Summary
Arrière-plan autofluorescence des échantillons biologiques complique souvent basés sur la fluorescence des techniques d’imagerie, en particulier dans les tissus de postmitotiques humains âgés. Ce protocole décrit comment l’autofluorescence de ces échantillons peut être efficacement enlevé avec une lampe disponible dans le commerce, émettant une lumière diode source vers photobleach l’échantillon avant immunostaining.
Abstract
Immunofluorescence est une méthode couramment utilisée pour visualiser les compartiments subcellulaires et déterminer la localisation des protéines spécifiques au sein d’un échantillon de tissu. Un grand obstacle à l’acquisition d’images de haute qualité immunofluorescence est endogène autofluorescence des tissus causés par des pigments de vieillissement tels que de lipofuscine ou par des procédés de préparation échantillon commun comme la fixation de l’aldéhyde. Ce protocole décrit comment la fluorescence de fond peut être considérablement réduit par le biais de photoblanchiment de l’utilisation de phosphore blanc luminescent baies de diode électroluminescente (del) avant le traitement avec des sondes fluorescentes. L’émission à large spectre de phosphore blanc LED permettre pour la décoloration des fluorophores dans un éventail de pics d’émission. L’appareil de photoblanchiment peut être construits à partir des composants sur étagère à très bas prix et offre une alternative accessible aux extincteurs chimiques disponibles dans le commerce. Un prétraitement de photoblanchiment du tissu suivi classique immunofluorescence souillant génère des images sans fond autofluorescence. Par rapport à mis en place des extincteurs chimiques qui réduit la sonde comme arrière-plan signale, photoblanchiment traitement n’a eu aucun effet sur l’intensité de fluorescence sonde alors qu’elle a effectivement réduit fluorescence de fond et de lipofuscine. Bien que photoblanchiment nécessite plus de temps pour le prétraitement, supérieur intensité LED tableaux peuvent servir à réduire le temps de photoblanchiment. Cette méthode simple peut potentiellement être appliquée à une variété de tissus, tissus particulièrement mitotiques qui s’accumulent lipofuscine tels que le cerveau et les muscles cardiaques ou squelettiques.
Introduction
La microscopie de fluorescence en utilisant des anticorps ciblant les protéines spécifiques est régulièrement utilisée pour visualiser les protéines d’intérêt dans la culture de cellules et de tissus. Une complication majeure à l’acquisition des images claires et définitives en immunofluorescence est autofluorescence, qui peut être causée endogène dans les tissus de mammifères de la lipofuscine de pigment d’âge et de protéines telles que l’élastine et du collagène1, 2. Autres sources d’autofluorescence peuvent être introduits par étapes de préparation d’échantillon comme aldéhyde fixation3. Granules de lipofuscine, composés essentiellement de protéines modifiées par oxydation et résidus de dégradation des lipides, s’accumulent dans les cellules longue durée de vie accrue âge2. Cela provoque des difficultés dans l’imagerie des tissus postmitotiques comme le cerveau et les muscles cardiaques ou squelettiques, comme le spectre d’émission de fluorescence de lipofuscine est large et variable, qui coïncide souvent avec la longueur d’onde d’émission des fluorophores courants utilisés pour 4l’étiquetage. Ces facteurs rendent l’imagerie des tissus cérébraux humains provenant de cas de maladies neurodégénératives tardives comme la dégénérescence lobaire fronto-temporale (FTLD) particulièrement difficile.
Pour réduire l’autofluorescence, nous avons mis au point une technique dans laquelle nous irradier les sections de tissu monté sur glissière avec une lumière blanche émettant réseau de diodes (LED) à l’aide d’une lampe de bureau domestique5. Cette technique simple fournit une alternative aux techniques qui utilisent des extincteurs chimiques telles que CuSO4 dans l’acétate d’ammonium, ou disponible dans le commerce de trempe des colorants tels que le Soudan noir B et noir d’ériochrome T6. Il dispose également d’importante économies sur multispectral conduit techniques de photoblanchiment de lampe et évite les complications et les objets générés à partir des méthodes d’épilation autofluorescence numérique comme spectrale non mélange7,8. Phosphore blanc LEDs ont un large spectre d’émission, une haute luminosité et un coût de fabrication faible, ce qui les rend idéales comme une composante standard de photoblanchiment une variété de chromophores5,9.
Dans ce protocole, nous démontrer la construction d’un appareil de photoblanchiment utilisant des composants accessibles et appliquent le photoblanchiment à un cas de tissu FTLD contenant des inclusions tau-positive (FTLD-T) à l’aide d’un anticorps spécifique de la protéine tau phosphorylée. Nous démontrons l’effet de photoblanchiment sur l’imagerie des anticorps fluorescent marqués employant deux chromophores couramment utilisés : Alexa 488 et Texas Red. L’effet de photoblanchiment versus sections non traitées ou ceux traités avec un extincteur chimique commercial sont quantifiés et comparés. Ce prétraitement photobleaching peut être incorporé à n’importe quel protocole de coloration standard immunofluorescence pour enlever l’autofluorescence dans un échantillon biologique.
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Protocol
Remarque : le travaux présenté ont été réalisés en conformité avec les normes internationales reconnues, y compris la Conférence internationale sur l’harmonisation (CIH), le Conseil des organisations internationales des Sciences médicales (CIOMS) et les principes de la déclaration d’Helsinki. Utilisation de tissus humains a été avec l’approbation du University Health Network Research Ethics Board. Le cerveau humain ont été échantillonnés dans le cadre de la Banque de tissus de cerveau Maritime. Au moment de la collecte, le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients.
1. construction d’appareils de photoblanchiment et solutions
- préparation des solutions mères.
- Préparer 1 L de solution stock tampon Tris salin (1 x TBS) (NaCl 150 mM, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) en dissolvant 8,77 g de NaCl et 6,06 g de Tris 1 x base dans 800 mL de ddH 2 O et ajuster le pH à 7.4 à l’aide de HCl. amener le volume à 1 L et autoclave. < / Li >
- préparer l’azoture de sodium 10 % (stock de 200 x) dissoudre 1 g de l’azide de sodium dans 10 mL de ddH 2 O (10 %, stock 200 x).
- Pour les lames de 1-3 de taille standard, utiliser un seul 100 x 100 mm transparent, carré Pétri comme une chambre de la diapositive. Pour une chambre seule diapositive, ajouter 0,25 mL de 200 actions de l’azoture de sodium x à 50 mL de 1 x TBS pour faire une solution d’azoture-TBS de 0,05 %. Empiler les 2-3 chambres de glisser verticalement pour traiter des diapositives supplémentaires. Préparer une supplémentaire 50 mL de solution d’azoture-TBS pour chaque chambre.
- Créer un échafaudage pour élever les glissière ou des chambres, telle qu’une tête de la lampe peut s’adapter sous.
Chambre de diapositive
- pour un 100 mm x 100 mm, découper des ouvertures dans le fond et les côtés d’un 100 mm x 100 mm x 30 mm en plastique alimentaire contenant et renverser le conteneur. S’assurer que les ouvertures latérales sont assez grands pour s’adapter à une source lumineuse de LED et de garantir l’ouverture inférieure est assez grand, telles que la lumière de la source lumineuse atteigne le compartiment de mesure sans entrave.
- Appliquer du ruban adhésif électrique à l’échafaud pour augmenter l’adhérence entre l’échantillon chambre/portatifs et d’établi l’échafaud. Utiliser des matériaux alternatifs pour construire l’échafaud tant qu’il élève solidement la chambre diapositive sans empêcher la lumière d’atteindre l’échantillon.
- Retirer des diffuseurs ou plastique opaque de la lampe de bureau qui peut entraver la lumière LED de parvenir directement à l’échantillon (si possible) et orienter la matrice de LED vers le haut. Placer l’échafaudage et la faire glisser ou des chambres au-dessus de la matrice de LED. Utiliser une lampe avec un cou flexible pour une manipulation facile.
- Construire un dôme réfléchissant couvre pour l’appareil de doublure à l’intérieur d’une zone assez large pour couvrir la chambre diapositive et échafaudage avec du papier aluminium. Utilisez une boîte de pointe de pipette de 1 mL pour une seule chambre ou un 150 mm x 150 mm x 150 mm carton multiples, verticalement empilés chambres.
2. Photoblanchiment prétraitement des sections de tissu
Remarque : préparation du tissu section peut varier selon la provenance du tissu et fixation et incorporation des méthodes utilisées. Ici, les tissus cérébraux (orbitofrontal gyri) d’un cas de FTLD-T a été fixé pour environ 2 jours dans du formol, traversent un gradient de sucrose, incorporé en OCT et couper à 10 µm de coupes épaisses à l’aide d’un cryostat.
- Froid ° c dans un 4 chambre, armoire froide ou réfrigérateur, orienter la lampe sous l’échafaud et placer la chambre de mesure sur l’échafaud. Verser 50 mL de solution d’azoture-TBS dans le compartiment de mesure.
- Des sections de tissu Submerge monté sur lames de microscope standard verre dans la chambre de la diapositive contenant l’azoture-TBS avec une pincette propre. Pour plusieurs diapositives, assurez-vous que les lames soient placés dans la chambre sur une seule couche.
- Couvrir l’appareil avec la coupole réfléchissante, allumez la lampe LED et incuber pendant 48 h à 4 ° c.
3. Immunofluorescence
- à tacher le tissu pour la protéine tau phosphorylée utilisant contre-colorant DAPI et Alexa 488 - et anticorps secondaires conjugué Texas Red, d’abord préparer des solutions pour la recherche d’antigène, perméabilisation, blocage et primaire liaison de l’anticorps.
Tampon de
- préparer 500 mL de recherche d’antigène (acide citrique 10 mM, 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique, 0,05 % Tween 20 ; pH 6.2) en dissolvant 0,92 g d’acide citrique et 0,37 g de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans 500 mL de ddH 2 O. ajuster le pH 6.2 avec NaOH et ajouter 0,25 mL de Tween 20.
- Préparer 500 mL de 0.025 % X-100 Triton dans la solution du SCT (SCT-Triton) en ajoutant 0,125 mL de Triton X-100 à 500 mL 1 x directives du SCT.
- Préparer une solution de 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) au SCT (tampon BSA-TBS) dissoudre 0,1 g de BSA dans 10 mL de directives du SCT.
- Préparer une solution de blocage en ajoutant 0,2 mL de sérum de chèvre normal à 1,8 mL de 1 % BSA/directives du SCT.
- Pour chaque diapositive, préparer 150 µL de solution d’anticorps primaire (dilution 1 : 100) en pipettant : 1,5 l d’anti-phospho-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) anticorps dans 148,5 µL de 1 % BSA-TBS tampon et laisser sur glace
- Pour effectuer la recherche d’antigène, submerger les diapositives photobleached verticalement dans un collecteur de diapositive contenant 25 mL de tampon d’extraction antigène. Fixer le collecteur avec du ruban et/ou chaînes telles que le collecteur ne tombe pas dans l’eau du bain. Chauffer le collecteur dans un bain d’eau à 90 ° c pendant 30 min et laisser le collecteur refroidir à température ambiante pendant 30 min avant de retirer les lames. Ne supprimez pas les diapositives immédiatement car il provoquera les sections à se dessécher.
- Transférer les lames du collecteur de récupération de l’antigène dans un pot de coloration contenant 30 mL de SCT-Triton et laver les sections pendant 5 min dans un agitateur orbital avec agitant doucement. Répéter le lavage une fois avec frais de SCT-Triton. Évacue l’excès de tampon à l’extérieur avec un chiffon non pelucheux et contournez le tissu avec un stylo hydrophobe. Prendre soin de ne pas pour laisser les diapositives à sécher.
- Pour chaque diapositive, bloquer le tissu par pipetage 200 µL de solution sur le tissu de blocage et placez la lame dans une chambre humidifiée. Aménager la chambre en plaçant une grille coulissante à l’intérieur d’une boîte de pointe de pipette contenant une serviette de papier humide. Incuber à température ambiante pendant 2 h sur une surface plane. S’assurer que la solution de saturation couvre entièrement le tissu.
- Enlever la solution de saturation par aspiration et distribuer 100-150 µL de solution d’anticorps primaire sur le tissu. Assurer un volume suffisant d’anticorps est présent et que la section est sur une surface plane afin d’éviter la mise en commun de la solution d’anticorps d’un côté. Incuber à 4 ºC pendant la nuit dans une chambre humidifiée.
- Préparer le mélange de l’anticorps secondaire et le contre-colorant nucléaire DAPI.
- Pour chaque diapositive, préparer 150 µL du mélange d’anticorps secondaire (dilution au 1/100) en ajoutant 1,5 µL de chèvre anti-souris Alexa 488 et 1,5 µL de chèvre anti-souris Texas Red à 147 µL de BSA-TBS et laisser sur la glace.
- Prepare 0,1 µg/mL DAPI contre-coloration par dilution en série. Bien mélanger la solution étalon et diluer 1 µL de stock 5 mg/mL DAPI dans 999 du SCT pour faire 1 mL de 5 µg/mL de solution. Pour chaque diapositive, diluer 3 µL de 5 µg/mL de solution avec 147 µL du SCT à une concentration finale de 0,1 µg/mL.
ATTENTION : DAPI est un mutagène connu et doit être manipulé avec soin.
- Enlever l’anticorps primaire par aspiration. Plonger les lames dans un verre de coloration jar contenant 30 mL de SCT-Triton et lavage pendant 5 min avec un mélange doux dans un agitateur orbital. Répétez l’étape de lavage avec frais de SCT-Triton. Mèche extérieur excédentaire du SCT-Triton et distribuer 100 à 150 µL du mélange d’anticorps secondaire à chaque diapositive.
- S’assurer que le tissu est entièrement couvert par le mélange d’anticorps. Incuber pendant 2 h à température ambiante dans la chambre humidifiée dans le noir.
- Enlever le mélange d’anticorps secondaire par aspiration et transférer la lame dans un verre à coloration jar contenant 30 mL du SCT (aucun Triton). Laver pendant 5 min avec un mélange doux dans un agitateur orbital. Répéter l’étape de lavage avec frais SCT. déposer 100 à 150 µL de contre-colorant DAPI 0,1 µg/mL dans chaque diapositive et incuber pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Transférer les diapositives à un verre bocal contenant du SCT de coloration et laver 3 fois avec un mélange doux de 5 min chacun, à l’aide du SCT frais pour chaque lavage. Excès loin de tampon mèche.
- Appliquer 3 gouttes de milieu de montage aqueux pour le tissu. À l’aide de pinces, abaissez doucement une lamelle de verre propre sur le tissu, en commençant par un bord et abaisser lentement l’autre bord pour éviter le piégeage de bulles d’air. Prendre soin de ne pas pour déloger la lamelle si imagerie immédiatement. Sinon, laisser sécher avant de les stocker à 4 ° c dans l’obscurité, le milieu de montage.
4. La microscopie en fluorescence
- tournant sur la lampe à fluorescence, le microscope et l’ordinateur et laisser réchauffer pendant 15 min. Place le tissu taché les lames dans le stade de microscope de fluorescence de la lampe. L’image du champ lumineux permet de localiser le tissu à un grossissement de 10 x.
- Une goûte de ddH 2 O à la surface de la lamelle couvre-objet et utilisez un objectif d’immersion de l’eau 20 x (NA = 1,0). Sélectionnez le scan de plan moyen 4 lignes définissant. Définir la taille de trou d’épingle à 1 unité aérée qui donne une tranche optique de ~ 3 microns. Choisissez les laser d’excitation et d’émission longueurs d’onde pour chaque fluorophore dans des pistes séparées pour la meilleure qualité de signal.
NOTE : Alexa 488 : λ ex = 488 nm (laser à l’argon) λ em = 493-570 nm ; Texas Red : λ ex = 561 nm (laser de DPSS 561 nm), λ em = 601-635 nm ; DAPI : λ ex = 405 nm (laser Diode 405), λ em = 410-507 nm.- Régler la puissance du laser et réglages pour optimiser l’intensité du signal pour chaque piste de gain. Collecter l’image composite et sauver. Utiliser les mêmes paramètres de laser pour comparer les intensités de fluorescence dans une diapositive différente.
- Pour la visualisation de l’intensité de la fluorescence dans chaque canal, installer la macro d’outils profil RVB pour ImageJ 10. Enregistrez la macro à partir de la page Web comme un fichier texte (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). Dans le menu de ImageJ, sélectionnez Plugins - > Macros - > installer ; Sélectionnez le fichier texte pour installer l’outil de profils RVB.
- Ouvrir le fichier image confocale dans ImageJ et convertir les images composites depuis les 3 piles en RVB en procédant comme suit : Image - > Color - > outil de canal. Sélectionnez " Composite " depuis le menu déroulant et vérifier tous les trois canaux. Puis, sélectionnez Image - > Type - > couleur RVB.
- Sélectionner l’icône d’outils profil RVB et tracez une ligne à travers la section dans l’image que nous vous présentons. Enregistrer les données d’intensité dans une feuille de calcul pour le traçage.
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Representative Results
L’étape de prétraitement photobleaching peut être ajoutée à un protocole standard d’immunofluorescence immédiatement avant la recherche d’antigène et immunostaining (Figure 1 a). Assemblage de l’appareil de photoblanchiment peut également être effectuée à l’aide de divers, composants sur étagère peu coûteux (Figure 1 b). Le spectre d’émission du phosphore blanc LED couvre un large éventail de longueurs d’onde qui les rend convenant au large éventail photobleaching, être d’accord avec les précédents rapports (Figure 1)5,11. Après photoblanchiment de 48 h, l’intensité des mouchetures auto-fluorescente qui ressemblent à la lipofuscine ainsi que fluorescence de fond générale a été considérablement réduite dans les deux longueurs d’onde d’émission dans une section non colorée de FTLD-T (Figure 1). Démontrer l’efficacité de photoblanchiment, nous colorées pour tau hyperphosphorylée de visualiser des inclusions tau pathologiques dans une affaire de FTLD-T à l’aide de deux types d’anticorps secondaires. La forme distincte d’inclusions tau et l’utilisation de deux chromophores pour l’étiquetage également permettent de distinguer avec certitude auto-fluorescente caractéristiques les cibles afin de valider la technique.
Dans l’image composite à plus faible grossissement, la morphologie des inclusions tau-positif, coloré jaune de la combinaison de canaux Alexa 488 et Texas Red, est constitué des collections en forme d’anneau de processus cellulaires courts qui sont appelés ' astrocytaires plaques' (Figure 2 a- c). Cette morphologie est caractéristique des cortico-basale dégénérescence (CDB)12,13, qui est d’accord avec le rapport de pathologie de l’espèce. Dans l’échantillon non traité, de nombreuses structures sont présentes dans l’image composite qui ne pas ressembler à des inclusions tau et a montré de fluorescence principalement dans le canal rouge, suggérant qu’il s’agit d’autofluorescence plutôt que prévue des anticorps. Un remarquable niveau de fluorescence de fond est également visible dans ce canal dans son champ de vue (Figure 2 a). Ces fonctionnalités auto-fluorescente sont supprimées et l’image globale apparaît beaucoup plus propre lorsque des échantillons ont été traités avec le photoblanchiment (PB) et l’extincteur chimique (Figure 2 b-c).
Puis, nous avons mesuré les différences de fluorescence dans ces échantillons par une plus petite région dans chaque échantillon de profilage. Une seule plaque astrocytaires est présentée dans chaque condition de traitement aux fins de comparaison (Figure 2d-r). Dans l’échantillon non traité, la fluorescence de fond est présent dans les trois canaux, mais la fluorescence d’anticorps secondaire des anticorps fois Alexa 488 et Texas Red était relativement élevé (Fig 2h). Toutefois, les structures auto-fluorescente présents dans l’échantillon non traité avaient des intensités de fluorescence dans le chenal de Texas Red comparable à l’anticorps secondaire de Texas Red qui maculait pour tau (Figure 2 h). Si la protéine cible n’ont pas une morphologie distincte et prévisible tels que tau dans notre cas, l’autofluorescence dans le tissu aurait rendu l’image ininterprétable.
En revanche, quand le photoblanchiment avant le traitement a été appliqué avant l’immunomarquage, fluorescence de fond dans l’Alexa 488 et Texas Red channels a été sensiblement réduite par rapport à l’échantillon non traité et la fluorescence de l’immunomarquage tau est restée inchangée (Figure 2i-m). L’extincteur chimique commercial trempé l’autofluorescence dans le chenal de Alexa 488 juste aussi efficacement que le photoblanchiment. Il supprima également fluorescence de fond DAPI, qui n’est pas affectée par le traitement de photoblanchiment de 48 h (Figure 2 m). Toutefois, l’extincteur chimique a également réduit l’intensité du Texas Red secondaire et signaux DAPI, ce qui suggère un certain degré de trempe contre-productif (Figure 2n-r).
Figure 1 : Application de photoblanchiment de prétraitement dans un flux de travail standard immunofluorescence. A) schéma simplifié du protocole standard immunofluorescence d’acquisition de tissus à l’imagerie. Application d’anticorps fluorescents primaires et secondaires est représentée par les dessins animés. Une image représentative de microscope est produite. Echelle = 100 µm. B) un appareil représentatif de photoblanchiment construit à l’aide de composants sur étagère (couvercle réfléchissant n’est pas indiquée). C) spectre d’émission de la matrice de LED blanche. Un pic d’émission étroites à 450 nm et un pic large à 550 nm sont observées. D) effet de photoblanchiment sur la fluorescence de fond endogène du tissu FTLD-T à Alexa 488 (493-570 nm) et de longueurs d’onde d’émission du Texas Red (601-635 nm). Auto-fluorescente mouchetures ressemblant à la lipofuscine sont visiblement atténuées après photoblanchiment de 48 h. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2:effet de l’autofluorescence enlèvement sur la qualité de l’image d’un cas de tissu FTLD-T avec tau phosphorylée anti immunostaining. a à c) faible grossissement, immunofluorescence composite d’images de représentatifs de champs de vision en non traitées (a), (c) échantillons de traités de photobleached pendant 48 h (b) et Extincteur chimique. Couleurs représentent la fluorescence dans les canaux suivants par l’excitation de leurs sources lumineuses respectives : Alexa 488 (vert) : λex = 488 nm (laser à l’argon) λem = 493-570 nm ; Texas Red (rouge) : λex = 561 nm (laser de DPSS 561 nm), λem = 601-635 nm ; DAPI (bleu) : λex = 405 nm (laser Diode 405), λem = 410-507 nm. Echelle = 100 µm. d-r) des images de grossissement supérieure des régions en pointillé dans non traitée (d-g), photobleached (i-l) et des échantillons d’Extincteur chimique traité (n-q), avec des canaux distincts de fluorescence, image a fusionné et quantifié les profils de signal de fluorescence. Les lignes pointillées dans les canaux fusionnées (g, l, q) représentent la ligne sur lesquels le signal profils (h, m, r) ont été générés. Echelle = 50 µm. auto-fluorescente particules (af),immunomarquées tau fluorescence (tau) et signal de noyau (nuc) sont indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le prétraitement de photoblanchiment de tissus visés dans ce manuscrit permet une élimination effective d’autofluorescence utilisant des composants sur étagère. Le protocole décrit l’imagerie immunofluorescence des agrégats de protéine tau phosphorylée dans les tissus fixés au formol un cerveau humain en utilisant des anticorps secondaires conjugués à Alexa 488 et Texas Red, au DAPI comme contre-colorant nucléaire. Pour appliquer la méthode à d’autres tissus, nous recommandons de procéder à un traitement préalable de photoblanchiment de 48 h à l’échantillon comme point de départ. Après photoblanchiment, effectuez le standard immunofluorescence souillant le protocole pour les fonctionnalités d’intérêt en utilisant des dilutions d’anticorps suite aux recommandations du fabricant. Si la fluorescence de fond est toujours présent, l’anticorps étapes de coloration et/ou de la durée de photoblanchiment devront être modifiées. La durée de photoblanchiment variera selon la lampe sélectionnée pour construire l’appareil et le niveau d’autofluorescence dans l’échantillon. Le moment optimal de blanchiment pour chaque appareil lampe unique doit être déterminé. Cela peut être fait par photoblanchiment une section de tissu couvertes colorées ou non, monté au SCT-azide et mesurer la fluorescence endogène de la glissoire à intervalles de 12 h à l’aide d’un microscope à fluorescence. Dans les rapports précédents, nous avons suivi la lipofuscine photoblanchiment par analyse de particules et courbe de décroissance exponentielle fonctions5, mais par souci de simplicité, l’observation visuelle des sections à intervalles réguliers peut être tout aussi efficace pour juger de la durée à laquelle la plupart de la fluorescence devient trempée. Dans notre cas du tissu de cerveau âgé contenant des quantités élevées de pigments de lipofuscine, 48 h d’incubation avec une lampe de 800 lux était suffisante. Si le signal spécifique reste faible par rapport à l’arrière-plan après photoblanchiment, envisagez d’augmenter la concentration d’anticorps primaires et secondaires pendant la coloration. Il est également important d’effectuer un contrôle secondaire d’anticorps seule pour s’assurer que le signal de fond n’est pas causé par la liaison de l’anticorps secondaire non spécifique. Prenez soin de sélectionner que pas de réaction croisée des anticorps, en particulier en souillant pour plusieurs cibles. En outre, veiller à ce que les signaux spécifiques ne sont pas piégés par inadvertance pendant le processus de coloration. Par exemple, la coloration de Nissl (pour la coloration des neurones) est piégée par BSA. Dans ce cas, le composant de BSA de la solution de blocage devrait être remplacé par des solutions de rechange telles que poisson peau gélatine5.
L’utilisation de phosphore blanc LED pour photoblanchiment comporte certaines limites en raison de son spectre d’émission de 420 nm et 650 nm. Ainsi, aucun photoblanchiment significatif dans les longueurs d’onde UV n’est possible. Aussi, en raison de la large gamme d’émissions, chromophores photoblanchiment de longueurs d’onde spécifiques nécessite des modifications telles que feuilles de filtre de couleur ci-dessus les baies de LED pour filtrer les longueurs d’onde d’émission indésirable qui vient se superposer. En outre, le photoblanchiment du tissu peut exiger des délais de traitement plus longues que les autres méthodes. Dans ce cas, en raison de l’âge des tissus cérébraux (émanant d’une personne âgée de 89 ans) et la période de fixation aldéhyde longue de plus de 2 jours, une durée de photoblanchiment 48 h était nécessaire. Bien qu’aucun délai de traitement actif n’est nécessaire, on doit prendre en considération le temps photobleaching et planifier la session coloration en conséquence. Lampes à LED de luminosité plus élevée ou de l’utilisation de multiples lampes peut réduire considérablement le temps de photoblanchiment par la simple augmentation du flux de photons.
Par rapport aux méthodes existantes, notre technique offre plusieurs avantages importants. À la différence de photoblanchiment utilisant des lasers de balayage en microscopie de fluorescence, nous avons n’observé aucun signe de dommages causés par les photos de nos échantillons à l’aide de LED photoblanchiment. Un autre avantage majeur de notre appareil est l’importante réduction de coût sur les autres techniques. Le montage de notre appareil coûte environ $10 USD, et l’Assemblée de l’appareil est souple, assez de telle sorte que n’importe quel laboratoire peut adopter sa propre version de la photobleacher. En comparaison, les autres méthodes à l’aide de mutispectral a conduit les tableaux avec les détenteurs de diapositive personnalisé et chambres de refroidissement nécessite jusqu'à $1000 USD pour construire8. En outre, extincteurs chimiques commerciaux sont des consommables qui coûtent $120 USD pour 100 diapositives et introduisent des composés potentiellement indésirables dans l’échantillon. L’extincteur chimique utilisé pour la comparaison dans la présente étude probablement contient le colorant noir Soudan lipide-liaison, qui peut-être interférer avec immunostaining des lipoprotéines.
Dans l’ensemble, les étapes plus critiques le photoblanchiment avant le traitement et l’immunomarquage du spécimen impliquent la manipulation de la section au cours de l’immunohistochimie. Il est important qu’une fois que la section est réhydratée pendant le photoblanchiment, il n’est pas autorisé à se dessécher dans l’une des étapes suivantes. Séchage de la diapositive, causera une répartition inégale des anticorps et créer des artefacts ininterprétables. Pour éviter toute perte de temps et potentiellement précieux échantillons, il faut à plusieurs étapes dans le protocole. Après recherche d’antigène, laisser le tissu se refroidir avant de les transférer à la solution de perméabilisation de SCT-Triton. L’exposition même momentanée dans l’air lorsque l’échantillon est chauffé à des températures élevées provoque un séchage instantané du tissu. Également de veiller à ce qu’anticorps, blocage ou contre-colorant solutions couvrent entièrement les tissus pendant l’application. Ceci peut être réalisé en faisant en sorte que le tissu est entièrement décrite par la plume hydrophobe pour éviter le ruissellement de la solution et que toutes les solutions sont appliquées dans une chambre humidifiée sur une surface plane. Ceci est particulièrement important au cours d’incubations durant la nuit (liaison de l’anticorps primaire).
L’application réussie de photoblanchiment de l’utilisation de phosphore blanc LED avant la coloration peut faciliter l’application des méthodes d’immunofluorescence à tissus archivés. C’est un traitement polyvalent et peu coûteux que nous attendons d’être favorable à une large gamme de spécimens à l’avenir. Même si nous avons seulement appliqué cette méthode au tissu cérébral humain, cette technique peut être facilement intégrée à n’importe quel protocole de coloration dans laquelle autofluorescence empêche les résultats souhaitables, en particulier dans le tissu postmitotiques comme cardiaque ou squelettique muscles, où lipofucin sont plus susceptibles de s’accumuler.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée en tout ou en partie par le Consortium canadien de neurodégénérescence et vieillissement (CCNA), l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC), la société de la SLA de SLA (Canada) et la société Alzheimer du Canada (sac). Les auteurs aimeraient remercier Sultan Darvesh et Andrew Reid de la Maritime cerveau Banque de tissus pour fournir les tissus cérébraux FTLD, Gauthier de Milan depuis le programme ciblant les spatio-temporelle et Amplification de rayonnement réponse (STTARR) et ses affiliés bailleurs de fonds pour le tissu l’incorporation et la section des services et le Advanced optique Microscopy Facility (AOMF) pour fournir des instruments de microscopie. Kevin Hadley est remerciée pour l’examen critique du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
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- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al.
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- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
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