Summary
Her præsenterer vi en trin-for-trin-protokollen af den lange længde elektrostatisk frastødning-hydrofil interaktionskromatografi-tandem massespektrometri (LERLIC-MS / MS) metode. Dette er en hidtil ukendt metode, som gør det muligt for første gang kvantificering og karakterisering af glutamin og asparagin deamideringssteder isoformer med shotgun proteomics.
Abstract
Karakterisering af protein deamidering er bydende nødvendigt at dechifrere den rolle (r) og muligheder af dette protein posttranslationel modifikation (PTM) i human patologi og andre biokemiske sammenhænge. For at udføre karakterisering af protein deamidering, har vi for nylig udviklet en ny lang længde elektrostatisk frastødning-hydrofil interaktionskromatografi-tandem massespektrometri (LERLIC-MS / MS) metode, der kan adskille glutamin (Gln) og asparagin (Asn) isoform produkter af deamidering fra modelforbindelser til meget komplekse biologiske prøver. LERLIC-MS / MS er derfor den første shotgun proteomics strategi til separation og kvantificering af Gin deamideringssteder isoformer. Vi demonstrerer også, som en nyhed, at prøven behandlingsprotokol her skitserede stabiliserer succinimid mellemprodukt tillader dets karakterisering ved LERLIC-MS / MS. Anvendelse af LERLIC-MS / MS, som vist i denne video artikel kan hjælpe til at belyse den aktuelt unknown molekylære opstillinger af protein deamidering. Derudover LERLIC-MS / MS tilvejebringer yderligere forståelse af de enzymatiske reaktioner, der omfatter deamidering i distinkte biologiske baggrunde.
Introduction
Deamidering er et protein posttranslationel modifikation (PTM), som indfører en negativ ladning til proteinet backbone ved modifikation af asparagin (Asn) og / eller glutamin (Gin) resterne 1. Denne modifikation mens påvirke Asn-rester genererer isomere produkter isoaspartic syre (isoAsp) og n asparaginsyre (Asp) ved en fælles 3: 1 forhold 2. Uanset, kan dette forhold ændres ved indgriben fra reparation enzym L-isoaspartyl methyltransferase (PIMT) 3, 4. Tilsvarende deamidering af Gin rester genererer den isomere gamma-glutaminsyre (γ-Glu) og alfa-glutaminsyre isoformer (α-Glu) på et forventet 1: 7 forhold 3, 5, men dette forhold kan forskydes ved indvirkning af den allestedsnærværende enzym transglutaminase 2 og andre transglutaminaser, herunder transglutaminase 1, en enzyme nylig identificeret som er forbundet med ekstracellulære vesikler i hjernen 6.
Oprindelsen af deamidering kan enten spontan eller enzymatisk, førstnævnte er især almindeligt på Gin-rester, hvori transglutaminaser og andre enzymer medierer inter / intra-molekylær tværbinding via transamidering (se 3 for yderligere detaljer om Gin transamidering og dens konsekvenser i flere kronisk og dødelige sygdomme hos mennesker). Derfor, deamidering er en PTM, der har en afgørende indflydelse på den struktur og funktion af berørte molekyler 4, 7, 8 og kræver en tilbundsgående kemiske karakterisering 3 i lyset af dets forskellige biokemiske konsekvenser herunder dets tjeneste som molekylære ur af ældning 9 .
Skønt deamidering af Asn-rester er blevet relativt velkarakteriseret ved bottom-up shotgun proteomics 1, 10, deamidering af Gin rester stadig ikke har en egnet karakterisering fremgangsmåde ud over den udfordrende analyse af modelforbindelser ved elektron-radikal fragmentering 11. Vi har for nylig udviklet en ny én dimension shotgun proteomics strategi (LERLIC-MS / MS) 3, der muliggør adskillelse af Gin og Asn deamideringssteder isoformer fra komplekse biologiske prøver og modelforbindelser i en enkelt analyse. LERLIC-MS / MS er baseret på adskillelsen af tryptiske spaltet peptider under anvendelse af en lang længde (50 cm) ionbyttersøjle (LAX) arbejder på elektrostatisk frastødning-hydrofil interaktionskromatografi (ERLIC) -tilstand og koblet til tandem-massespektrometri (LC- MS / MS). Denne nye analytiske strategi er blevet anvendt til at karakterisere og relativt kvantificere udstrækningen af de deamideret rest i humane hjernevævf "> 3. Ikke desto mindre vil protokollen beskrevet her giver video billeddannelse af LERLIC-MS / MS til formål at studere de særlige forhold protein deamidering i den biokemiske sammenhæng af interesse.
ETIK OVERSIGT
Alle procedurer vedrørende denne protokol er blevet godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelsen for Nanyang Technological University i Singapore og er udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Pakning af lange længde Anion-bytning (LAX) kapillarsøjle
(Bemærk: Selv om LAX kolonne kan være i hjemmet pakket som vi beskriver i denne protokol, LAX kolonner er også kommercielt tilgængelige, se tabel Materialer og reagenser for yderligere detaljer).
- Suspendere 50 mg svag anionbytter pakkemateriale i 3,5 ml pakning puffer (tabel 1) til fremstilling af opslæmningen.
- Samle enden af søjlen (50 cm længde - 200 um indvendig diameter (ID) rør) ved anvendelse af en kvinde til hunarmaturet, en ferule og en kvindelig møtrik. Placer en skærm 1/16" OD på 1 mikron porestørrelse inde hunnen til kvinde fitting (Bemærk:. Skærmen her skal have mindre porestørrelse end partikelstørrelsen af pakningsmaterialet at forhindre lækage af materialet fra kolonne).
- Pack kapillarrøret med opslæmningen under anvendelse af en trykpumpe drives ved 4500 psi. (Bemærk: Pak column indtil pakningsmaterialet er synlig ved indgangen af kolonnen).
- Samle den anden ende af søjlen som beskrevet i punkt 1.2.
2. Prøvefremstilling
Denne protokol beskriver anvendelsen af LERLIC-MS / MS til at analysere humane hjernevæv som model proteom. (Bemærk: I tilfælde at anvende andre væv eller proteomiske prøver, bør procedurerne for prøveforberedelse tilpasses.)
- Tissue homogenisering:
en. Vask hjernevæv (50 til 100 mg) med 1x phosphatpufferopløsning i fem minutter tre gange.
b. Homogenisere vævet ved 1: 1: 2,5 væv / metalliske perler / SDC homogeniseringspuffer (tabel 2) forholdet (vægt / vægt / volumen) i 5 minutter ved 4 ° C i safe-lock rør ved maksimal intensitet ved anvendelse af en vævshomogenisator. (Bemærk: SDC homogeniseringsbuffer kan indbefatte proteaseinhibitorer som tidligere angivet i 3)
c. Centrifugeres vævshomogenatet, opnået from det foregående trin, ved 10.000 x g, 4 ° C i 10 minutter og den ovenstående væske opsamles i et nyt 1,5 ml rør.
d. Gentag trin bc for de resterende pellets og kombinere supernatanterne så mange gange som nødvendigt, indtil der ikke observeres nogen pellet. (Bemærk: Hvis du er nødt til at gentage trinnene bc mere end to gange, flytte prøven og perlerne til en ny sikker-lock rør for at forhindre tab af prøven under centrifugeringstrinnet).
e. Kvantificere proteinkoncentrationen af de opnåede homogenater af bicinchoninsyre-assay (BCA) 12. - Natriumdeoxycholat (SDC) -assisted i opløsning trypsinfordøjelse 13 af hjernehomogenater.
en. Tilføje en slutkoncentration på 10 mM dithiothreitol (DTT) (under anvendelse stamopløsningen angivet i Løsning 5 af tabel 3) til den opnåede homogenat at indlede reduktion af protein disulfidbindinger.
b. Inkubere homogenatet løbet af 30 minutter i et badforudindstillet til 60 ° C.
c. Tilføj til homogenatet en slutkoncentration på 20 mM iodacetamid (IAA) under anvendelse stamopløsningen angivet i opløsning 7 i tabel 4.
d. Inkubere homogenatet indeholdende IAA ved stuetemperatur i mørke løbet af 45 minutter.
e. Fortynde hjernehomogenat to folder under anvendelse fortyndingspuffer (Solution 6 i tabel 3).
f. Inkubere prøven for en anden reduktionstrin i løbet af 30 minutter ved 37 ° C.
g. Tilføj sekventering-grade-modificeret trypsin opløst i opløsning 2 i tabel 2 ved protein-til-enzym 1:50 (vægt / vægt).
h. Fordøje homogenatet med trypsin ved inkubation natten over ved 30 ° C.
jeg. Standse den enzymatiske fordøjelse på den næste dag ved tilsætning af 0,5% slutkoncentration af myresyre (FA). (Bemærk: Tilsætning af FA vil forårsage udfældning af SDC salte under sure betingelser.)
j. vortexes forsigtigt prøverne indeholdende SDC precipiTates.
k. Nedpelletere SDC salte ved centrifugering af prøverne ved 12.000 x g, 4 ° C i løbet af 10 minutter.
l. Indsamle supernatanten og overføres væsken til et rent nyt rør. (Bemærk: Pas under pipettering af dette trin for at ikke re-suspendere og / eller indsamle salte fra SDC pellet.)
m. Re-opløse SDC pellet i SDC genopløsning buffer (tabel 5) under kraftig vortexbehandling i 1 minut.
n. Gentag trin jl to gange for at genvinde udfældede peptider og kombinere supernatanterne. (Bemærk: Jf. Serra et al 2016 13 for yderligere detaljer om SDC-assisteret in-opløsning trypsinfordøjelse protokol tilpasset her.) - Afsaltning af tryptisk fordøjet prøver.
en. Udføre afsaltning af spaltede prøver under anvendelse af en 1 g C-18 patron. (Bemærk: Anvendelsen af en stor volumen patron (5 ml) uafhængigt af mængden af protein opnås garantier ordentlig rengøring af resterende SDC salte i prøverne forudLC-MS / MS injektion.)
b. Udføre konditionering af 1g C-18 patron med 5 ml acetonitril (ACN).
c. Pass 5 ml oprydning buffer (tabel 6) ved det konditionerede 1g C-18 patron til fjernelse af eventuelt resterende organisk opløsningsmiddel.
d. Indlæse prøven til 1g C-18 patron.
e. Udføre 3 - 5 oprydning skridt til prøven i 1g C-18 søjle ved anvendelse af 5 ml oprydning puffer hvert trin.
f. Eluere afsaltet peptider fra 1g C-18 patron under anvendelse af 5 ml elueringsbuffer (tabel 7).
g. Tør de eluerede peptider i en vakuumkoncentrator.
c. Rekonstituere den tørrede prøve i et endeligt volumen på 200 pi elueringsbuffer. (Bemærk:. Brug kraftig og lang (> 10 min) hvirvelbehandling efterfulgt af efterfølgende sonikering i et sonikeringsbad løbet af 30 minutter til fuldstændig re-suspendere de tørrede peptider i injektionsbuffer)
d. Juster injektionsvolumen af prøven for LERLIC-MS / MS til analyze mellem 1 til 3 ug protein.
3. One-dimension LERLIC-MS / MS Separation
- Væskekromatografiteknikker betingelser:
Mobile faser:
A: 0,1% FA i vand (tabel 8).
B: 0,1% FA i ACN (tabel 9)
Strømningshastighed: 0,4 uL / min
Kolonne: LAX kapillarsøjle (50 cm længde - 200 um ID)
en. Anvende følgende 1200 min gradient: 95% B i 40 min, 95 - 85% B for 434 min 85 - 70% B for 522 min 70 - 35% B for 124 min 35 - 3% B i 45 minutter , isokratisk ved 3% B i 5 min 3 - 95% B i løbet af 7 min og holdt isokratisk ved 95% B i 23 min.
b. Udføre separation af peptider under anvendelse LAX kapillær som angivet i Serra & Gallart-Palau et al. 3 ved anvendelse af ultra-højtryksvæskekromatografi. - Massespektrometer konfiguration:
en. Konfiguration af scanningen begivenhedsoplysninger at udføre dataopsamling skiftevis betweOr fuld Fouriertransformation-massespektrometri (FT-MS) og Fouriertransformation-tandem massespektrometri (FT-MS / MS) med følgende parametre:
a.1. Data, dataopsamling: positiv
a.2 FT-MS-parametre:
Masseområde: 350 - 2.000 m / z
Opløsning: 60.000
Mikroscanninger: 1 pr spektrum
Automatisk forstærkningsstyring: 1 × 10 6
a.3 FT-MS / MS-parametre:
Fragmentering mode: Høj energi kollisionskøling dissociation (HCD)
a.4 Mass range: 150 - 2.000 m / z
A.5 Opløsning: 30.000
A.6 Top N ioner: 10
Mikroscanninger: 1 pr spektrum
Oplad tilstand:> 2+
Isolation bredde: 2 Da
A.7 Automatisk forstærkningsregulering: 1 × 10 6
b. Udføre massespektrometri detektion af peptider som indikeret i 3 under anvendelse af en orbitrap massespektrometer udstyret med en nanoelektrospray-ionkilde der arbejder ved 1,5 kV.
4. Data Analysis
- Udfør protei database søgning til den LERLIC-MS / MS opnåede data ved hjælp af de følgende parametre ved hjælp af en specifik proteomisk software: (Bemærk: Se 3 for yderligere detaljer.)
en. Ion tolerance: 10 ppm
b. Fragment ion tolerance: 0,05 Da
c. Falsk Discovery Rate (FDR): 1%
d. Database: UniProt Menneskelig database
e. Faste modifikationer: Carbamydomethylation på Cys
f. Variable modifikationer (hvis det kræves af softwaren): Oxidation (Met), Deamidering (Asn og Gln). - Overbevist karakterisering og kvantificering af isomere deamiderede produkter i LERLIC-MS / MS data:
en. Eksport database søgeresultater fra LERLIC-MS / MS til en spreedsheet software til analyse.
b. Find og udtrække hel liste over deamiderede peptider og deres ikke-deamiderede modstykker.
c. Brug af listen af de opnåede peptider som reference, udtrække de ionchromatogrammer (Xics) af disse peptider under anvendelse af et egnet software på 5 ppm masse tolerance. (Bemærk:Se 3 for yderligere detaljer om den software, der anvendes til udvinding af Xics.)
d. Visuelt inspicere de opnåede Xics at identificere den fraskilte dobbelt-peak eluering af de isomere produkter som indikeret 3. (Bemærk: Isomere produkter af de peptider er identificeret ved MS / MS niveau kan let findes styret af tilstedeværelsen af to forskellige retentionstider i databasen søgeresultaterne.)
e. Relativ kvantificering af de isomere produkter fra hver deamideret site / peptid skal udføres på grundlag af toparealet for hver identificeret isomer i de opnåede Xics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deamidering af Gin og Asn-rester betragtes som en degenerativ proteinmodifikation (DPM) impliceret i flere kroniske og dødelige sygdomme 14. Det er blevet påvist, at denne PTM kan forudsige halveringstid og nedbrydende tilstande af antistoffer og andre molekyler i menneskekroppen og lignende biologiske baggrunde 1, 15. Betydningen af protein deamidering, i virkeligheden, går ud over den biomedicinske kontekst, derfor denne ændring er til stede i forskellige proteomer 16, 17 og nogle undersøgelser har vist potentialet i deamidering ved det tid til at udføre præcis datering af malerier og arkæologiske forbliver 18, 19 . Selv betydning og funktionalitet af protein deamidering i forskellige baggrunde er blevet bekræftet i lang tid, denre var indtil for ganske nylig manglende teknisk fremskridt på vej til at opnå en grundig karakterisering af denne PTM 3.
Anvendelse af LERLIC-MS / MS 3, som afbildet i figur 1, tilvejebringer for første gang og i en enkelt kørsel løst adskillelse af Gin og Asn deamideret isoformer fra komplekse proteomer eller model forbindelser selv for de peptider, der viser to uafhængige Asn og Gin deamideres proteoforms.
Figur 1: Diagram over LERLIC-MS / MS Arbejdsgang for den Separation og kvantificering af Gln og Asp deamidering Produkter fra Complex Samples af shotgun Proteomics. LERLIC-MS / MS involverer proteinekstraktion og enzymatisk spaltning forud for en dimension separation af peptider ved LC-MS / MS under anvendelse af LAX kapillarsøjle. Analyse af Xics muliggøre identifikation af deamideringssteder isomere produkter elueret ved forskellige retentionstider baseret på deres forskellige surhed 3, 20, 21. MS / MS tillader diskriminering mellem deamiderede og ikke-deamiderede peptider og tillid identifikation af deamideret rest. Klik her for at se en større version af dette tal.
Enzymatisk modificeret mellemliggende Gin rester af transamidering udviser en omvendt γ / α-glutamyl-forhold (figur 2) kan afdækkes og karakteriseres ved LERLIC-MS / MS, der kan få betydelige konsekvenser for studiet af proteinopathy i neurodegenerative sygdomme 3, 22, 23 , 24. Som tidligere rapporteret i Serra & Gallart-Palau 2016 adskillige ukendt PIMT substratproteiner frembyder en omvendt isoAsp / Asp-forhold i deamiderede Asn-rester kan også identificeres i humane væv ved LERLIC-MS / MS 3.
Figur 2: Inspektion af Xics og Identifikation af Double Retention Times på MS / MS-niveau for Deamideret Peptider Tillad Karakterisering af Gln og Asn Deamideret isomerer og identifikation af produkter fra Crucial enzymatiske reaktioner, der finder sted i deamidering. en. Detalje af XIC viser de to toppe svarende til de γ / α-glutamyl isomerer af peptidet FQMPDQGMTSADDFFEQ # GTK fra hjernen proteinet DPYL2 dihydropyrimidinase relateret protein 2. Den omvendte γ / α-glutamyl-forhold detecteved, at peptidet indikerer potentielle indblanding af γ-glutamyl-holdige specie i transglutamination reaktion som en transglutaminase γ-glutamyl mellemprodukt. Det deamiderede rest blev verificeret ved MS / MS ved begge retentionstider, f. ved 389,1 min svarende til α-glutamyl-indeholdende peptid og c. ved 401,4 min svarende til γ-glutamyl-holdigt peptid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Som noget nyt af dette papir, fandt vi, at LERLIC-MS / MS tillader karakterisering af succinimidet mellemprodukt (figur 3). Anvendelsen af mild sur pH under prøve behandling stabiliserer succinimid mellemprodukt i modificeret Asn rest 25. Derfor LERLIC-MS / MS tillader proteom-dækkende undersøgelse af succinimide mellemprodukt, en labil og dårligt forstået modifikation med betydelige fysiologiske og patologiske implikationer 26.
Figur 3: Identifikation af succinimid mellemprodukt i Asn Rester af LERLIC-MS / MS. en. Spektret for Asn deamideret peptidet YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR fra hjernen protein ALDO C Fruktose-bisphosphat aldolase C. Deamideret rest angives som Deam-Asn. b. Spektrum af peptidet YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, som i dette tilfælde viser et masseskift af -17 Da ved den tidligere deamideret Asn-rest (SCC-Asn) som følge af ammonium tab, der finder sted under dannelsen af succinimidet mellemprodukt. Klik her for at se en større version af ther figur.
| Komponent | Beløb for 100 ml |
| isopropanol | 90 ml |
| Vand | 10 ml |
Tabel 1. Emballage Buffer Sammensætning (90% isopropanol).
| Løsning 1: 1 M ammoniumacetat. | |
| Komponent | Beløb til 50 ml |
| ammoniumacetat | 3,86 g |
| Vand (der fyldes op til 50 ml) | -50 ml |
| Løsning 2: 100 mM ammoniumacetat. | |
| Komponent | Beløb til 50 ml |
| Løsning 1 | 5 ml |
| Vand | 45 ml |
| Løsning 3: 10% Natriumdeoxycholat. | |
| Komponent | Beløb til 1 ml |
| natriumdeoxycholat | 0,1 g |
| Vand | 1 ml |
| Løsning 4: SDC homogeniseringsbuffer (100 mM ammoniumacetat indeholdende 1% natriumdeoxycholat). | |
| Komponent | Beløb til 10 ml |
| Løsning 2 | 9 ml |
| Løsning 3 | 1 ml |
Tabel 2. SDC homogeniseringsbuffer Sammensætning (100 mM ammoniumacetat indeholdende 1% natriumdeoxycholat). Forbered bestanden Solution af 1 M ammoniumacetat (Opløsning 1) og fortyndet for at få 100 mM ammoniumacetat (opløsning 2). Derudover forberede stamopløsning af 10% natriumdeoxycholat (opløsning 3). Forbered SDC homogeniseringsbuffer som beskrevet i Løsning 4.
| Opløsning 5: 1 M DTT | |
| Komponent | Beløb til 10 ml |
| dithiothreitol | 77 mg |
| Løsning 2 (se tabel 2) | 0,5 ml |
| Løsning 6: Fortyndingsbuffer | |
| Komponent | Beløb til 10 ml |
| Løsning 5 | 0,1 ml |
| Løsning 2 (se tabel 2) | 9,9 ml |
Tabel 3. fortyndingsbuffer Sammensætning (100 mM ammoniumacetat indeholdende 10 mM dithiothreitol (DTT)). Forberede stamopløsning af 1 M DTT (opløsning 5) og efterfølgende forberede fortyndingspufferen som beskrevet i Løsning 6.
| Løsning 7: 1 M IAA | |
| Komponent | Beløb til 10 ml |
| IAA | 93 mg |
| Løsning 2 (se tabel 2) | 0,5 ml |
Tabel 4. Alkylering Buffer Sammensætning (100 mM ammoniumacetat indeholdende 20 mM iodacetamid (IAA)). Forberede stamopløsning af 1 M IAA (opløsning 7).
| Komponent | Beløb til 50 ml |
| ammoniumhydroxid | 0,25 ml |
| Vand | 24,75 ml |
Tabel 5. SDC genopløsning Buffer Sammensætning (0,5% ammoniumhydroxid).
| Komponent | Beløb for 100 ml |
| trifluoreddikesyre | 0,1 ml |
| Vand | 99,9 ml |
Tabel 6. Oprensning Buffer (0,1% trifluoreddikesyre).
| Komponent | Beløb for 100 ml |
| acetonitril | 75 ml |
| myresyre | 0,1 ml |
Tabel 7. Elution Buffer (75% acetonitril, 0,1% myresyre).
| Komponent | Beløb til 1.000 ml |
| myresyre | 1 ml |
| Vand | 999 ml |
Tabel 8. Mobil fase A Komposition.
| Komponent | Beløb til 1.000 ml |
| myresyre | <td> 1 ml|
| acetonitril | 999 ml |
Tabel 9. Mobil fase B Komposition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne video-artikel præsenterer vi en trin-for-trin-protokollen af LERLIC-MS / MS 3, en fremgangsmåde udføre grundig karakterisering og til nøjagtigt at bestemme omfanget af protein deamidering og enzymatiske processer, der er involveret på dette protein modifikation. LERLIC-MS / MS er baseret på anvendelsen af en lang længde (50 cm) LAX henhold til princippet om elektrostatisk frastødning-hydrofil interaktionskromatografi (ERLIC) 27. Anvendelsen af en lang længde søjle, som vist i vores undersøgelse 3, maksimerer potentialet i ERLIC til separate peptider i henhold til deres isoelektriske punkt 27.
LERLIC-MS / MS repræsenterer en ny shotgun endimensionalt separation strategi, en arbejdsgang, der sparer tid på hænder under prøve behandling, selv om det kræver en 1.200 minutter gradient som angivet i 3 for at opnå optimale resultater om meget komplekse proteomer. En 60 min gradient i LERLIC-MS / MS kan også opnå optimal adskillelse af Gin deamideringssteder isoformer på modelforbindelser for første gang i shotgun proteomics 3. Baseret på disse to ansøgninger, vi spekulere, at anden dimension separation udført ved LAX kapillær kunne kobles til en første dimension omvendt fasechromatografi med en flerdimensionel kromatografi fremgangsmåde til analyse af prøver af midten kompleksitet, en arbejdsproces tidligere anvendt af vores gruppe 10.
Prøveforberedelse til analyse af protein deamidering er et afgørende skridt, der kræver omhyggelig opmærksomhed for at forebygge forekomsten af artefakt deamidering på Asn-rester på en stor grad 1. Hao et al. fundet, at tryptisk fordøjelse under mild sur pH signifikant forhindrer genfærd af artefakt deamidering under prøvefremstilling 28. Vi har anvendt i denne undersøgelse vores SDC-assisteret i opløsning prøveptic fordøjelse 13, en metode, hvor prøve behandling udføres ved pH 6. På den anden side kunne stærkere sure betingelser udfordre fordøjelse evne trypsin når pH holdes lavere end 6 29. Dette spørgsmål, for ganske nylig Liu et al. har rapporteret en optimal fordøjelse strategi, der tillader succesfuld fordøjelse og forebyggelse af forekomsten af artefakt deamidering på Asn-rester ved at erstatte trypsin ved Glu-C ved pH 4,5 30. Gennemførelse af fordøjelsen fremgangsmåden rapporteret af Liu et al. 30 at analysere Asn deamidering af LERLIC-MS / MS kunne være en potentiel strategi, der kræver eksperimentel verifikation.
Protokollen er skitseret i denne video-artikel har et stort potentiale for yderligere at karakterisere og kvantificere øjeblikket ukendte isoform forholdet arrays, der definerer inddragelsen af protein deamidering i aldring og sygdomme hos mennesker. Pelsneutralt arrangement, anvendelsen af LERLIC-MS / MS i andre biologiske baggrunde vil bidrage til at bestemme de muligheder og risici ved protein deamidering som en molekylær ur modifikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Singapore Undervisningsministeriet (Tier 2: Grant ARC9 / 15), National Council of Singapore (NMRC-AF-IRG-0003-2016), og NTU-NHG Aldringsforskning Grant Medical Research ( Grant ARG / 14017). Vi vil gerne udtrykke vores taknemmelighed og mest oprigtige tak til Dr. Andrew Alpert og PolyLC team for venligt forsynet os med den emballage, den muliggjorde denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
