvantifiering av Gin deamidering isoformer. Vi visar också, som en nyhet, att provet bearbetning protokoll som beskrivs här stabiliserar succinimid mellanliggande tillåter dess karakterisering av LERLIC-MS / MS. Tillämpning av LERLIC-MS / MS som visas i denna video artikeln kan bidra till att belysa den aktuella unknown molekylära kedjor av protein deamidering. Dessutom ger LERLIC-MS / MS ytterligare förståelse av de enzymatiska reaktioner som omfattar deamidering i distinkta biologiska bakgrunder.
Introduction
Deamidering är ett protein posttranslationell modifiering (PTM) som introducerar en negativ laddning till proteinet ryggraden genom modifiering av asparagin (Asn) och / eller glutamin (Gin) resterna 1. Denna modifikation samtidigt som de påverkar Asn-rester genererar isomera produkterna isoasparaginsyra (isoAsp) och n -asparaginsyra (Asp) vid en gemensam 3: 1-förhållande 2. Utan hinder, kan detta förhållande ändras genom ingripandet av reparation enzymet L-isoaspartyl metyltransferas (PIMT) 3, 4. På liknande sätt, deamidering av Gin-rester genererar den isomera gamma-glutaminsyra (γ-Glu) och alfa-glutaminsyra isoformer (α-Glu) vid en förväntad 1: 7-förhållande 3, 5, men detta förhållande kan förskjutas genom verkan av den allestädes närvarande enzym transglutaminas 2 och andra transglutaminaser, inklusive transglutaminas 1, ett enzyme nyligen identifierats som associerade med extracellulära vesiklar i hjärnan 6.
Ursprunget för deamidering kan vara antingen spontan eller enzymatisk, den förra är särskilt vanligt på Gin-rester i vilka transglutaminaser och andra enzymer medierar inter / intra-molekylär tvärbindning via transamidering (se 3 för ytterligare detaljer om Gin transamidering och dess konsekvenser i flera kroniska och dödliga sjukdomar hos människan). Därför är deamidering en PTM som har en avgörande återverkan på strukturen och funktionen av påverkade molekyler 4, 7, 8 och kräver en fördjupad kemisk karakterisering 3 mot bakgrund av dess olika biokemiska konsekvenser inklusive dess tjänst som molekylärt klocka av åldrande 9 .
Även deamidering av Asn rester har varit relativt väl kännetecknas av bottom-up-hagelgevär proteomik 1, 10, deamidering av Gin-rester ändå inte har en lämplig karakterisering metod bortom den utmanande analys av modellföreningar genom elektronbaserad radikal fragmentering 11. Vi har nyligen utvecklat en ny en-dimensionen shotgun proteomics strategi (LERLIC-MS / MS) 3 som möjliggör separation av Gin och Asn deamidering isoformer från komplexa biologiska prover och modellföreningar i en enda analys. LERLIC-MS / MS är baserad på separationen av tryptiska digere peptider med användning av en lång längd (50 cm) jonbyteskolonn (LAX) arbetar på elektrostatisk repulsion-hydrofil interaktions-kromatografi (ERLIC) läge och kopplad till tandemmasspektrometri (LC- MS / MS). Denna nya analytiska strategi har använts för att karaktärisera och relativt kvantifiera omfattningen av varje deamiderade rest i humana hjärnvävnaderf "> 3. Trots det kommer det protokoll som beskrivs här ger video avbildning av LERLIC-MS / MS syftar att studera egenheter protein deamidering i den biokemiska sammanhang av intresse.
ETIK ANALYS
Alla förfaranden i detta protokoll har godkänts av Institutional Review Board i Nanyang Technological University i Singapore och har utförts i enlighet med de institutionella riktlinjerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förpackning Long-längd Anjon-utbyte (LAX) kapillärkolonn
(Anmärkning: Även om den LAX kolonnen kan vara i hemmet förpackade som vi beskriver i detta protokoll, LAX kolonner är också kommersiellt tillgängliga, se tabell av Material och reagens för ytterligare detaljer).
- Suspendera 50 mg av svag anjonbytare packningsmaterial i 3,5 ml packningsbuffert (tabell 1) för att framställa uppslamningen.
- Montera änden av kapillären kolonn (50 cm längd - 200 | j, m inre diameter (ID) slangar) med användning av en kvinna-till-honkoppling, en FÄRLA och en kvinnlig mutter. Placera en skärm 1/16" OD 1 mikron porstorlek inne honan till honkopplingen (Obs. Skärmen som används här måste ha mindre porstorlek än partikelstorlek förpackningsmaterialet för att förhindra läckage av material från kolumn).
- Packa kapillärröret med uppslamningen med användning av en tryckpump drevs vid 4500 psi. (Observera: Packa Column tills packningsmaterialet är synligt vid ingången av kolonnen).
- Montera den andra änden av kapillären kolonn som beskrivits i punkt 1,2.
2. Provberedning
Detta protokoll beskriver tillämpningen av LERLIC-MS / MS för att analysera mänskliga hjärnvävnader som modell proteom. (Observera: I fallet att använda andra vävnader eller proteomiska prover bör förfarandena provberednings anpassas.)
- Vävnads homogenisering:
en. Tvätthjärnvävnader (50 till 100 mg) med 1 x fosfatbuffertlösning under fem minuter thrice.
b. Homogenisera vävnaden vid ett: 1: 2,5 vävnad / metalliska pärlor / SDC homogeniseringsbuffert (tabell 2) förhållande (vikt / vikt / volym) under 5 min vid 4 ° C i säkert-lock rör vid maximal intensitet med användning av en vävnadshomogenisator. (Observera: SDC homogeniseringsbuffert kan inkludera proteasinhibitorer såsom tidigare angivits i 3)
c. Centrifugera vävnadshomogenatet, erhållen from föregående steg, vid 10 tusen xg, 4 ° C under 10 min och samla supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör.
d. Upprepa steg bc för de återstående pellets och kombinera supernatanterna så många gånger som behövs tills ingen pellet observeras. (Obs! Om du måste upprepa stegen bc mer än två gånger, flytta provet och pärlorna till en ny säker-lock rör för att förhindra förlust av provet under centrifugeringssteget).
e. Kvantifiera proteinkoncentrationen av de erhållna homogenat från bicinkoninsyra analys (BCA) 12. - Natriumdeoxikolat (SDC) -assisted in-lösning tryptisk digerering 13 av hjärnhomogenat.
en. Lägga till en slutlig koncentration av 10 mM ditiotreitol (DTT) (med användning av förrådslösningen anges i lösning 5 i tabell 3) till den erhållna homogenatet för att initiera en minskning av protein disulfidbindningar.
b. Inkubera homogenatet under 30 min i ett badförinställd på 60 ° C.
c. Lägga till homogenatet en slutlig koncentration av 20 mM jodacetamid (lAA) med användning av förrådslösningen anges i Lösning 7 i tabell 4.
d. Inkubera homogenatet innehållande lAA vid rumstemperatur i mörker under 45 min.
e. Späda ut hjärnhomogenat två veck som använder spädningsbuffert (Lösning 6 i tabell 3).
f. Inkubera provet för en andra reduktionssteg under 30 min vid 37 ° C.
g. Lägga sekvense-grade-modifierat trypsin upplöst i Lösning 2 i tabell 2 vid protein-till-enzymförhållande 01:50 (vikt / vikt).
h. Smälta homogenatet med trypsin genom inkubation över natten vid 30 ° C.
jag. Släcka den enzymatiska digere på nästa dag genom att tillsätta 0,5% slutlig koncentration av myrsyra (FA). (Observera: Tillsats av FA kommer att orsaka utfällning av SDC salter under sura betingelser.)
j. Vortexa försiktigt proverna innehållande SDC precipitates.
k. Pelle ner SDC salter genom centrifugering av proverna vid 12 tusen x g, 4 ° C under 10 min.
l. Samla supernatanten och överför vätskan till ett rent nytt rör. (OBS: Var försiktig under pipettering av detta steg för att inte återsuspendera och / eller samla salter från SDC pelleten.)
m. Åter upplösa SDC pelleten i SDC återupplösande buffert (tabell 5) under kraftig virvling under 1 min.
n. Upprepa steg Jl två gånger för att återhämta sig utfällda peptider och kombinera supernatanterna. (Observera:. Se Serra et al 2016 13 för ytterligare detaljer om SDC-assisted in-lösning tryptisk digereprotokoll anpassat här.) - Avsaltning av Tryptic smälta prover.
en. Utföra avsaltning av spjälkade prover med användning av en 1 g C-18 patron. (Observera: Användningen av en stor volym patron (5 ml) oberoende av den mängd protein som erhållits garantier ordentlig rengöring av återstående SDC salter i proverna företill LC-MS / MS-injektion.)
b. Utför konditionering av C-18 patron 1 g med 5 ml acetonitril (ACN).
c. Passera 5 ml av sanering buffert (Tabell 6) genom det konditione 1g C-18 patron för avlägsnande av eventuellt kvarvarande organiskt lösningsmedel.
d. Ladda provet till 1 g C-18 patron.
e. Utföra 3 - 5 sanerings steg för att provet i 1 g C-18-kolonn med användning 5 ml sanering buffert varje steg.
f. Eluera avsaltades peptider från C-18 patron 1 g under användning 5 ml elueringsbuffert (Tabell 7).
g. Torka de eluerade peptiderna i en vakuumkoncentrator.
c. Rekonstituera det torkade provet i en slutlig volym av 200 mikroliter av elueringsbuffert. (Obs:. Använd kraftig och lång (> 10 min) virvling följt av efterföljande sonikering i ett ultraljudsbad under 30 minuter för att fullständigt återsuspendera de torkade peptider i injektionsbuffert)
d. Justera injektionsvolym av provet för LERLIC-MS / MS för att analysera mellan 1 till 3 | j, g protein.
3. En-dimensionen LERLIC-MS / MS Separation
- Flytande kromatografiska villkor:
Mobila faser:
A: 0,1% FA i vatten (tabell 8).
B: 0,1% FA i ACN (tabell 9)
Flödeshastighet: 0,4 | il / min
Kolonn: LAX kapillär kolonn (50 cm längd - 200 | j, m ID)
en. Använd följande 1200 min-gradient: 95% B under 40 min, 95 - 85% B under 434 min, 85 - 70% som B under 522 min, 70 - 35% B under 124 min, 35-3% B under 45 min , isokratisk vid 3% B under 5 min 3 - 95% B under 7 minuter och hålls isokratiskt vid 95% B under 23 min.
b. Utföra separation av peptider med användning LAX kapillär enligt vad som anges i Serra & Gallart-Palau et al. 3 med användning av ultrahögtrycks-vätskekromatografi. - Mass-spektrometer konfiguration:
en. Konfigurera skannings uppgifter om händelsen för att utföra datainsamling alternerande betwesv fullständig Fouriertransformen-masspektrometri (FT-MS) och Fourier transform-tandemmasspektrometri (FT-MS / MS) med följande parametrar:
a.1. Datainsamling Läge: positivt
a.2 FT-MS-parametrar:
Massintervall: 350 - 2000 m / z
Upplösning: 60.000
Microscans: 1 per spektrum
Automatisk förstärkningsreglering: 1 × 10 6
a.3 FT-MS / MS-parametrar:
Fragmentering Läge: Hög energi kollisions dissociation (HCD)
a.4 Massintervall: 150 - 2000 m / z
a.5 Upplösning: 30.000
a.6 Top N joner: 10
Microscans: 1 per spektrum
Laddningstillstånd:> 2+
Isolering bredd: 2 Da
A.7 Automatisk förstärkningskontroll: 1 × 10 6
b. Utföra massdetektering spektrometri av peptider såsom anges i 3 med användning av en Orbitrap masspektrometer utrustad med en nanoelektrospray jonkälla som arbetar vid 1,5 kV.
4. Dataanalys
- utför protei databassökning till LERLIC-MS / MS erhålls data med hjälp av följande parametrar med hjälp av en specifik proteomik programvara: (Obs! Se 3 för ytterligare detaljer.)
en. Ion tolerans: 10 ppm
b. Fragmentjon tolerans: 0,05 Da
c. Falsk Discovery Rate (FDR): 1%
d. Databas: UniProt Human databas
e. Fasta modifieringar: Carbamydomethylation vid Cys
f. Variabla modifieringar (om det krävs av programvara): Oxidation (Met), Deamidering (Asn och Gin). - Säker karakterisering och kvantifiering av isomera deamiderade produkter i LERLIC-MS / MS-data:
en. Export databas sökresultat från LERLIC-MS / MS till en kalkylarket programvara för analys.
b. Hitta och extrahera hela listan deamiderat peptider och deras icke-deamiderade motsvarigheter.
c. Med hjälp av listan av de erhållna peptiderna som referens, extrahera jonkromatogram (XICs) av dessa peptider med användning av en appropiate mjukvara på 5 ppm masstolerans. (Notera:Se 3 för ytterligare information om den programvara som används för utvinning av XICs.)
d. Inspektera visuellt de erhållna XICs att identifiera den separerade dubbeltopp eluering av de isomera produkterna som indikeras 3. (Observera: Isomera produkter av de peptider som identifierats på MS / MS-nivå kan lätt hittas styrs genom närvaron av två olika uppehållstider i databasen sökresultat.)
e. Relativ kvantifiering av de isomera produkterna från varje deamiderad site / peptid måste utföras baserat på topparean för varje identifierad isomeren i de erhållna XICs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deamidering av Gin och Asn-rester anses vara en degenerativ proteinmodifiering (DPM) inblandad i flera kroniska och dödliga sjukdomar 14. Det har visat sig att denna PTM kan förutsäga halveringstid och nedbrytande tillstånd av antikroppar och andra molekyler i människokroppen och liknande biologiska bakgrunder 1, 15. Betydelsen av protein deamidering, i själva verket går utöver den biomedicinska sammanhang, hence denna modifiering är närvarande i olika proteom 16, 17 och vissa studier har visat potentialen i deamidering vid tidpunkten för att utföra exakt datering av målningar och arkeologiska förblir 18, 19 . Även betydelsen och funktionaliteten hos protein deamidering i olika bakgrunder har bekräftats under lång tid,re var till helt nyligen en brist på tekniskt framsteg på väg att nå en fördjupad karakterisering av denna PTM 3.
Tillämpning av LERLIC-MS / MS-3, såsom visas i figur 1, tillhandahåller för första gången och i en enda körning löst separation av Gin och Asn deamiderat isoformer från komplexa proteom eller modellföreningar även för de peptider som visar två oberoende Asn och Gin deamiderat proteoforms.
Figur 1: Diagram av LERLIC-MS / MS-arbetsflöde för Separation och kvantifiering av Gin och Asp deamidering Produkter från Complex Samples av Shotgun Proteomics. LERLIC-MS / MS involverar proteinextraktion och enzymatisk spjälkning innan en-dimension separation av peptider genom LC-MS / MS med användning av LAX kapillärkolonn. Analys av XICs möjliggöra identifiering av deamidering isomera produkter eluerade vid olika retentionstider baserat på deras olika aciditet 3, 20, 21. MS / MS tillåter diskriminering mellan deamiderade och icke-deamiderade peptider och säker identifiering av den deamiderade återstod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Enzymatiskt modifierade mellanliggande Gin rester av transamidering uppvisar en inverterad γ / α-glutamyl-förhållande (fig 2) kan bli upptäckt och kännetecknad av LERLIC-MS / MS, som kan ha betydande konsekvenser för studiet av proteinopathy vid neurodegenerativa sjukdomar 3, 22, 23 , 24. Vidare, såsom tidigare rapporterats i Serra & Gallart-Palau 2016, flera okända PIMT substratproteiner som utgör en inverterad isoAsp / Asp-förhållandet i deamiderade Asn-rester kan också identifieras i humana vävnader genom LERLIC-MS / MS-3.
Figur 2: Inspektion av XICs och identifiering av Double Retentionstider vid MS / MS nivå för deamiderade peptider Tillåt karakterisering av Gin och Asn deamiderat isomerer och identifiering av produkter från Crucial enzymatiska reaktioner som sker i deamidering. en. Detalj av XIC visar de två topparna som motsvarar de γ / α-glutamyl isomerer av peptiden FQMPDQGMTSADDFFEQ # GTK från hjärnan proteinet DPYL2 Dihydropyrimidinas relaterade-protein 2. Den inverterade γ / α-glutamyl förhållande detectedärav, att peptiden indikerar den potentiella konsekvenserna av γ-glutamyl-innehållande specie i transglutamination reaktionen som en transglutaminas γ-glutamyl-mellanprodukten. Den deamiderade återstoden verifierades genom MS / MS vid båda retentionstider, f. vid 389,1 min motsvarande den α-glutamyl-innehållande peptid och c. vid 401,4 min motsvarande den γ-glutamyl-innehållande peptid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som en nyhet av detta papper, fann vi att LERLIC-MS / MS tillåter karakterisering av succinimiden mellanprodukten (figur 3). Användningen av mild surt pH under provbearbetning stabiliserar succinimid mellan i modifierad Asn-resterna 25. Därför tillåter LERLIC-MS / MS proteomet omfattande studie av succinimide mellanprodukt, en labil och dåligt förstådd modifiering med betydande fysiologiska och patologiska konsekvenser 26.
Figur 3: Identifiering av succinimid Intermediate i Asn-rester genom LERLIC-MS / MS. en. Spektrum för Asn deamiderat peptiden YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR från hjärnan protein ALDO C aldolas C. Deamiderad rest indikeras som Deam-Asn. b. Spektrum av peptiden YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, som i detta fall visar en massförskjutning av -17 Da vid tidigare deamiderat Asn-resten (Scc-Asn) på grund av ammonium-förlust som äger rum under bildningen av den succinimid mellanprodukten. Klicka här för att se en större version av thär figur.
| Komponent | Mängd för 100 ml |
| isopropanol | 90 ml |
| Vatten | 10 ml |
Tabell 1. Förpackning Buffert Komposition (90% isopropanol).
| Lösning 1: 1 M ammoniumacetat. | |
| Komponent | Beloppet för 50 ml |
| ammoniumacetat | 3,86 g |
| Vatten (späd till 50 ml) | ~ 50 ml |
| Lösning 2: 100 mM ammoniumacetat. | |
| Komponent | Beloppet för 50 ml |
| lösning 1 | 5 ml |
| Vatten | 45 ml |
| Lösning 3: 10% Natriumdeoxikolat. | |
| Komponent | Beloppet för en ml |
| natriumdeoxikolat | 0,1 g |
| Vatten | 1 ml |
| Lösning 4: SDC homogeniseringsbuffert (100 mM ammoniumacetat innehållande 1% Natriumdeoxikolat). | |
| Komponent | Beloppet för 10 ml |
| lösning 2 | 9 ml |
| lösning 3 | 1 ml |
Tabell 2. SDC Homogenisering Buffert Komposition (100 mM ammoniumacetat Innehållande 1% natriumdeoxikolat). Förbered aktie solution av en M ammoniumacetat (lösning 1) och späd till få 100 mM ammoniumacetat (Lösning 2). Dessutom bereda stamlösningen av 10% natriumdeoxikolat (Lösning 3). Förbereda SDC homogeniseringsbuffert såsom beskrivits i Lösning 4.
| Lösning 5: 1 M DTT | |
| Komponent | Beloppet för 10 ml |
| ditiotreitol | 77 mg |
| Lösning 2 (se tabell 2) | 0,5 ml |
| Lösning 6: Utspädningsbuffert | |
| Komponent | Beloppet för 10 ml |
| lösning 5 | 0,1 ml |
| Lösning 2 (se tabell 2) | 9,9 ml |
Tabell 3. Spädningsbuffert Komposition (100 mM ammoniumacetat Innehållande 10 mM ditiotreitol (DTT)). Bereda stamlösningen av 1 M DTT (Lösning 5) och därefter framställa den utspädningsbuffert som beskrivs i Lösning 6.
| Lösning 7: 1 M lAA | |
| Komponent | Beloppet för 10 ml |
| IAA | 93 mg |
| Lösning 2 (se tabell 2) | 0,5 ml |
Tabell 4. Alkylering Buffert Komposition (100 mM ammoniumacetat Innehållande 20 mM jodacetamid (lAA)). Bereda stamlösningen av 1 M lAA (Lösning 7).
| Komponent | Beloppet för 50 ml |
| Ammoniumhydroxid | 0,25 ml |
| Vatten | 24,75 ml |
Tabell 5. SDC återlösande buffert Komposition (0,5% ammoniumhydroxid).
| Komponent | Mängd för 100 ml |
| trifluorättiksyra | 0,1 ml |
| Vatten | 99,9 ml |
Tabell 6. Clean-up buffert (0,1% trifluorättiksyra).
| Komponent | Mängd för 100 ml |
| acetonitril | 75 ml |
| Myrsyra | 0,1 ml |
Tabell 7. Elution Buffer (75% acetonitril, 0,1% myrsyra).
| Komponent | Mängd för 1000 ml |
| Myrsyra | 1 ml |
| Vatten | 999 ml |
Tabell 8. Mobil fas A Komposition.
| Komponent | Mängd för 1000 ml |
| Myrsyra | <td> 1 ml|
| acetonitril | 999 ml |
Tabell 9. Mobil fas B Komposition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna video-artikeln presenterar vi en steg-för-steg-protokoll för LERLIC-MS / MS-3, till en metod att utföra en fördjupad karakterisering och för att noggrant bestämma graden av protein deamidering och de enzymatiska processer involverade i denna proteinmodifiering. LERLIC-MS / MS är baserad på användningen av en lång längd (50 cm) LAX enligt principen om elektrostatisk repulsion-hydrofil interaktions-kromatografi (ERLIC) 27. Användning av en kolonn med lång längd, såsom visas i vår studie 3, maximerar potentialen för ERLIC till separata peptider enligt deras isoelektriska punkt 27.
LERLIC-MS / MS representerar en ny hagelgevär endimensionell separationsstrategi, ett arbetsflöde som sparar tid-på-hand under provbearbetning även om det kräver en 1200 min-gradient såsom anges i 3 för erhållande av optimala resultat i mycket invecklade proteom. En 60 min gradient i LERLIC-MS / MS kan även uppnå optimal separation av Gin deamidering isoformer på modellföreningar för första gången i shotgun proteomics 3. Baserat på dessa två applikationer, vi spekulera i att andra dimensionens separation utförs av LAX kapillär kunde kopplas till en första dimension omvänd-fas-kromatografi under ett multidimensionell kromatografi tillvägagångssätt för analys av prover av mitten komplexitet, ett arbetsflöde som tidigare använts av vår grupp 10.
Provberedning för analys av protein deamidering är ett avgörande steg som kräver noggrann uppmärksamhet för att förhindra uppkomsten av artefactual deamidering på Asn-rester på en stor utsträckning en. Hao et al. funnit att tryptisk digestion under milt surt pH förhindrar uppenbarelse av artefactual deamidering signifikant under provberedningen 28. Vi har använt i denna studie vår SDC övervakad lösning försökptic digestion 13, en metod där provbearbetning utförs vid pH 6. Å andra sidan, kanske starkare sura betingelser utmana uppslutnings förmågan hos trypsin när pH hålls lägre än 6 29. Att ta itu med denna fråga, helt nyligen Liu et al. har rapporterat en optimal matsmältning strategi som gör att framgångsrik matsmältning och förebyggande av förekomsten av artefactual deamidering på Asn-rester genom att ersätta trypsin med Glu-C vid pH 4,5 30. Genomförande av uppslutnings metod som rapporterats av Liu et al. 30 att analysera Asn deamidering genom LERLIC-MS / MS kan vara en potentiell strategi som kräver experimentell verifiering.
Det protokoll som beskrivs i denna video-artikeln har en stor potential för att ytterligare karakterisera och kvantifiera närvarande okända isoform förhållande arrayer som definierar inblandning av protein deamidering i åldrande och sjukdomar hos människor. Pälsthermore, applicering av LERLIC-MS / MS i andra biologiska bakgrunder kommer att hjälpa att bestämma de möjligheter och risker med protein deamidering som en molekylär klocka modifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete delvis finansierats med bidrag från Singapore undervisningsministeriet (Tier 2: Grant ARC9 / 15), National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016) och NTU-NHG Aging Research Grant ( Grant ARG / 14017). Vi vill uttrycka vår tacksamhet och mest uppriktiga tack till Dr. Andrew Alpert och PolyLC team för vänligt försett oss med förpackningsmaterial som möjliggjort denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
