Summary
هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من طول فترة طويلة للكهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LERLIC-MS / MS) الأسلوب. هذا هو منهجية جديدة تمكن لتقدير مرة الأولى، وتوصيف الجلوتامين والأسباراجين الإسوية نزع الأميد من البروتينات طلقات نارية.
Abstract
توصيف نزع الأميد البروتين لا بد من فك دور (ق) وإمكانات هذا البروتين posttranslational تعديل (PTM) في علم الأمراض البشرية وغيرها من السياقات البيوكيميائية. من أجل أداء توصيف نزع الأميد البروتين، وقد وضعنا مؤخرا رواية طويل طول كهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني، جنبا إلى جنب الطيف الكتلي (LERLIC-MS / MS) الطريقة التي يمكن فصل الجلوتامين (GLN) والهليونين (الأسباراجين) شكل الإسوي منتجات نزع الأميد من المركبات نموذج لعينات بيولوجية معقدة للغاية. LERLIC-MS / MS هو، وبالتالي فإن أول استراتيجية البروتينات بندقية لفصل وتقدير من الأشكال الإسوية نزع الأميد GLN. علينا أن نبرهن أيضا، والجدة، أن البروتوكول تجهيز العينات المذكورة هنا تستقر succinimide سيطة السماح توصيف من خلال LERLIC-MS / MS. تطبيق LERLIC-MS / MS كما هو موضح في هذه المقالة الفيديو يمكن أن تساعد على توضيح أونكنوو حالياالمصفوفات ن الجزيئية لنزع الأميد البروتين. بالإضافة إلى ذلك، يوفر LERLIC-MS / MS مزيد من فهم التفاعلات الأنزيمية التي تشمل نزع الأميد في الخلفيات البيولوجية متميزة.
Introduction
نزع الأميد هو تعديل البروتين posttranslational (PTM) الذي يقدم شحنة سالبة إلى العمود الفقري البروتين من خلال تعديل الهليونين (الأسباراجين) و / أو الجلوتامين (GLN) بقايا 1. هذا التعديل في حين تؤثر بقايا الأسباراجين يولد المنتجات ايزوميريا حمض isoaspartic (isoAsp) و n حمض -aspartic (الحية) في المشترك 3: نسبة 2 1. وعلى الرغم من أن هذه النسبة يمكن أن تتغير من خلال تدخل انزيم اصلاح-L isoaspartyl ناقلة الميثيل (PIMT) 3، 4. وبالمثل، نزع الأميد من بقايا GLN يولد الأحماض ايزوميريا جاما الجلوتاميك (γ-غلو) والأشكال الإسوية حمض الفا لالجلوتاميك (α-غلو) في متوقعة 1: 7 نسبة 3، 5، ولكن هذه النسبة يمكن أن تحول بفعل في كل مكان إنزيم الغلوتامين (2) وtransglutaminases الأخرى، بما في ذلك ناقلة الغلوتامين 1، عن طريق البريدnzyme التي تم تحديدها مؤخرا كما يرتبط مع حويصلات خارج الخلية في الدماغ 6.
أصل نزع الأميد يمكن أن تكون عفوية أو الأنزيمية، والسابق هو شائع بشكل خاص على بقايا GLN التي transglutaminases والأنزيمات الأخرى توسط أمور يشابك / داخل الجزيئي عبر transamidation (انظر 3 للحصول على مزيد من التفاصيل حول GLN transamidation وآثارها في عدة المزمنة و الأمراض التي تصيب الإنسان قاتلة). ولذلك، نزع الأميد هو PTM له تداعيات حاسمة على بنية ووظيفة الجزيئات تتأثر 4 و 7 و 8 و يتطلب الخواص الكيميائية في عمق 3 في ضوء نتائج البيوكيميائية المتنوعة بما في ذلك خدماتها على مدار الساعة كما الجزيئية الشيخوخة 9 .
وبالرغم من أن نزع الأميد من بقايا الأسباراجين نسبيا جيدا تتميز من قبل من أسفل إلى أعلى بندقية البروتينات 1، 10، نزع الأميد من بقايا GLN لا يزال لايوجد طريقة توصيف مناسبة ما وراء التحليل تحديا من المركبات النموذج من قبل القائم على الإلكترون تجزئة جذري 11. لقد وضعت مؤخرا رواية بعد واحد البروتينات بندقية استراتيجية (LERLIC-MS / MS) 3 التي تمكن فصل GLN والأسباراجين الإسوية نزع الأميد من العينات البيولوجية المعقدة والمركبات نموذج في تحليل واحد. ويستند LERLIC-MS / MS على الفصل بين الببتيدات تريبسيني هضمها باستخدام طول طويلة (50 سم) عمود التبادل الأيوني (LAX) العمل على وضع كهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني (ERLIC) وإلى جانب لجنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC- MS / MS). وقد استخدمت هذه الاستراتيجية تحليلية جديدة لتوصيف وquantitate نسبيا مدى كل بقايا deamidated في أنسجة الدماغ البشريو "> 3. ومع ذلك، فإن بروتوكول المذكورة هنا توفر التصوير الفيديو من LERLIC-MS / MS تهدف لدراسة خصائص نزع الأميد البروتين في سياق الكيمياء الحيوية من الفائدة.
بيان الأخلاق
وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من هذا البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة نانيانغ التكنولوجية في سنغافورة وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التعبئة وطول طويل أنيون الصرف (LAX) شعري العمود
(ملاحظة: على الرغم من أن العمود LAX يمكن أن يكون في المنزل معبأة كما وصفنا في هذا البروتوكول، والأعمدة LAX كما تتوفر تجاريا، انظر الجدول المواد والكواشف لمزيد من التفاصيل).
- تعليق 50 ملغ من ضعف مواد التعبئة والتغليف الصرف أنيون في 3.5 مل من التعبئة عازلة (الجدول 1) لتحضير الطين.
- تجميع نهاية العمود الشعري (طول 50 سم - 200 ميكرون قطرها الداخلي (ID) أنابيب) باستخدام الإناث والإناث المناسب، وferule والجوز الإناث. وضع الشاشة 1/16 "OD من 1 ميكرون حجم المسام داخل المناسب الإناث إلى الإناث (ملاحظة: الشاشة المستخدمة هنا يجب أن يكون أصغر حجم المسام من حجم الجسيمات من مواد التعبئة والتغليف لمنع تسرب المواد من عمود).
- حزمة الشعرية مع الطين باستخدام مضخة ضغط تعمل على 4500 رطل. (ملاحظة: حزمة من coluمليون حتى مواد التعبئة والتغليف واضح في دخول العمود).
- تجميع الطرف الآخر من العمود الشعري كما هو موضح في النقطة 1.2.
إعداد 2. عينة
ويحدد هذا البروتوكول تطبيق LERLIC-MS / MS لتحليل أنسجة المخ الإنسان كما بروتيوم نموذج. (ملاحظة: في حالة استخدام الأنسجة الأخرى أو عينات البروتين، وينبغي تكييف إجراءات إعداد العينات.)
- الأنسجة التجانس:
ا. أنسجة الدماغ غسل (50-100 ملغ) مع 1X الفوسفات حل العازلة لمدة خمس دقائق ثلاث مرات.
ب. تجانس الأنسجة في 1: 1: 2.5 الأنسجة / الخرز المعدنية / SDC التجانس العازلة (الجدول 2) نسبة (ث / ث / ت) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في أنابيب آمن قفل في أقصى كثافة استخدام الخالط الأنسجة. (ملاحظة: عازلة التجانس SDC قد تشمل مثبطات الأنزيم البروتيني كما هو مبين سابقا في 3)
ج. أجهزة الطرد المركزي لجناسة الأنسجة، والتي تم الحصول عليها جيئة وذهابام الخطوة السابقة، في 10000 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وجمع طاف في جديد أنبوب 1.5 مل.
د. كرر الخطوات قبل الميلاد لالكريات المتبقية والجمع بين supernatants عدة مرات حسب الضرورة حتى يتم احترام أي بيليه. (ملاحظة: إذا كان لديك لتكرار الخطوات قبل الميلاد أكثر من مرتين، نقل العينة والخرز لأنبوب جديد آمنة قفل لمنع فقدان عينة أثناء خطوة الطرد المركزي).
ه. قياس تركيز البروتين من الخليط حصلت عليها حمض Bicinchoninic فحص (BCA) 12. - deoxycholate الصوديوم (SDC) -assisted في حل زيتية الهضم 13 من الخليط الدماغ.
ا. إضافة تركيز النهائي من 10 ملم dithiothreitol (DTT) (باستخدام محلول المخزون المشار إليها في حل 5 من الجدول رقم 3) لجناسة التي تم الحصول عليها للشروع في الحد من السندات البروتين ثاني كبريتيد.
ب. احتضان جناسة خلال 30 دقيقة في حمامسلفا في 60 ° C.
ج. إضافة إلى جناسة تركيز النهائي من 20 ملي iodoacetamide (IAA) باستخدام محلول المخزون المشار إليها في الحل 7 من الجدول (4).
د. احتضان جناسة تحتوي على IAA في درجة حرارة الغرفة في الظلام خلال 45 دقيقة.
ه. تمييع جناسة الدماغ يومين طيات باستخدام العازلة تخفيف (الحل 6 من الجدول 3).
F. احتضان عينة لخطوة التخفيض الثاني خلال 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ز. إضافة التربسين تعديل التسلسل الصف الذائبة في الحل 2 من الجدول 2 في البروتين إلى إنزيم نسبة 01:50 (ث / ث).
ح. هضم جناسة مع التربسين من الحضانة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
أنا. إخماد الهضم الأنزيمي في اليوم التالي من خلال إضافة تركيز النهائي 0.5٪ من حمض الفورميك (FA). (ملاحظة: سوف إضافة FA يسبب ترسب الأملاح SDC تحت الظروف الحمضية).
ي. دوامة بلطف العينات التي تحتوي على SDC precipi[تتس].
ك. بيليه أسفل أملاح SDC بواسطة الطرد المركزي العينات في 12000 × ز، 4 ° C خلال 10 دقيقة.
ل. جمع طاف ونقل السائل إلى أنبوب جديد نظيف. (ملاحظة: العناية خلال pipetting لهذه الخطوة لعدم إعادة تعليق و / أو جمع الأملاح من بيليه SDC).
م. إعادة بحل بيليه SDC في SDC المذيبة إعادة عازلة (الجدول 5) تحت vortexing لقوي لمدة 1 دقيقة.
ن. كرر الخطوات JL مرتين لاستعادة الببتيدات المترسبة والجمع بين supernatants. (ملاحظة: انظر سيرا وآخرون 2016 (13) لمزيد من التفاصيل حول SDC بمساعدة في حل بروتوكول الهضم زيتية تكييفها هنا.) - إزالة الأملاح من تريبسيني هضمها العينات.
ا. أداء تحلية عينات هضمها باستخدام خرطوشة 1G C-18. (ملاحظة: استخدام خرطوشة حجم كبير (5 مل) بشكل مستقل عن كمية البروتين الضمانات التي تم الحصول عليها التنظيف السليم للأملاح SDC المتبقية في العينات قبلالحقن LC-MS / MS).
ب. أداء تكييف خرطوشة C-18 1G مع 5 مل من الأسيتونيتريل (ACN).
ج. تمرير 5 مل من العازلة تنظيف (الجدول 6) من قبل مكيفة خرطوشة 1G C-18 لإزالة أي المذيبات العضوية المتبقية.
د. تحميل العينة إلى خرطوشة 1G C-18.
ه. أداء 3-5 خطوات تنظيف للعينة في العمود 1G C-18 باستخدام 5 مل من العازلة تنظيف كل خطوة.
F. أزل الببتيدات المحلاة من 1G C-18 خرطوشة باستخدام 5 مل من شطف العازلة (الجدول 7).
ز. تجفيف الببتيدات مزال في مكثف فراغ.
ج. إعادة العينة المجففة في الحجم النهائي من 200 ميكرولتر من شطف العازلة. (ملاحظة: استخدم قوية وطويلة (> دقيقة) vortexing ل10 تليها صوتنة لاحقا في حمام صوتنة خلال 30 دقيقة لإعادة تعليق تماما الببتيدات المجففة في المخزن الحقن)
د. ضبط حجم حقن العينة لLERLIC-MS / MS إلى anaينحل بين 1-3 ميكروغرام من البروتين.
3. البعد احد LERLIC-MS / MS الفصل
- شروط اللوني السائل:
مراحل النقالة:
A: 0.1٪ FA في الماء (الجدول 8).
B: 0.1٪ FA ACN في (الجدول 9)
معدل التدفق: 0.4 ميكرولتر / دقيقة
العمود: عمود شعري LAX (طول 50 سم - 200 ميكرون ID)
ا. استخدم التالي 1200 دقيقة التدرج: 95٪ B لمدة 40 دقيقة، 95-85٪ B عن 434 دقيقة، 85-70٪ B مقابل 522 دقيقة، 70-35٪ B عن 124 دقيقة، 35-3٪ B لمدة 45 دقيقة ، isocratic في 3٪ B لمدة 5 دقائق، 3-95٪ B أكثر من 7 دقائق وأبقى isocratic في 95٪ B لمدة 23 دقيقة.
ب. أداء فصل الببتيدات باستخدام الشعرية LAX كما هو مبين في سيرا وGallart-بالاو وآخرون. 3 باستخدام فائقة ارتفاع ضغط اللوني السائل. - الشامل التكوين مطياف:
ا. تكوين تفاصيل الحدث المسح الضوئي لأداء الحصول على البيانات بالتناوب betweأون فورييه الكامل تحويل الكتلة الطيفي (FT-MS) وتحويل فورييه، جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (FT-MS / MS) مع المعلمات التالية:
A.1. وضع الحصول على البيانات: إيجابية
A.2 المعلمات FT-MS:
مجموعة الشامل: 350 - 2000 م / ض
قرار: 60،000
Microscans: 1 في الطيف
السيطرة التلقائية: 1 × 10 6
A.3 المعلمات FT-MS / MS:
وضع تجزئة: عالية الطاقة التفكك تصادم (HCD)
A.4 قداس مجموعة: 150 - 2000 م / ض
A.5 القرار: 30000
أيونات A.6 الأعلى N: 10
Microscans: 1 في الطيف
تهمة الدولة:> 2+
عرض العزلة: 2 دا
A.7 السيطرة التلقائية: 1 × 10 6
ب. أداء كشف مطياف الكتلة من الببتيدات كما هو مبين في 3 باستخدام مطياف الكتلة orbitrap مجهزة مصدر nanoelectrospray أيون تعمل على 1.5 كيلو فولت.
تحليل 4. البيانات
- أداء المتواجدفي البحث في قاعدة البيانات إلى LERLIC-MS / MS الحصول على بيانات باستخدام المعلمات التالية باستخدام برنامج البروتين محددة: (ملاحظة: الاطلاع على 3 لمزيد من التفاصيل).
ا. أيون التسامح: 10 جزء في المليون
ب. جزء التسامح أيون: 0.05 دا
ج. معدل اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت): 1٪
د. قاعدة بيانات: قاعدة بيانات يونيبروت الإنسان
ه. التعديلات ثابت: Carbamydomethylation في السيستئين
F. التعديلات متغير (إذا لزم الأمر من قبل البرنامج): الأكسدة (الحد)، نزع الأميد (الأسباراجين وGLN). - توصيف ثقة وتقدير من المنتجات deamidated ايزوميريا في البيانات LERLIC-MS / MS:
ا. تصدير نتائج البحث قاعدة البيانات من LERLIC-MS / MS إلى برنامج spreedsheet للتحليل.
ب. البحث واستخراج قائمة كاملة من الببتيدات deamidated ونظرائهم غير deamidated.
ج. باستخدام قائمة من الببتيدات التي تم الحصول عليها كمرجع، استخراج الاستشرابية أيون (XICs) من هذه الببتيدات باستخدام برنامج appropiate في 5 جزء في المليون من التسامح الشامل. (ملحوظة:الاطلاع على 3 لمزيد من التفاصيل حول البرمجيات المستخدمة لاستخراج XICs).
د. بصريا تفقد XICs التي تم الحصول عليها لتحديد فصل مزدوجة الذروة شطف من المنتجات ايزوميريا كما هو مبين 3. (ملاحظة: المنتجات ايزوميريا تلك الببتيدات المحددة على مستوى MS / MS يمكن بسهولة العثور تسترشد جود مرتين الاحتفاظ مختلفة في نتيجة البحث في قاعدة البيانات.)
ه. الكمي النسبي للمنتجات ايزوميريا من كل موقع deamidated / الببتيد يجب أن يقوم على أساس منطقة ذروة كل متزامر المحددة في XICs التي تم الحصول عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويعتبر نزع الأميد من GLN والأسباراجين بقايا تعديل البروتين التنكسية (DPM) متورط في العديد من الأمراض المزمنة والقاتلة 14. وقد ثبت أن هذا PTM يمكن التنبؤ دول نصف العمر والهادمة من الأجسام المضادة والجزيئات الأخرى في الجسم البشري والخلفيات البيولوجية مماثلة 1، 15. أهمية نزع الأميد البروتين، في الواقع، يتجاوز السياق الطب الحيوي، وبالتالي هذا التعديل موجود في proteomes متنوعة 16 و 17 و بعض الدراسات أثبتت إمكانية نزع الأميد في ذلك الوقت لأداء يرجع تاريخها دقيقة من اللوحات ويبقى الأثرية 18 و 19 . وعلى الرغم من أهمية وظيفة نزع الأميد البروتين في خلفيات متنوعة وقد أكد لفترة طويلة، وأعيد حتى وقت قريب جدا عدم وجود التقدم التقني على الطريق لتحقيق توصيف متعمق لهذه PTM 3.
تطبيق LERLIC-MS / MS 3، كما هو مبين في الشكل رقم 1، تقدم لأول مرة وفي فصل تشغيل واحد حلها من GLN والأسباراجين deamidated الإسوية من proteomes معقدة أو نموذج تضاعف حتى بالنسبة لأولئك الببتيدات يظهر اثنين الأسباراجين مستقل وGLN deamidated proteoforms.
الشكل 1: رسم تخطيطي لLERLIC-MS / MS سير العمل للفصل والكمي لGLN وآسيا والمحيط الهادئ نزع الأميد المنتجات من عينات مجمع بواسطة بندقية البروتيوميات. LERLIC-MS / MS ينطوي على استخراج البروتين والهضم الأنزيمي قبل فصل بعد واحد من الببتيدات بواسطة LC-MS / MS باستخدام العمود الشعري LAX. آناتحلل من XICs تسمح تحديد المنتجات ايزوميريا نزع الأميد مزال في بعض الأحيان الاحتفاظ مختلفة استنادا إلى الحموضة المختلفة 3 و 20 و 21. MS / MS يتيح التمييز بين الببتيدات deamidated وغير deamidated وتحديد اثق من بقايا deamidated. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تعديل إنزيمي بقايا GLN المتوسطة من transamidation عرض نسبة مقلوب γ / α-غلوتاميل (الشكل 2) ويمكن كشف وتتميز LERLIC-MS / MS، والتي قد يكون لها آثار كبيرة على دراسة proteinopathy في أمراض الاعصاب 3، 22، 23 ، 24. وعلاوة على ذلك، كما ذكرت سابقا في سيرا وGallart-بالاو عام 2016، عدة بروتينات معروفة PIMT الركيزة تقديم نسبة isoAsp / الحية مقلوب في بقايا الأسباراجين deamidated يمكن أيضا الكشف عن هويته في الأنسجة البشرية التي كتبها LERLIC-MS / MS 3.
الشكل 2: تفتيش XICs وتحديد مزدوجة الاحتفاظ تايمز في MS / MS مستوى لالببتيدات Deamidated السماح توصيف GLN والأسباراجين Deamidated أيزومرات وتحديد المنتجات من ردود الفعل الأنزيمية الحاسمة التي تجري في نزع الأميد. ا. التفاصيل من XIC تظهر اثنين من قمم المقابلة بأيسومرات γ / α-غلوتاميل من الببتيد FQMPDQGMTSADDFFEQ # GTK من البروتين في الدماغ DPYL2 dihydropyrimidinase المتعلقة البروتين 2. مقلوب γ / α-غلوتاميل نسبة عن كشفهاد في هذا الببتيد يشير ضمنا المحتملين من الخشب التي تحتوي على γ-غلوتاميل في رد فعل transglutamination باعتبارها ناقلة الغلوتامين γ-غلوتاميل المتوسط. تم التحقق من بقايا deamidated بواسطة MS / MS في المرتين الاحتفاظ، ب. في 389.1 دقيقة المقابلة لالببتيد التي تحتوي α-غلوتاميل وج. في 401.4 دقيقة المقابلة لالببتيد التي تحتوي على γ-غلوتاميل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ونتيجة لحداثة هذه الورقة، وجدنا أن LERLIC-MS / MS يسمح توصيف succinimide المتوسط (الشكل 3). استخدام الرقم الهيدروجيني الحمضية خفيفة خلال تجهيز العينات استقرار succinimide المتوسط في تعديل الأسباراجين مخلفات 25. ولذلك، LERLIC-MS / MS يسمح دراسة على نطاق بروتيوم من succinimide سيطة، تعديل قابل للتغيير وغير مفهومة مع الآثار الفسيولوجية والمرضية هامة 26.
الشكل 3: تحديد المتوسطة Succinimide في الأسباراجين بقايا من LERLIC-MS / MS. ا. الطيف من الأسباراجين deamidated الببتيد YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR من البروتين في الدماغ ALDO C ألدولاز يشار C. Deamidated بقايا كما DEAM-الأسباراجين. ب. طيف من الببتيد YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR، الذي يظهر في هذه الحالة تحول الشامل -17 دا في deamidated سابقا الأسباراجين بقايا (SCC-الأسباراجين) بسبب فقدان الأمونيوم التي تحدث خلال تشكيل succinimide المتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من الهو الرقم.
| مكون | المبلغ 100 مل |
| الأيزوبروبانول | 90 مل |
| ماء | 10 مل |
الجدول 1. التعبئة العازلة التركيب (90٪ الأيزوبروبانول).
| الحل 1: 1 M من خلات الأمونيوم. | |
| مكون | المبلغ 50 مل |
| امونيوم اسيتات | 3.86 ز |
| الماء (ما يصل إلى 50 مل) | ~ 50 مل |
| الحل 2: 100 ملم من خلات الأمونيوم. | |
| مكون | المبلغ 50 مل |
| الحل 1 | 5 مل |
| ماء | 45 مل |
| حل 3: 10٪ deoxycholate الصوديوم. | |
| مكون | المبلغ: 1 مل |
| deoxycholate الصوديوم | 0.1 غرام |
| ماء | 1 مل |
| الحل 4: SDC عازلة التجانس (100 ملي خلات الأمونيوم تحتوي على 1٪ deoxycholate الصوديوم). | |
| مكون | المبلغ لمدة 10 مل |
| الحل 2 | 9 مل |
| حل 3 | 1 مل |
الجدول 2. SDC التجانس العازلة التركيب (100 ملي الأمونيوم خلات تحتوي على 1٪ الصوديوم Deoxycholate). تحضير المحاليل الأسهم نشوئها من 1 M من خلات الأمونيوم (الحل 1) وتمييع للحصول على 100 ملي من خلات الأمونيوم (الحل 2). بالإضافة إلى ذلك، وإعداد محلول المخزون من 10٪ deoxycholate الصوديوم (الحل 3). إعداد المخزن المؤقت التجانس SDC كما هو موضح في الحل 4.
| الحل 5: 1 M DTT | |
| مكون | المبلغ لمدة 10 مل |
| Dithiothreitol | 77 ملغ |
| الحل 2 (انظر الجدول 2) | 0.5 مل |
| الحل 6: عازلة التخفيف | |
| مكون | المبلغ لمدة 10 مل |
| حل 5 | 0.1 مل |
| الحل 2 (انظر الجدول 2) | 9.9 مل |
الحمار = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الجدول 3. التخفيف العازلة التركيب (100 ملي الأمونيوم خلات تحتوي على 10 ملي Dithiothreitol (DTT)). إعداد محلول المخزون من 1 M DTT (الحل 5)، وبعد ذلك إعداد المخزن المؤقت التخفيف على النحو المفصل في الحل 6.
| الحل 7: 1 M IAA | |
| مكون | المبلغ لمدة 10 مل |
| IAA | 93 ملغ |
| الحل 2 (انظر الجدول 2) | 0.5 مل |
الجدول 4. ألكلة العازلة التركيب (100 ملي الأمونيوم خلات تحتوي على 20 ملي Iodoacetamide (IAA)). إعداد محلول المخزون من 1 M IAA (الحل 7).
| مكون | المبلغ 50 مل |
| هيدروكسيد الأمونيوم | 0.25 مل |
| ماء | 24.75 مل |
الجدول 5. SDC Redissolving العازلة التركيب (0.5٪ الأمونيوم هيدروكسيد).
| مكون | المبلغ 100 مل |
| حمض Trifluoroacetic | 0.1 مل |
| ماء | 99.9 مل |
الجدول 6. العازلة النظيفة الهاتفي (0.1٪ Trifluoroacetic حمض).
| مكون | المبلغ 100 مل |
| أسيتونيتريل | 75 مل |
| حمض الفورميك | 0.1 مل |
الجدول 7. شطف العازلة (75٪ الأسيتونيتريل، 0.1٪ حمض الفورميك).
| مكون | المبلغ 1000 مل |
| حمض الفورميك | 1 مل |
| ماء | 999 مل |
الجدول 8. المرحلة النقالة والتركيب.
| مكون | المبلغ 1000 مل |
| حمض الفورميك | <td> 1 مل|
| أسيتونيتريل | 999 مل |
الجدول 9. موبايل المرحلة B التركيب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا الفيديو المقال نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من LERLIC-MS / MS 3، وهي طريقة لأداء توصيف معمقة وتحديد دقيق لمدى نزع الأميد البروتين والعمليات الأنزيمية المعنية على هذا التعديل البروتين. ويستند LERLIC-MS / MS على استخدام طول طويلة (50 سم) LAX وفقا لمبدأ كهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني (ERLIC) 27. استخدام عمود طول المدى، كما هو مبين في دراستنا 3، يزيد من إمكانات ERLIC إلى الببتيدات منفصلة وفقا لنقطة تساوي الكهربائية من 27.
يمثل LERLIC-MS / MS استراتيجية الانفصال أحادي البعد بندقية جديدة، سير العمل الذي يوفر الوقت على اليدين أثناء تجهيز العينات على الرغم من أنه يتطلب التدرج 1200 دقيقة كما هو مبين في 3 للحصول على أفضل النتائج على proteomes معقدة للغاية. A gradien 60 دقيقةتي في LERLIC-MS / MS يمكن أيضا تحقيق فصل الأمثل من الأشكال الإسوية نزع الأميد GLN على نماذج مركبات لأول مرة في البروتيوميات بندقية 3. وبناء على هذه التطبيقين، ونحن التكهن بأن فصل البعد الثاني يؤديها الشعرية LAX يمكن أن يقترن إلى الأول بعد المرحلة عكس اللوني في إطار نهج اللوني متعدد الأبعاد لتحليل عينات من التعقيد الأوسط، وسير العمل المستخدمة من قبل مجموعتنا 10.
إعداد نموذج لتحليل نزع الأميد البروتين هو خطوة حاسمة تتطلب عناية فائقة لمنع وقوع نزع الأميد مصطنع على بقايا الأسباراجين في حد كبير 1. هاو وآخرون. وجدت أن عملية الهضم زيتية تحت درجة الحموضة الحمضية خفيفة يمنع إلى حد كبير شبح نزع الأميد مصطنع خلال إعداد نموذج 28. وقد استخدمنا في هذه الدراسة لدينا SDC ساعد في محاولة حلالهضم ptic 13، وسيلة حيث يتم تجهيز العينات للخروج في درجة الحموضة 6. من ناحية أخرى، الظروف الحمضية أقوى قد طعن في قدرة هضم التربسين عندما يتم الحفاظ على درجة الحموضة أقل من 6 29. معالجة هذه القضية، قريب جدا ليو وآخرون. وأفادت استراتيجية الهضم الأمثل الذي يسمح الهضم ناجحة ومنع وقوع نزع الأميد مصطنع على بقايا الأسباراجين عن طريق استبدال التربسين التي كتبها غلو-C في درجة الحموضة 4.5 30. تطبيق الأسلوب الهضم ذكرت ليو وآخرون. 30 لتحليل الأسباراجين نزع الأميد التي كتبها LERLIC-MS / MS يمكن أن تكون الإستراتيجية المحتملة التي تتطلب التحقق التجريبي.
بروتوكول المبينة في هذا الفيديو المادة لديه إمكانات كبيرة لمزيد من تميز وquantitate غير معروفة حاليا صفائف نسبة شكل الإسوي التي تحدد مشاركة نزع الأميد البروتين في الشيخوخة والأمراض التي تصيب الإنسان. فروthermore، وتطبيق LERLIC-MS / MS في الخلفيات بيولوجية أخرى تساعد على تحديد الإمكانات ومخاطر نزع الأميد البروتين وتعديل مدار الساعة الجزيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وكان هذا العمل في جزء بدعم من المنح المقدمة من سنغافورة وزارة التربية والتعليم (المستوى 2: منح ARC9 / 15)، مجلس البحوث الطبية الوطنية في سنغافورة (NMRC-OF-IRG-0003-2016)، وجامعة تايوان الوطنية، NHG بحوث الشيخوخة غرانت ( منحة ARG / 14017). ونود أن نعرب عن امتناننا وشكرنا خالص للدكتور أندرو ألبرت وفريق PolyLC لتوفير تتكرم لنا مع مواد التعبئة والتغليف التي جعلت ذلك ممكنا هذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
