Summary
Ici, nous présentons un protocole étape par étape de la spectrométrie de masse de grande longueur d'interaction de répulsion électrostatique chromatographie hydrophile-tandem procédé (LERLIC-MS / MS). Ceci est une nouvelle méthodologie qui permet pour la première quantification et la caractérisation des temps glutamine et l'asparagine isoformes désamidation par protéomiques de fusil de chasse.
Abstract
Caractérisation des désamidation des protéines est impératif de déchiffrer le rôle (s) et les potentialités de cette modification post-traductionnelle de protéines (PTM) en pathologie humaine et d'autres contextes biochimiques. Afin d'effectuer la caractérisation des protéines désamidation, nous avons récemment développé une nouvelle spectrométrie de masse de grande longueur d'interaction répulsion hydrophile électrostatique chromatographie en tandem méthode (LERLIC-MS / MS) qui peut séparer la glutamine (Gln) et isoforme asparagine (Asn) produits de désamidation de composés modèles à des échantillons biologiques complexes. LERLIC-MS / MS est, par conséquent, la première stratégie protéomiques de fusil de chasse pour la séparation et la quantification des isoformes de Gln désamidation. Nous démontrons aussi, comme une nouveauté, que le protocole de traitement de l'échantillon décrit ici stabilise l'intermédiaire permettant sa caractérisation succinimide par LERLIC-MS / MS. Application de LERLIC-MS / MS comme indiqué dans cet article vidéo peut aider à élucider le moment Unknown matrices moléculaires de désamidation des protéines. De plus, LERLIC-MS / MS fournit une meilleure compréhension des réactions enzymatiques qui englobent désamidation dans les milieux biologiques distincts.
Introduction
Désamidation est une modification post - traductionnelle des protéines (PTM) qui introduit une charge négative sur le squelette de la protéine par modification de l' asparagine (Asn) et / ou de la glutamine (Gln) les résidus 1. Cette modification tout en affectant des résidus Asn génère les produits isomères d' acide isoaspartique (isoAsp) et l' acide aspartique (Asp) à un 3 commun: rapport 1 2. Néanmoins, ce rapport peut être modifié par l'intervention de l'enzyme de réparation L-isoaspartyl méthyltransférase (PIMT) 3, 4. De même, la désamidation de résidus Gln génère l'acide gamma-glutamique isomérique (γ-Glu) et des isoformes de l' acide alpha-glutamique (α-Glu) à une escompté 1: 7 Ratio 3, 5, mais ce rapport peut être déplacé par l'action de l'enzyme ubiquitaire transglutaminase 2 et d'autres transglutaminases, y compris transglutaminase 1, enzyme récemment identifié comme étant associées à des vésicules extracellulaire dans le cerveau 6.
L'origine de la désamidation peut être soit spontanée ou enzymatique, le premier est particulièrement fréquent sur les résidus Gln dans lequel transglutaminases et d' autres enzymes médient reticulation inter / intra-moléculaire par transamidation (voir 3 pour plus de détails sur Gln transamidation et ses implications dans plusieurs chroniques et maladies humaines fatale). Par conséquent, la désamidation est un PTM qui a une répercussion décisive sur la structure et la fonction des molécules concernées 4, 7, 8 et nécessite une caractérisation chimique en profondeur 3 à la lumière de ses conséquences biochimiques différentes , y compris son service comme horloge moléculaire du vieillissement 9 .
Bien que désamidation des résidus Asn a été relativement bien caractérisé par la protéomique fusil de chasse de bas en haut 1, 10, désamidation de résidus Gln n'a toujours pas une méthode de caractérisation approprié au - delà de l'analyse difficile de composés modèles par fragmentation radical électron-11. Nous avons récemment mis au point une nouvelle stratégie de protéomique de fusil de chasse d' une dimension (LERLIC-MS / MS) 3 qui permet la séparation des isoformes et Gln Asn désamidation à partir d' échantillons biologiques complexes et composés modèles en une seule analyse. LERLIC-MS / MS sont basées sur la séparation des peptides digérés à la trypsine en utilisant une grande longueur (50 cm) sur une colonne échangeuse d'ions (LAX) fonctionnant en mode de chromatographie d'interaction de répulsion hydrophile électrostatique (Erlic) et couplée à spectrométrie de masse tandem (LC- MS / MS). Cette nouvelle stratégie d'analyse a été utilisée pour caractériser et relativement quantifier l'étendue de chaque résidu désamidée dans les tissus du cerveau humainf "> 3. Néanmoins, le protocole décrit ici fournira l' imagerie vidéo de LERLIC-MS / MS visant à étudier les particularités de désamidation des protéines dans le contexte biochimique d'intérêt.
DÉCLARATION ÉTHIQUE
Toutes les procédures de ce protocole ont été approuvés par le comité d'examen institutionnel de l'Université technologique de Nanyang à Singapour et ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Emballage Fanion-échange de grande longueur (LAX) Colonne Capillaire
(Note: Bien que la colonne LAX peut être emballé à domicile que nous décrivons dans ce protocole, les colonnes LAX sont disponibles dans le commerce, voir également le tableau des matériaux et des réactifs pour plus de détails).
- Suspension de 50 mg de matériau de garnissage échangeur d'anions faible dans 3,5 ml de tampon d' emballage (tableau 1) pour préparer la suspension.
- Assembler l'extrémité de la colonne capillaire (longueur 50 cm - tube 200 um de diamètre intérieur (ID)) en utilisant un raccord femelle-femelle, une virole et un écrou femelle. Placez un écran 1/16" OD de 1 micron taille des pores à l'intérieur du raccord femelle-femelle (Note:. L'écran utilisé ici doit avoir plus petite taille des pores de la taille des particules du matériau d'emballage pour empêcher la fuite de la matière de la colonne).
- Emballer le capillaire avec la suspension à l'aide d'une pompe à pression fonctionnant à 4500 psi. (Remarque: Emballez le column jusqu'à ce que le matériau d'emballage est visible à l'entrée de la colonne).
- Assembler l'autre extrémité de la colonne capillaire, comme décrit au point 1.2.
2. Préparation de l'échantillon
Ce protocole décrit l'application de LERLIC-MS / MS pour analyser les tissus du cerveau humain comme modèle protéome. (Nota: Dans le cas d'utilisation d'autres tissus ou des échantillons protéomiques, il convient d'adapter les procédures de préparation d'échantillon).
- homogénéisation des tissus:
une. Laver les tissus cérébraux (50 à 100 mg) avec une solution de tampon phosphate 1x pendant cinq minutes trois fois.
b. Homogénéiser le tissu à 1: 1: 2,5 perles tissu / métal / tampon d'homogénéisation DDC (tableau 2) de rapport (p / p / v) pendant 5 min à 4 ° C dans des tubes en toute sécurité à verrouillage à une intensité maximale à l' aide d' un homogénéisateur de tissus. (Remarque: le tampon d'homogénéisation de la DDC peut inclure des inhibiteurs de protéase comme indiqué précédemment dans 3)
c. Centrifuger l'homogénat de tissu obtenu from de l'étape précédente, à 10.000 x g, 4 ° C pendant 10 minutes et recueillir le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml.
ré. Répétez les étapes bc pour les pastilles restantes et combiner les surnageants autant de fois que nécessaire jusqu'à ce qu'aucune pastille est observée. (Remarque: Si vous devez répéter les étapes bc plus de deux fois, déplacer l'échantillon et les perles à un nouveau tube de verrouillage en toute sécurité pour éviter la perte d'échantillon lors de l'étape de centrifugation).
e. Quantifier la concentration en protéines des homogénats obtenus par dosage acide bicinchoninique (BCA) 12. - Désoxycholate de sodium (DDC) en solution Assistée par digestion tryptique 13 de homogénats du cerveau.
une. Ajouter une concentration finale de ( en utilisant la solution de réserve indiquée dans la solution 5 du tableau 3) à l'homogénat obtenu 10 mM de dithiothréitol (DTT) pour initier la réduction des liaisons disulfure de la protéine.
b. Incuber l'homogénat pendant 30 min dans un bainpré-réglée à 60 ° C.
c. Ajouter à l'homogénat à une concentration finale de 20 mM d' iodoacétamide (IAA) en utilisant la solution mère indiqué dans Solution 7 du tableau 4.
ré. Incuber le broyat contenant IAA à la température ambiante dans l'obscurité pendant 45 min.
e. Diluer l'homogénat de cerveau de deux plis à l' aide du tampon de dilution (solution à 6 du tableau 3).
F. Incuber l'échantillon pendant une seconde étape de réduction pendant 30 minutes à 37 ° C.
g. Ajouter rapport trypsine de qualité séquençage modifié dissous dans la solution 2 du tableau 2 à la protéine-enzyme à 01:50 (p / p).
h. Digérer l'homogénat avec de la trypsine par incubation pendant une nuit à 30 ° C.
je. Stopper la digestion enzymatique, le lendemain, en ajoutant 0,5% concentration finale d'acide formique (FA). (Note: L'ajout de FA provoque la précipitation des sels de la DDC dans des conditions acides.)
j. Vortexer doucement les échantillons contenant de la DDC precipiTates.
k. Pellet vers le bas les sels DDC par centrifugation des échantillons à 12 000 x g, 4 ° C pendant 10 min.
l. Récupérer le surnageant et transférer le liquide dans un nouveau tube propre. (Remarque: Prenez soin pendant la pipetage de cette étape pour ne pas remettre en suspension et / ou recueillir des sels de la pastille DDC).
m. Re-dissoudre le culot dans un tampon DDC de re-dissolution de la DDC (tableau 5) sous vigoureuse agitation par tourbillonnement pendant 1 min.
n. Répétez les étapes Jl deux fois pour récupérer des peptides précipités et combinent les surnageants. (Note:. Voir Serra et al 2016 13 pour plus de détails sur la DDC assistée en solution protocole de digestion tryptique adapté ici.) - Dessalage des échantillons digéré tryptique.
une. Effectuer le dessalage des échantillons digérés à l'aide d'une cartouche de 1 g C-18. (Note: l'utilisation d'une grande cartouche de volume (5 ml), indépendamment de la quantité de garanties obtenue de protéine de nettoyage appropriée des sels restants de la DDC dans les échantillons avantà injection LC-MS / MS).
b. Effectuer le conditionnement de la cartouche 1 g C-18 avec 5 ml d'acétonitrile (ACN).
c. Passer 5 ml de tampon de nettoyage (tableau 6) de la cartouche conditionné 1g C-18 pour éliminer tout solvant organique restant.
ré. Charger l'échantillon à la cartouche 1 g C-18.
e. Effectuer 3 - 5 étapes de nettoyage à l'échantillon dans la colonne 1 g C-18 en utilisant 5 ml de tampon de nettoyage chaque étape.
F. Éluer les peptides dessalée à partir de la cartouche de 1 g C-18 en utilisant 5 ml de tampon d'élution (tableau 7).
g. Sécher les peptides élues dans un concentrateur sous vide.
c. Reconstituer l'échantillon séché dans un volume final de 200 ul de tampon d'élution. (Note:. Utilisation vigoureuse et longue (> 10 min) suivie par sonication tourbillonnement subséquente dans un bain de sonication pendant 30 min à complètement remettre en suspension les peptides séchés dans un tampon d'injection)
ré. Réglez le volume d'injection de l'échantillon pour LERLIC-MS / MS pour analyser entre 1 à 3 ug de protéine.
3. Une dimension LERLIC-MS / MS séparation
- conditions de chromatographie liquide:
Phases mobiles:
A: 0,1% de FA dans l' eau (tableau 8).
B: 0,1% dans ACN FA (tableau 9)
Débit: 0,4 pi / min
Colonne: LAX colonne capillaire (longueur 50 cm - 200 um ID)
une. Utiliser les éléments suivants 1200 min-gradient: 95% de B pendant 40 min, 95-85% de B pendant 434 min, 85-70% de B pendant 522 min, 70-35% de B pendant 124 min, 35-3% de B pendant 45 min , isocratique à 3% de B pendant 5 min, 3 - 95% de B pendant 7 min et maintenu isocratique à 95% de B pendant 23 min.
b. Effectuer la séparation des peptides à l' aide du capillaire LAX comme indiqué dans Serra & Gallart-Palau et al. 3 en utilisant une Chromatographie liquide à très haute pression. - Configuration du spectromètre de masse:
une. Configurer les détails de l'événement d'analyse pour effectuer l'acquisition de données betwe alternatifen pleine transformée de Fourier-spectrométrie de masse (FT-MS) et la spectrométrie de masse à transformée de Fourier-tandem (FT-MS / MS) avec les paramètres suivants:
a.1. mode d'acquisition des données: positif
a.2 paramètres FT-MS:
Gamme de masse: 350 - 2000 m / z
Résolution: 60 000
Microscans: 1 par spectre
Commande automatique de gain: 1 × 10 6
a.3 paramètres FT-MS / MS:
Mode Fragmentation: haute énergie dissociation collisionnelle (HCD)
a.4 plage de masse: 150 - 2000 m / z
a.5 Résolution: 30 000
a.6 ions Top N: 10
Microscans: 1 par spectre
état de charge:> 2+
largeur d'isolement: 2 Da
A.7 commande de gain automatique: 1 × 10 6
b. Effectuer une détection par spectrométrie de masse des peptides , comme indiqué en 3 , en utilisant un spectromètre de masse Orbitrap équipé d'une source d'ions nanoélectrospray travaillant à 1,5 kV.
4. Analyse des données
- effectuer proteà la recherche de base de données à l'LERLIC-MS / MS obtenu des données en utilisant les paramètres suivants à l' aide d' un logiciel spécifique protéomiques: (Note: Voir 3 pour plus de détails.)
une. tolérance Ion: 10 ppm
b. Fragment tolérance d'ions: 0,05 Da
c. Taux de faux positifs (FDR): 1%
ré. Base de données: base de données UniProt humaine
e. modifications fixes: Carbamydomethylation à Cys
F. modifications variables (le cas échéant par le logiciel): Oxydation (Met), désamidation (Asn et Gln). - Caractérisation Confiant et la quantification des produits déamidées dans les données isomériques LERLIC-MS / MS:
une. base de données Export résultats de la recherche de LERLIC-MS / MS à un logiciel spreedsheet pour analyse.
b. Trouver et extraire la liste complète des peptides déamidés et leurs homologues non désamidée.
c. Utilisation de la liste des peptides obtenus comme référence, extraire les chromatogrammes d'ions (Xics) de ces peptides à l'aide d'un logiciel correspond le à 5 ppm de la tolérance de masse. (Remarque:Voir 3 pour plus de détails sur le logiciel utilisé pour l'extraction de Xics.)
ré. Inspecter visuellement les Xics obtenus pour identifier l'élution à double pic séparé des produits isomériques comme indiqué 3. (Note: les produits de ces peptides isomères identifiés au niveau MS / MS peut être facilement trouvé guidée par la présence de deux temps de rétention différents dans le résultat de la recherche de base de données.)
e. quantification relative des produits isomères de chaque site / peptide désamidée doit être effectuée sur la base de l'aire du pic de chaque isomère identifiés dans les Xics obtenus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La désamidation de résidus Gln et Asn est considérée comme une modification de la protéine dégénérative (DPM) impliqués dans plusieurs maladies chroniques et mortelles 14. Il a été démontré que cette PTM peut prédire les états demi-vie et d'anticorps et de dégradation d' autres molécules dans le corps humain et milieux biologiques similaires 1, 15. L'importance de désamidation des protéines, en fait, va au - delà du contexte biomédical, par conséquent , cette modification est présente dans divers protéome 16, 17 et certaines études ont démontré au moment où le potentiel de désamidation pour effectuer une datation précise des peintures et des vestiges archéologiques 18, 19 . Bien que l'importance et la fonctionnalité de désamidation des protéines dans divers milieux ont été confirmés depuis longtemps, laRê était jusqu'à très récemment un manque de progrès technique sur la façon de réaliser une caractérisation approfondie de ce PTM 3.
Application de LERLIC-MS / MS 3, comme représenté sur la figure 1, fournit pour la première fois et en un seul passage résolu séparation des Gln et Asn désamidée isoformes à partir de composés protéomes complexes ou modèle même pour les peptides présentant deux désamidés indépendant Asn et Gln proteoforms.
Figure 1: Schéma de LERLIC-MS / MS Workflow pour la séparation et la quantification des Gln et Asp désamidation Produits à partir d' échantillons complexes par fusil de chasse Proteomics. LERLIC-MS / MS implique l'extraction des protéines et la digestion enzymatique avant la séparation d'une dimension de peptides par LC-MS / MS en utilisant la LAX colonne capillaire. Anala lyse des Xics permettre l'identification des produits isomériques désamidation éluées à différents temps de rétention en fonction de leur acidité différente 3, 20, 21. MS / MS permet une discrimination entre les peptides désamidées et non désamidée et identification confiance du résidu désamidée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Les résidus Gln intermédiaires enzymatiquement modifiés de transamidation présentant un rapport γ / α-glutamyl inversé (figure 2) peuvent être découverts et caractérisés par LERLIC-MS / MS, ce qui pourrait avoir des conséquences importantes sur l'étude des proteinopathy dans les maladies neurodégénératives 3, 22, 23 , 24. De plus, comme indiqué précédemment dans la Serra & Gallart-Palau 2016, plusieurs protéines de substrat de PIMT inconnue présentant un rapport isoAsp / Asp inversé dans les résidus déamidées Asn peuvent également être identifiés dans les tissus humains par LERLIC-MS / MS 3.
Figure 2: Inspection des Xics et identification du double temps de rétention à la MS / MS niveau pour les Peptides déamidés permettent de caractériser et Gln Asn déamidés et Isomères Identification des produits de réactions enzymatiques cruciales qui ont lieu dans désamidation. une. Détail de l'XIC montrant les deux pics correspondant aux γ / α-glutamyle isomères du peptide FQMPDQGMTSADDFFEQ # GTK de la protéine du cerveau DPYL2 dihydropyrimidinase-protéine apparentée à 2. Le rapport γ / α-glutamyl inversé detected en ce que le peptide indique l'implication potentielle de l'espèce contenant du glutamyl-γ de la réaction de transglutamination comme intermédiaire γ-glutamyl transglutaminase. Le résidu désamidée a été vérifié par MS / MS à la fois des temps de rétention, b. à 389,1 min correspondant au peptide contenant un α-glutamyle et c. à 401,4 min correspondant au peptide contenant-glutamyl-γ de. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
En tant que nouveauté de cet article, nous avons constaté que LERLIC-MS / MS permet la caractérisation de l'intermédiaire succinimide (Figure 3). L'utilisation d' un pH légèrement acide au cours du traitement de l' échantillon stabilise le succinimide intermédiaire dans les résidus Asn 25 modifié. Par conséquent, LERLIC-MS / MS permet l'étude du protéome à l'échelle de la succinimide intermédiaire, une modification labile et mal compris avec des conséquences physiologiques et pathologiques significatives 26.
Figure 3: Identification de la succinimide intermédiaire dans les résidus Asn par LERLIC-MS / MS. une. Spectre du peptide Asn désamidée YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR de la protéine du cerveau ALDO C aldolase résidu C Désaminée est indiqué comme Deam-Asn. b. Spectre du peptide YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, qui dans ce cas présente un décalage massique de -17 Da au résidu Asn précédemment désamidée (Scc-Asn) en raison de la perte d'ammonium qui ont lieu pendant la formation de l'intermédiaire succinimide. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande eest la figure.
| Composant | Montant pour 100 ml |
| isopropanol | 90 ml |
| Eau | 10 ml |
Tableau 1. Composition du tampon de conditionnement (isopropanol 90%).
| Solution 1: 1 M d'acétate d'ammonium. | |
| Composant | Montant pour 50 ml |
| Acétate d'ammonium | 3,86 g |
| L'eau (faire jusqu'à 50 ml) | ~ 50 ml |
| Solution 2: 100 mM d'acétate d'ammonium. | |
| Composant | Montant pour 50 ml |
| solution 1 | 5 ml |
| Eau | 45 ml |
| Solution 3: 10% désoxycholate de sodium. | |
| Composant | Montant pour 1 ml |
| désoxycholate de sodium | 0,1 g |
| Eau | 1 ml |
| Solution 4: tampon d'homogénéisation DDC (100 mM d'acétate d'ammonium contenant 1% de désoxycholate de sodium). | |
| Composant | Montant pour 10 ml |
| solution 2 | 9 ml |
| solution 3 | 1 ml |
Tableau 2. Tampon SDC Homogénéisation Composition (100 mM d'acétate d' ammonium contenant 1% de désoxycholate de sodium). Préparer le stock Solution de 1 M d'acétate d'ammonium (solution 1) et diluer pour obtenir 100 mM d'acétate d'ammonium (solution 2). En outre, la préparation de la solution mère de 10% de désoxycholate de sodium (Solution 3). Préparer le tampon d'homogénéisation DDC comme décrit dans Solution 4.
| Solution 5: 1 M DTT | |
| Composant | Montant pour 10 ml |
| dithiothréitol | 77 mg |
| Solution 2 (voir le tableau 2) | 0,5 ml |
| Solution 6: Tampon de dilution | |
| Composant | Montant pour 10 ml |
| solution 5 | 0,1 ml |
| Solution 2 (voir le tableau 2) | 9,9 ml |
Tableau 3. Composition du tampon de dilution (100 mM d'acétate d' ammonium contenant 10 mM de dithiothréitol (DTT)). Préparation de la solution mère de 1 M DTT (Solution 5) et préparer ensuite le tampon de dilution tel que décrit à la solution 6.
| Solution 7: 1 M IAA | |
| Composant | Montant pour 10 ml |
| IAA | 93 mg |
| Solution 2 (voir le tableau 2) | 0,5 ml |
Tableau 4. Alkylation tampon Composition (100 mM d'acétate d' ammonium contenant 20 mM d' iodoacétamide (IAA)). Préparer la solution mère de 1 M IAA (Solution 7).
| Composant | Montant pour 50 ml |
| L'hydroxyde d'ammonium | 0,25 ml |
| Eau | 24,75 ml |
Tableau 5. Tampon SDC redissolution Composition (0,5% d'hydroxyde d' ammonium).
| Composant | Montant pour 100 ml |
| L'acide trifluoroacétique | 0,1 ml |
| Eau | 99,9 ml |
Tableau 6. Tampon de nettoyage (0,1% d' acide trifluoroacétique).
| Composant | Montant pour 100 ml |
| acétonitrile | 75 ml |
| Acide formique | 0,1 ml |
Tableau 7. Elution Buffer (75% d' acétonitrile, 0,1% d' acide formique).
| Composant | Montant pour 1 000 ml |
| Acide formique | 1 ml |
| Eau | 999 ml |
Tableau 8. Phase mobile A Composition.
| Composant | Montant pour 1 000 ml |
| Acide formique | <td> 1 ml|
| acétonitrile | 999 ml |
Tableau 9. Phase mobile B Composition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans cette vidéo-article , nous présentons un protocole étape par étape de LERLIC-MS / MS 3, un procédé pour effectuer une caractérisation en profondeur et de déterminer avec précision l'étendue de la désamidation de la protéine et des procédés enzymatiques impliquées sur cette modification de la protéine. LERLIC-MS / MS est basée sur l'utilisation d'une longue longueur (50 cm) LAX selon le principe de chromatographie d'interaction de répulsion électrostatique hydrophile (Erlic) 27. L'utilisation d'une colonne de longue durée, comme indiqué dans notre étude 3, maximise le potentiel de Erlic à des peptides séparés en fonction de leur point isoélectrique 27.
LERLIC-MS / MS représente un nouveau fusil de chasse unidimensionnelle stratégie de séparation, un flux de travail qui permet d' économiser du temps sur les mains pendant le traitement des échantillons bien qu'il nécessite un gradient de 1200 min comme indiqué dans 3 pour obtenir des résultats optimaux sur protéome très complexes. A 60 min gradient dans LERLIC-MS / MS peut également obtenir une séparation optimale des isoformes de Gln désamidation sur des composés modèles pour la première fois en protéomique fusil de chasse 3. Sur la base de ces deux applications, nous pensons que la deuxième séparation de dimension effectuée par capillaire LAX peut être couplé à une première dimension chromatographie en phase inversée dans une approche de chromatographie multidimensionnelle pour l'analyse d'échantillons de complexité moyenne, un flux de travail utilisé précédemment par notre groupe 10.
La préparation des échantillons pour l'analyse de désamidation des protéines est une étape cruciale qui exige une attention particulière à prévenir l'apparition de désamidation artefactuelle sur les résidus Asn dans une large mesure 1. Hao et al. ont trouvé que la digestion trypsique à un pH légèrement acide empêche de façon significative l' apparition de la désamidation artéfactuelle lors de la préparation de l' échantillon 28. Nous avons utilisé dans cette étude notre DDC a contribué à la solution essayerdigestion CITP 13, un procédé dans lequel le traitement des échantillons est réalisée à un pH de 6. D'autre part, des conditions acides plus fortes pourrait remettre en question la capacité de digestion de la trypsine lorsque le pH est maintenu inférieur à 29 6. Pour répondre à cette question, très récemment Liu et al. ont rapporté une stratégie optimale de digestion qui permet la digestion réussie et la prévention de l'apparition de désamidation artefactuelle sur les résidus Asn en remplaçant trypsine par Glu-C à pH 4,5 30. La mise en œuvre de la méthode de digestion rapporté par Liu et al. 30 à Analysons Asn désamidation par LERLIC-MS / MS pourrait être une stratégie potentielle qui nécessite une vérification expérimentale.
Le protocole décrit dans cette vidéo-article a un grand potentiel pour caractériser et quantifier les tableaux de rapport isoforme actuellement inconnus qui définissent l'implication de désamidation des protéines dans le vieillissement et les maladies humaines. FourrureThermore, application de LERLIC-MS / MS dans d'autres milieux biologiques aidera à déterminer les potentialités et les risques de désamidation des protéines comme une modification de l'horloge moléculaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été en partie financé par des subventions du ministère singapourien de l'éducation (Niveau 2: Grant ARC9 / 15), Conseil national de recherches médicales de Singapour (NMRC-DE-IRG-0003-2016) et NTU-LPN vieillissement Subvention de recherche ( Grant ARG / 14017). Nous tenons à exprimer notre gratitude et ses remerciements les plus sincères au Dr Andrew Alpert et de l'équipe PolyLC pour nous a gentiment fourni les matériaux d'emballage qui ont rendu possible cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
