Summary
Bakgrunden autofluorescens biologiska prover komplicerar ofta fluorescens-baserade avbildningstekniker, särskilt i åldern postmitotic vävnader. Det här protokollet beskriver hur autofluorescens från dessa prover kan avlägsnas effektivt med hjälp av en kommersiellt tillgänglig ljusavgivande diod ljus källa till photobleach provet före immunfärgning.
Abstract
Immunofluorescens är en vanlig metod som används för att visualisera subcellulär fack och att bestämma localizationen av specifika proteiner inom ett vävnadsprov. Ett stort hinder för förvärv av högkvalitativa immunofluorescens bilder är endogena autofluorescens den vävnad som orsakas av åldrande pigment såsom lipofuscin eller gemensamma prov förberedelse processer såsom aldehyd fixering. Det här protokollet beskriver hur bakgrunden fluorescens kan minskas kraftigt genom fotoblekning med vit fosfor ljusavgivande diod (LED) matriser före behandling med fluorescerande sonder. Solskyddskrämen utsläpp av vit fosfor lysdioder tillåter blekning av fluorophores inom en rad olika utsläpp toppar. Fotoblekning apparaten kan konstrueras från off-the-shelf komponenter till mycket låg kostnad och erbjuder ett tillgängligt alternativ till kommersiellt tillgängliga kemiska quenchers. En fotoblekning förbehandling av vävnaden följt av konventionella immunofluorescens färgning genererar bilder gratis bakgrund autofluorescens. Jämfört till etablerade kemiska quenchers vilket minskade sond samt bakgrund signaler, fotoblekning behandling hade ingen effekt på sonden fluorescensintensiteten medan det effektivt minska bakgrund och lipofuscin fluorescens. Fotoblekning kräver mer tid för förbehandling, kan högre intensitet LED matriser användas för att minska fotoblekning tid. Den här enkla metoden kan potentiellt användas till en mängd olika vävnader, särskilt postmitotic vävnader som ansamlas lipofuscin såsom hjärnan och hjärt- eller skelett muskler.
Introduction
Fluorescensmikroskopi använder antikroppar riktade specifika proteiner används rutinmässigt att visualisera proteiner av intresse i cellkultur och vävnader. En betydande komplikation till förvärvet av tydliga och slutgiltiga bilder i immunofluorescens är autofluorescens, vilket kan orsakas endogent i däggdjursvävnader genom den ålder pigment lipofuscin och proteiner såsom elastin och kollagen1, 2. Andra källor till autofluorescens kan införas genom provberedningssteg som aldehyd fixering3. Lipofuscin granulat, består främst av oxidativt modifierat protein och lipid nedbrytning rester, ackumuleras i lång-levande celler med ökad ålder2. Detta orsakar svårigheter i imaging postmitotic vävnader såsom hjärnan och hjärt- eller skelett muskler, som fluorescens emissionsspektrum av lipofuscin är breda och varierande, ofta sammanfaller med utsläpp våglängden av gemensamma fluorophores används för märkning4. Dessa faktorer gör avbildning av mänsklig hjärnvävnad från fall av sen debut neurodegenerativa sjukdomar som frontotemporal lobar degeneration (FTLD) särskilt utmanande.
För att minska autofluorescens, har vi utarbetat en teknik där vi bestråla avsnitten bild monterade vävnad med en vit ljusavgivande diod (LED)-matris med en hushållens skrivbord lampa5. Denna enkla teknik ger ett alternativ till tekniker som använder kemiska quenchers såsom CuSO4 i ammoniumacetat, eller kommersiellt tillgängliga snabbkylning färgämnen som Sudan svart B och eriokromsvart T6. Det har också betydande kostnadsbesparingar över Multispektrala LED lampa fotoblekning tekniker och undviker komplikationer och artefakter som genereras från digital autofluorescens borttagning metoder såsom spektrala un-blandning7,8. Vit fosfor lysdioder har en bred emissionsspektrum, hög ljusstyrka och låga tillverkningskostnaden, vilket gör dem idealiska som en off-the-shelf komponent för fotoblekning en mängd chromophores5,9.
I detta protokoll, vi visar byggandet av en fotoblekning apparatur med hjälpmedelskomponenter och gälla ett fall av FTLD vävnad innehållande tau-positiv inneslutningar (FTLD-T) med hjälp av en antikropp specifik för fosforyleras tau fotoblekning. Vi visar effekten av fotoblekning på imaging fluorescently-märkt antikroppar sysselsätter två vanliga chromophores: Alexa 488 och Texas Red. Effekten av fotoblekning jämfört med obehandlade sektioner eller dem som behandlades med en kommersiella kemiska törstsläckare är kvantifierade och jämfört. Detta fotoblekning förbehandling kan införlivas i alla standard immunofluorescens färgning protokoll bort autofluorescens i ett biologiskt prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: arbetet presenteras utförs i enlighet med erkända internationella normer, inklusive den internationella konferensen om harmonisering (ICH), rådet för internationella organisationer av Medical Sciences (CIOMS) , och principerna i Helsingforsdeklarationen. Användning av mänsklig vävnad var med godkännande av universitetsstyrelsen hälsa nätverk forskning etik. De mänskliga hjärnan proverna samlades in som en del av maritima Brain vävnad Bank. Vid tidpunkten för insamling, informerat samtycke erhållits från alla patienter.
1. byggandet av fotoblekning apparater och lösningar
- Förbered stamlösningar.
- Förbereda 1 L av 1 x lager Tris-buffrad koksaltlösning (1 x TBS) lösning (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) genom upplösning 8,77 g NaCl och 6.06 g av Tris i 800 mL ddH 2 O och justera pH till 7,4 använder HCl. Bring upp volymen till 1 L och autoklavera. < / Li >
- förbereda 10% (200 x lager) natriumazid genom upplösning 1 g natriumazid i 10 mL ddH 2 O (10%, 200 x lager).
- För 1-3 standard storlek bilder, använda en enda 100 x 100 mm transparent, fyrkantiga petriskål som en bild-kammare. För en enstaka bild kammare, lägga till 0,25 mL 200 x natrium natriumazid lager till 50 mL 1 x TBS att göra en 0,05% natriumazid-TBS lösning. Stapla 2-3 bild chambers vertikalt för att bearbeta ytterligare bilder. Förbereda en ytterligare 50 mL natriumazid-TBS lösning för varje kammare.
- Skapa en byggnadsställning för att höja den bild chamber(s) sådan att en lamphuvud ryms under.
- För en 100 mm x 100 mm slide kammare, skär öppningar i botten och sidor av en 100 mm x 100 mm x 30 mm plast matbehållare och Invertera behållaren. Säkerställa sidoöppningarna är tillräckligt stora för att passa en LED-ljuskälla och säkerställa nedre öppningen är tillräckligt stor så att ljuset från ljuskällan når provkammaren utan hinder.
- Gälla ställningen att öka greppet mellan ställningen och den prov kammare/bänkmonterade eltejp. Använda alternativa material för att bygga ställningen så länge det höjer säkert Skjut kammaren utan hindrar ljuset från att nå provet.
- Bort diffusorer eller ogenomskinlig plast från den skrivbordslampa som kan hindra LED-lampan från att direkt nå provet (om möjligt) och orientera arrayen LED uppåt. Placera den byggnadsställning och skjut chamber(s) över matrisen LED. Använda en lampa med en flexibel hals för lätt manipulation.
- Konstruera en reflekterande kupol täcka för apparatur av kantar insidan av en låda som är tillräckligt stor för att täcka bild kammare och Rullställning med aluminiumfolie. Använd en 1 mL pipett tip låda för en enda kammare eller en 150 x 150 mm 150 mm kartong för flera, vertikalt staplade chambers.
2. Fotoblekning förbehandling av vävnadssnitt
Obs: vävnaden avsnittet förberedelse kan variera beroende på källan till vävnader och fixering och inbäddning metoder används. Här, hjärnvävnad (orbitofrontal gyri) från ett fall av FTLD-T fastställdes för ~ 2 dagar i formalin, kör genom en sackaros övertoning, inbäddade i okt och klippa till 10 µm tjocka sektioner med en kryostaten.
- i ett 4 ºC kalla rum, kallt skåp eller kylskåp, orient lampan under galgen och placera provkammaren på schavotten. Häll 50 mL natriumazid-TBS lösning i en provkammare.
- Sänk vävnadssnitt monterad på standard glas objektglas in i bilden kammaren som innehåller natriumazid-TBS använder ren pincett. För flera bilder, se till att bilderna är placerade i kammaren på ett enda lager.
- Täcka apparaten med reflekterande kupolen, slå på LED-lampa och inkubera 48 h vid 4 °.
3. Immunofluorescens
- att fläcken vävnaden för fosforyleras tau använder DAPI motfärg och Alexa 488- och Texas röd-konjugerad sekundära antikroppar, först förbereda lösningar för antigen retrieval, permeabilisering, blockering och primär antikropp bindande.
- Förbereda 500 mL antigen retrieval buffert (10 mM citronsyra, 2 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt, 0,05% Tween 20; pH 6,2) genom upplösning 0.92 g citronsyra och 0,37 g av etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) i 500 mL ddH 2 O. Justera pH 6.2 med NaOH och tillsätt 0,25 mL Tween 20.
- Bereda 500 mL 0,025% Triton x-100 i TBS lösning (TBS-Triton) genom att lägga till 0,125 mL Triton x-100 till 500 mL 1 x TBS.
- Förbered en 1% bovint serumalbumin (BSA) lösning i TBS (BSA-TBS buffert) genom upplösning 0,1 g BSA i 10 mL TBS.
- Förbereda en blockerande lösning genom att tillföra 0,2 mL normal get serum till 1,8 mL 1% BSA/TBS.
- För varje bild, förbereda 150 µL primär antikropp lösning (1: 100 utspädning) genom pipettering 1,5 µL anti-phospho-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) antikropp till 148,5 µL av 1% BSA-TBS buffert och lämna på ice.
- För att utföra antigen retrieval, dränka photobleached glasen vertikalt i en bild samlare som innehåller 25 mL antigen retrieval buffert. Säkra kollektorn med tejp och/eller strängar så att solfångaren inte faller i vattenbad. Värma samlaren i vattenbad vid 90 ° c i 30 min och Låt insamlaren svalna till rumstemperatur i 30 min innan du tar bort bilder. Avlägsna inte bilderna omedelbart eftersom det kommer att orsaka avsnitten att torka ut.
- Överföra bilderna från antigen retrieval samlaren i en färgning burk fylld med 30 mL av TBS-Triton och tvätta avsnitten under 5 minuter i orbitalskak med milda skakningar. Upprepa tvätten en gång med färska TBS-Triton. Wick bort överflödigt buffert med en luddfri vävnad och disposition vävnaden med en hydrofob penna. Se till att inte låta bilderna torka ut.
- För varje bild, blockera vävnaden genom pipettering 200 µL blockerande lösning på vävnaden och placera bilden i en fuktig kammare. Konstruera kammaren genom att placera en objektglashållaren i en pipett tip-ruta som innehåller en våt pappershandduk. Odla i rumstemperatur för 2 h på en plan yta. Se till att den blockerande lösningen helt täcker vävnaden.
- Ta bort blockering lösningen genom aspiration och Pipettera 100-150 µL av primär antikropp lösning på vävnaden. Säkerställa tillräcklig volym av antikropp är närvarande och att avsnittet är på en plan yta att undvika poolning av antikropp lösning på ena sidan. Inkubera vid 4 ° c över natten i en fuktig kammare.
- Förbereda sekundär antikropp blandningen och den nukleära motfärg DAPI.
- För varje bild, förbereda 150 µL av sekundär antikropp blandning (1: 100 utspädningar) genom att lägga till 1,5 µL get antimus Alexa 488 och 1,5 µL av geten antimus Texas röd till 147 µL av BSA-TBS och lämna på ice.
- Förbered 0,1 µg/mL DAPI motfärg genom seriell utspädning. Blanda stamlösning och späd 1 µL lager 5 mg/mL DAPI i 999 av TBS göra 1 mL 5 µg/mL lösning. För varje bild, späd 3 µL 5 µg/mL lösning med 147 µL av TBS till en slutlig koncentration på 0,1 µg/mL.
FÖRSIKTIGHET: DAPI är en känd mutagen och bör hanteras med försiktighet.
- Ta bort den primära antikroppen genom aspiration. Dränka bilder i ett glas färgning burk innehållande 30 mL TBS-Triton och tvätt för 5 min med mild blandning i orbitalskak. Upprepa tvättningen med färska TBS-Triton. Transportera bort överflödig TBS-Triton och Pipettera 100 till 150 µL av sekundär antikropp blandning till varje bild.
- Kontrollera att vävnaden är helt täckt av antikropp blandningen. Inkubera i 2 h i rumstemperatur i befuktade kammaren i mörkret.
- Ta bort sekundär antikropp blandningen genom aspiration och överföra bilden till ett glas färgning burk innehållande 30 mL TBS (ingen Triton). Tvätta för 5 min med mild blandning i orbitalskak. Upprepa tvättningen med färska TBS. gälla varje bild 100 till 150 µL 0,1 µg/mL DAPI motfärg och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörkret.
- Överföra bilderna till ett glas färgning burk innehållande TBS och tvätta 3 gånger med mild blandning för 5 min varje, med färska TBS för varje tvätt. Wick bort överflödigt buffert.
- Applicera 3 droppar aqueous monteringsmedium till vävnaden. Med pincett, försiktigt sänka en ren täckglas på vävnaden, börja med ena kanten och långsamt sänka andra kanten att undvika fångst av luftbubblor. Se till att inte rubba täckglaset om imaging omedelbart. Annars, tillåter montering medlet torka innan de lagras vid 4 ° c i mörker.
4. Fluorescensmikroskopi
- slå på lampan fluorescens, mikroskopet och datorn och tillåter lampan att värma upp i 15 min. plats färgade vävnaden glider i fluorescens Mikroskop scenen. Använd ljusa fält bilden för att hitta vävnaden vid 10 x förstoring.
- Applicera en droppe ddH 2 O på täckglas ytan och Använd en 20 x vatten nedsänkning objektiv (NA = 1,0). Välj 4-line genomsnittliga planet scan inställning. Ange pinhole storlek till 1 luftiga enhet som ger en optisk skiva av ~ 3 µm. Välj de laser excitation och utsläpp våglängderna för varje fluorophore i separata spår för bästa signal.
Obs: Alexa 488: λ ex = 488 nm (argon laser) λ em = 493-570 nm. Texas röd: λ ex = 561 nm (DPSS 561 nm laser), λ em = 601-635 nm. DAPI: λ ex = 405 nm (diod 405 laser), λ em = 410-507 nm.- Justera laser makten och få inställningar för att optimera signal intensiteten för varje spår. Samla den sammansatta bilden och spara. Använd samma laser inställningar för att jämföra fluorescens stödnivåer i en annan bild.
- För visualisering av fluorescensintensiteten i varje kanal, installera makrot RGB-profil verktyg för ImageJ 10. Spara makrot från webbsidan som en textfil (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). På menyn ImageJ Välj Plugins - > makron - > installera; Välj textfilen installera verktyget RGB-profiler.
- Öppna confocal bildfilen i ImageJ och konvertera de sammansatta bilderna från de 3 staplarna till RGB genom att utföra följande: bild - > färg - > kanal verktyg. Välj " sammansatta " från den nedrullningsbara menyn och kontrollera alla tre kanaler. Välj bild - > typ - > RGB färg.
- Välj ikonen RGB-profil verktyg och dra en linje över avsnittet i bilden för att profileras. Spara intensitet som ett kalkylblad för plottning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Steget fotoblekning förbehandling kan läggas till ett standard immunofluorescens protokoll omedelbart före antigen retrieval och immunfärgning (figur 1A). Montering av fotoblekning apparaten kan också utföras med olika, billig, off-the-shelf komponenter (figur 1B). Emissionsspektrum av vit fosfor lysdioder omfattar ett brett spektrum av våglängder vilket gör dem lämpliga för bred-range fotoblekning, instämmer med föregående rapporter (figur 1 c)5,11. Efter 48 h fotoblekning reducerades intensiteten i autofluorescent prickar som liknar lipofuscin samt allmän bakgrund fluorescens avsevärt i både utsläpp våglängder i en ofärgade avsnitt FTLD-t (figur 1 d). Påvisas effekten av fotoblekning, färgas vi för hyperphosphorylated tau att visualisera patologiskt tau införanden i ett fall av FTLD-T använder två olika sekundära antikroppar. Distinkta formen på tau inneslutningar och användning av två chromophores för märkning också tillåter oss att tryggt skilja autofluorescent funktioner från de avsedda mål att validera tekniken.
I de sammansatta bilderna vid lägre förstoring, morfologi av de tau-positiv inneslutningar, färgas gul av kombinationen av Alexa 488 och Texas röd kanaler, består av ringformade samlingar av kort cellprocesser som kallas ' astrocytic plack (figur 2a-c). Denna morfologi är kännetecknande för corticobasal degeneration (CBD)12,13, som instämmer i rapporten patologi i detta fall. I obehandlade provet, många strukturer är närvarande i den sammansatta bilden som inte likna tau inneslutningar och visade fluorescens primärt i den röda kanalen, vilket tyder på att det är autofluorescens snarare än avsedda antikropp färgning. En märkbar nivå av bakgrunden fluorescens är också synlig i denna kanal i hela synfältet (figur 2a). Dessa autofluorescent är borttagna och övergripande bilden visas mycket renare när prover behandlades med fotoblekning (PB) och den kemiska törstsläckare (figur 2b-c).
Vi kvantifieras sedan fluorescens skillnaderna i dessa prover genom att profilera en mindre region i varje prov. En enda astrocytic plack presenteras i varje behandling villkor för jämförelse (figur 2d-r). Obehandlade provet, bakgrunden fluorescens förekommer i alla tre kanaler, men sekundär antikropp fluorescens för både Alexa 488 och Texas Red antikroppar var relativt hög (Fig 2h). Dock hade de autofluorescent strukturerna i obehandlade provet fluorescens stödnivåer i Texas röd kanal jämförbar med den Texas Red sekundär antikropp som färgas för tau (figur 2 h). Om målproteinet inte har en tydlig, förutsägbar morfologi såsom tau i vårt fall, skulle autofluorescens i vävnaden ha återges bilden det.
Däremot jämfört när fotoblekning förbehandling tillämpades före immunfärgning, bakgrunden fluorescens i den Alexa 488 och Texas Red channels reducerades signifikant med obehandlade provet, och fluorescensen immunostained Tau förblev opåverkad (figur 2i-m). Den kommersiella kemiska törstsläckare släckte autofluorescens i Alexa 488 kanalen lika effektivt som fotoblekning. Det undertryckta också DAPI bakgrund fluorescens, som inte påverkades av 48 h fotoblekning behandling (figur 2 m). Dock reduceras den kemiska törstsläckare också intensiteten av Texas Red sekundär och DAPI signaler, vilket tyder på en viss grad av kontraproduktivt släcka (figur 2n-r).
Figur 1 : Tillämpning av fotoblekning förbehandling i ett arbetsflöde för standard immunofluorescens. (A) förenklad Schematisk av standard immunofluorescens protokollet från vävnad förvärv till imaging. Tillämpningen av primära och sekundära fluorescerande antikroppar representeras av karikatyrerna. En representativ Mikroskopbilden produceras. Skalstapeln = 100 µm. B) en representativ fotoblekning apparater konstruerade med off-the-shelf komponenter (reflekterande lock inte visas). (C) emissionsspektrum av vita LED array. En smal utsläpp topp vid 450 nm och en bred topp vid 550 nm observeras. (D) effekt av fotoblekning på endogena bakgrund fluorescens FTLD-T vävnad på Alexa 488 (493-570 nm) och Texas Red (601-635 nm) utsläpp våglängder. Autofluorescent prickar som liknar lipofuscin reduceras synbart efter 48 h fotoblekning. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2:effekt av autofluorescens borttagning på bildkvalitet ett fall av FTLD-T vävnad med anti-fosforyleras tau immunfärgning. a-c) låg förstoring, sammansatta immunofluorescens bilder av representativa synfält i obehandlad (en), photobleached för 48 h (b) och kemiska törstsläckare behandlas (c) prover. Färgerna representerar fluorescens i följande kanaler via excitation av deras respektive ljuskällor: Alexa 488 (grön): λex = 488 nm (argon laser) λem = 493-570 nm. Texas röd (red): λex = 561 nm (DPSS 561 nm laser), λem = 601-635 nm. DAPI (blå): λex = 405 nm (diod 405 laser), λem = 410-507 nm. Skalstapeln = 100 µm. d-r) högre förstoring bilder av Regionkommittén prickade i obehandlad (d-g), photobleached (i-l) och kemiska törstsläckare behandlas (n-q) prover, med separat fluorescens kanaler, samman bild och kvantifieras fluorescens signal profiler. Streckade linjerna i de sammanslagna kanalerna (g, l, q) representerar den linje på vilken signal profiler (h, m, r) genererades. Skalstapeln = 50 µm. Autofluorescent partiklar (af),immunolabeled tau fluorescens (tau) och nucleus signal (nuc) indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fotoblekning förbehandling av vävnader som beskrivs i detta manuskript möjliggör effektiv eliminering av autofluorescens med off-the-shelf komponenter. Protokollet beskrivs immunofluorescens avbildning av fosforylerade tau aggregat i formalin-fast mänsklig hjärnvävnad som använder sekundära antikroppar konjugerat till Alexa 488 och Texas röd, med DAPI som en nukleär motfärg. För att tillämpa metoden på andra vävnader, rekommenderar vi att utföra en 48 h fotoblekning förbehandling i urvalet som utgångspunkt. Efter fotoblekning, utföra de vanliga immunofluorescens färgning protokoll för funktionerna i intresse med hjälp av antikropp utspädningar efter tillverkarens rekommendationer. Om bakgrunden fluorescens är fortfarande närvarande, behöver fotoblekning varaktighet eller antikroppen färgning steg ändras. Varaktigheten av fotoblekning varierar beroende på lampan valt att konstruera apparaten och nivån på autofluorescens i provet. Den optimala blekning tiden för varje unik lampa apparat måste bestämmas. Detta kan göras genom fotoblekning en ofärgade, ordning vävnad avsnitt monterad i TBS-natriumazid och mäta den endogena fluorescensen av bilden med 12 timmars intervall med fluorescens Mikroskop. I tidigare rapporter har vi övervakas lipofuscin fotoblekning av Partikelanalys och kurva montering till exponentiell förruttnelse funktioner5, men för enkelhet, visuell observation av avsnitten med jämna mellanrum kan vara lika effektiv för att bedöma den varaktighet på som de flesta av fluorescensen blir släckas. I vårt fall av åldern hjärnvävnad som innehåller höga halter av lipofuscin pigment, var 48 h inkubation med 800 lux lampa tillräcklig. Om specifika signalen förblir svag jämfört med bakgrunden efter fotoblekning, överväga att öka koncentrationen av primära och sekundära antikroppar under färgningen. Det är också viktigt att utföra en sekundär antikropp-bara kontroll för att säkerställa den bakgrund signalen inte orsakas av icke-specifik sekundär antikropp bindande. Var noga med för att Välj antikroppar som inte korsreagerar, särskilt när färgning för flera mål. Se dessutom till att de speciella signalerna inte är oavsiktligt släcks under processen färgning. Exempelvis är Nissl fläcken (för färgning nervceller) härdas av BSA. I detta fall bör BSA komponenten av blockerande lösningen ersättas med alternativ såsom fisk hud gelatin5.
Användningen av vit fosfor lysdioder för fotoblekning har vissa begränsningar på grund av dess emissionsspektrum från 420 nm till 650 nm. Således är inga betydande fotoblekning i de UV-våglängderna möjligt. Också, på grund av den breda emissionsspektrum, fotoblekning chromophores av specifika våglängder kräver ändringar, till exempel överliggande färgfilter lakan över de LED-matriserna för att filtrera ut oönskade utsläpp våglängder. Fotoblekning vävnad kan dessutom kräva längre handläggningstider än andra metoder. I det här fallet på grund av åldern av hjärnvävnad (från en 89-årig individ) och den långa aldehyd räntebindningstid på under mer än två dagar var 48 h fotoblekning varaktighet skyldig. Även om ingen aktiv behandling tid krävs, måste man beakta fotoblekning tiden och planera färgning sessionen. LED-lampor av högre ljusstyrka eller användning av flera lampor kan avsevärt minska fotoblekning tiden genom att enkelt ökar photon flux.
Vår teknik jämfört med befintliga metoder, och erbjuder flera betydande fördelar. Till skillnad från fotoblekning använder scanning laser i fluorescensmikroskopi, observerade vi inga tecken på foto-inducerad skada av våra prover med LED fotoblekning. En annan stor fördel med våra apparater är den betydande minskningen av kostnad över andra tekniker. Kostnaden för montering av våra apparater är ungefär $10 USD och montering av apparaten är flexibel nog att alla laboratorier kan anta sin egen version av photobleacher. I jämförelse, andra metoder som använder mutispectral ledde matriser med anpassade bildspel innehavare och kyla kammare kräver upp till $1000 USD att konstruera8. Dessutom är kommersiella kemiska quenchers förbrukningsvaror som kostar $120 för 100 diabilder och införa potentiellt oönskade föreningar i provet. Den kemiska törstsläckare som används för jämförelse i den aktuella studien sannolikt innehåller de lipid-bindande Sudan svart färgämne, som kan störa immunfärgning av lipoproteiner.
Sammantaget innefattar de viktigaste stegen i fotoblekning förbehandling och immunfärgning av preparatet hantering av avsnittet under immunfärgning. Det är viktigt att när avsnittet är rehydrerad under fotoblekning, det inte är tillåtet att torka ut i någon av de efterföljande stegen. Torkning av bilden kommer att orsaka ojämn fördelning av antikroppar och skapa artefakterna. För att undvika förlust av tid och potentiellt värdefulla prover, måste man vara försiktig vid flera steg i protokollet. Efter antigen retrieval, tillåta vävnaden svalna innan du överför till TBS-Triton permeabilisering lösningen. Även tillfälliga exponering till luft när provet är uppvärmd till höga temperaturer orsakar ögonblicklig torkning av vävnad. Också se till att antikroppar, blockering eller motfärg lösningar helt täcka vävnader under applicering. Detta kan uppnås genom att se till att vävnaden är fullt beskrivs av hydrofoba pennan för att undvika lösning avrinning och att alla lösningar tillämpas i en fuktig kammare på en plan yta. Detta är särskilt viktigt under natten inkubationer (primär antikropp bindande).
En framgångsrik tillämpning av fotoblekning med vit fosfor lysdioder innan färgning kan underlätta tillämpningen av immunofluorescens metoder till arkiverade vävnader. Det är en mångsidig och billig behandling som vi räknar med att vara mottagliga för ett brett utbud av exemplar i framtiden. Även om vi har endast tillämpat denna metod till mänsklig hjärnvävnad, denna teknik kan enkelt införlivas färgning protokoll i vilken autofluorescens hindrar önskvärda resultat, särskilt i postmitotic vävnad såsom hjärt eller skelett musklerna där lipofucin är mer sannolikt att ackumuleras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöds helt eller delvis av den kanadensiska konsortium för Neurodegeneration och åldrande (CCNA), det kanadensiska Institutet för hälsa forskning (CIHR), ALS samhället av Kanada (ALS Kanada) och Alzheimers samhället av Kanada (ASC). Författarna vill tacka Sultan Darvesh och Andrew Reid från Maritime Brain vävnad Bank för att ge FTLD hjärnan vävnaderna, Milano Ganguly från plats och tid inriktning och förstärkning av strålning svar (STTARR) program och dess anslutna finansiärer för vävnad inbäddning och snittning tjänster och den avancerad optisk mikroskopi Facility (AOMF) för att tillhandahålla mikroskopi instrument. Kevin Hadley är tackade för kritisk granskning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T.
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al.
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
