Summary
Arka plan autofluorescence biyolojik örneklerin kez Floresans tabanlı görüntüleme teknikleri, özellikle yaşlı insan postmitotic doku zorlaştırmaktadır. Bu protokolü nasıl autofluorescence bu örnekler üzerinden etkin bir şekilde kaldırılabilir açıklar bir ticari olarak mevcut ışık yayan diyot ışık kullanarak örnek immunostaining önce photobleach için kaynak.
Abstract
Ayirt hücre altı bölmeleri görselleştirmek ve doku örneği içinde belirli proteinlerin yerelleştirme belirlemek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Yüksek kaliteli ayirt görüntüler edinimi için büyük bir engel lipofuscin gibi yaşlanma pigmentler veya aldehit fiksasyonu gibi genel örnek hazırlık süreçlerini neden doku endojen autofluorescence var. Bu protokolü nasıl arka plan Floresans büyük ölçüde beyaz fosfor ışık yayan diyot (LED) diziler önce tedavi ile floresan problar kullanarak photobleaching ile giderilebilir açıklar. Beyaz fosfor geniş spektrumlu emisyon LED fluorophores emisyon doruklarına aralığında beyazlatma için izin verir. Photobleaching aparatı çok düşük maliyetle kapalı bileşenlerden oluşturulması ve piyasada bulunan kimyasal quenchers için erişilebilir bir seçenek sunar. Photobleaching ön arıtma geleneksel ayirt boyama tarafından takip doku görüntü arka plan autofluorescence ücretsiz oluşturur. Göre kurulan soruşturma yanı sıra arka plan azaltılmış kimyasal quenchers sinyalleri, photobleaching tedavi etkili arka plan ve lipofuscin floresan azaltılmış sonda floresan yoğunluğu üzerinde bir etkisi vardı. Photobleaching ön arıtma için daha fazla zaman gerektirir, ancak daha yüksek yoğunluklu LED diziler photobleaching süresini azaltmak için kullanılır. Bu basit yöntem doku, beyin gibi lipofuscin birikir özellikle postmitotic doku ve kardiyak veya iskelet kasları çeşitli için potansiyel olarak uygulanır.
Introduction
Floresans mikroskobu antikorlar spesifik proteinlerin hedefleme kullanarak düzenli olarak proteinler hücre kültürü ve dokuların ilgi görselleştirmek için kullanılır. Ayirt açık ve kesin Albümdeki edinimi için büyük bir komplikasyon endogenously memeli dokusunda yaş pigment lipofuscin ve elastin ve kolajen1gibi proteinler tarafından neden olabilir autofluorescence olduğunu, 2. Autofluorescence ile ilgili diğer kaynakları aldehid fiksasyon3gibi örnek hazırlama adımlarda tanıttı olabilir. Lipofuscin granül, öncelikle oxidatively değiştirilmiş protein ve lipit bozulması artıkları, oluşan uzun-canlı hücreler artan yaş2birikir. Olarak lipofuscin floresan emisyon yelpazesi geniş ve değişken, genellikle ortak fluorophores için kullanılan emisyon dalgaboyu ile rastlayan bu beyin ve kalp veya iskelet kasları gibi postmitotic doku Imaging'de zorluğa neden oluyor 4etiketleme. Bu faktörler insan beyin dokusundan özellikle zor durumlarda da lobar dejenerasyonu (FTLD) gibi geç başlangıçlı nörodejeneratif hastalıkların görüntüleme olun.
Autofluorescence azaltmak için içinde biz beyaz bir ışık yayan diyot (LED) dizi bir ev Resepsiyon lamba5kullanarak slayt monte doku bölümleri ışınlatayım bir teknik geliştirmiştir. Bu basit tekniği kullanmak CuSO4 gibi kimyasal quenchers amonyum asetat, veya piyasada bulunan boyalar Sudan Siyah B ve Eriochrome siyah T6gibi Şoklama teknikleri bir alternatif sağlar. Önemli maliyet tasarrufu bitti spektral have LED Lamba photobleaching teknikleri ve komplikasyonlar ve spektral un karıştırma7,8gibi dijital autofluorescence kaldırma yöntemleri üretilen eserlerin önler. Beyaz fosfor photobleaching kromofor5,9çeşitli için kapalı bir bileşeni olarak idealdir geniş emisyon spektrumlu, yüksek parlaklık ve düşük üretim maliyeti, LED var.
Bu iletişim kuralı, biz erişilebilir bileşenler kullanarak bir photobleaching aparatı inşaatı göstermek ve photobleaching FTLD dokusu fosforile tau ilişkin bir antikor özel kullanarak tau-pozitif kapanımlar (FTLD-T) içeren olgusu uygulanır. Biz iki yaygın olarak kullanılan kromofor istihdam fluorescently etiketli antikorlar Imaging üzerindeki etkisi photobleaching göstermek: Alexa 488 ve Texas kırmızı. Photobleaching tedavi edilmeyen bölümleri karşı etkisini veya ticari bir kimyasal içki ile tedavi sayılabilir ve karşılaştırıldığında. Bu photobleaching ön arıtma autofluorescence bir biyolojik örnek kaldırmak için herhangi bir standart ayirt boyama Protokolü içine dahil edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Uluslararası Konferansı üzerinde uyumlaştırılması (Ich), Konsey için uluslararası kuruluşlar, tıbbi Bilimler (CIOMS) de dahil olmak üzere tanınan uluslararası standartlara uygun olarak sunulan çalışma gerçekleştirildi ve Helsinki Bildirgesi ilkeleri. İnsan dokusu kullanımı üniversite sağlık ağ araştırma Etik Kurulu onayı ile oldu. İnsan beyni örnekleri deniz beyin doku Bankası bir parçası olarak toplanmıştır. Toplanması sırasında tüm hasta Onam alındı.
1. photobleaching cihazları ve çözümleri inşaat
- hazırla hisse senedi çözümleri.
- Hazırlamak 1 L / 1 x 8,77 g NaCl ve 6,06 g Tris eriterek tarafından hisse senedi Tris tamponlu tuz (1 x TBS) çözüm (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) temel GKD 2 O 800 mL ve pH HCl. Bring sesi 1 L ve basınçlı kap kullanarak 7.4 için ayarlamak. < / li >
- % 10 (200 x hisse senedi) sodyum azid sodyum azid 10 ml GKD 2 O (%10, 200 x hisse senedi) 1 g çözülerek hazırlayın.
- 1-3 standart ölçü slaytlarını tek 100 mm x 100 mm şeffaf, kare petri kabına bir slayt odası kullanın. Bir tek slayt odası için 200 x sodyum azid stokunun 0.25 mL % 0.05 azid TBS çözüm yapmak için 1 x TBS için 50 mL ekleyin. Dikey olarak ek slaytları işlemek için 2-3 slayt chambers yığını. Her oda için bir ek 50 mL azid TBS çözeltisi hazırlamak.
- Böyle bir lamba başlığında altında sığabilecek slayt chamber(s) yükseltmek için bir iskele oluşturmak.
- İçin bir 100 mm x 100 mm slayt odası, alt ve bir 100 x 100 mm x 30 mm plastik gıda konteyner kenarlarında açıklıklar kesmek ve konteyner tersine çevirin. Yan açıklıklar ve alt açıklıklı öyle ki ışık ışık kaynağından örnek odası engel olmadan ulaşır kadar büyük olduğundan emin olun bir LED ışık kaynağı uygun büyüklükte olduğundan emin olun.
- İskele artış kavrama iskele ve örnek odası/benchtop arasında Elektrik bandı uygulamak. Güvenli bir şekilde slayt odası ışık örnek ulaşmasını engelleyen olmadan yükseltir sürece iskele oluşturmak için alternatif herhangi bir malzeme kullanın.
- Tüm Difüzörler ve opak plastik doğrudan örnek (mümkünse) ulaşmasını LED ışık engel ve LED dizi yukarı doğru yönlendirmek masa lambası kaldırın. LED dizi yukarıda iskele ve slayt chamber(s) yerleştirin. Bir lamba ile esnek bir boyun için kolayca idare kullanın.
- Yapı yansıtıcı bir kubbe cihazları için slayt odası ve İskele alüminyum folyo ile karşılamak için büyük bir kutu içine astar tarafından kapsar. Kullanma a 1 mL pipet ucu kutu için tek bir oda ya da bir 150 x 150 mm x 150 mm karton kutu birden çok, dikey olarak üst üste Chambers'ı.
2. Photobleaching ön arıtma doku bölümlerinin
Not: doku bölümü hazırlık doku ve fiksasyon ve kullanılan yöntemler katıştırma kaynağına bağlı olarak farklı olabilir. Burada, beyin dokusundan FTLD-T Olgusu (orbitofrontal gyri) ~ 2 gün içinde formalin, sukroz degrade çalıştırmak, Ekim gömülü ve bir cryostat kullanarak 10 µm kalınlığında bölümlerine kesmek için tespit edildi.
- Bir 4 ºC soğuk oda, soğuk dolap veya buzdolabı, iskele altında lamba yönlendirmek ve örnek odası iskele üzerinde yerleştirin. 50 mL azid TBS çözeltisi örnek odanın içine dökün.
- Submerge doku bölümler standart cam mikroskop slaytlar azid TBS temiz forseps kullanarak içeren slayt odasına monte. Birden çok slayt için slaytları tek bir katmanda odasında yerleştirilir emin olmak.
- Aparatı ile yansıtıcı kubbe kapak, LED Lamba açmak ve 4 ºC, 48 h için kuluçkaya.
3. Ayirt
fosforile tau DAPI counterstain ve Alexa 488 - ve ikincil antikorlar Texas kırmızı Birleşik kullanarak doku leke, ilk çözümleri antijen alma, permeabilization, engelleme ve ilköğretim için hazırlamak için- antikor bağlama.
- Hazırlamak 500 mL antijen alma arabellek (10 mM sitrik asit, 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit, % 0.05 arası 20; pH 6.2) 0,92 g sitrik asit ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 500 mL GKD 2 O. ayarlama pH 0.37 g eriterek tarafından 6.2 NaOH ile için ve ara 20 0.25 mL ekleyin.
- 500 mL % 0,025 hazırlamak Triton X-100 Triton X-100 0,125 mL 500 mL 1 ekleyerek TBS çözüm (TBS-Triton) TBS. x
- Hazırlık %1 sığır serum albumin (BSA) çözeltilerine 0.1 g 10 ml TBS. BSA eriterek tarafından TBS (BSA-TBS arabellek)
- Engelleyen bir çözüm için 1,8 mL %1 0.2 mL normal keçi serum ekleyerek hazırlamak BSA/TBS.
- Her slayt için birincil antikor çözümü (1: 100 seyreltme) 150 µL tarafından anti-fosfo-PHF-tau pSer202 + Thr205 pipetting 1,5 µL hazırlamak (AT8) antikor 148,5 µL BSA-TBS tampon ve buz üzerinde bırakın % 1 içine
- Antijen alma gerçekleştirmek için dikey olarak antijen alma arabelleği 25 mL içeren bir slayt toplayıcı photobleached slaytları daldırın. Öyle ki toplayıcı su banyosu düşmek değil toplayıcısı teyp ve/veya dizeleri ile güvenli. Toplayıcı için 30 dk 90 ºC, bir su banyosu içinde ısı ve toplayıcı slaytları kaldırmadan önce oda sıcaklığında 30 dakika soğuması izin. Yapmak değil Kaldır slaytlar hemen olarak bölümler kurumasına neden olur.
- Slaytları TBS-Triton 30 mL ile dolu bir boyama kavanoza antijen alma toplayıcı aktarım ve nazik sallayarak ile bir orbital Çalkalayıcı üzerinde 5 min için bölümler yıkayın. Yıkama taze TBS-Triton ile bir kez yineleyin. Wick bir hav bırakmayan dokusu ve anahat hidrofobik kalem ile doku ile dış görev aşırı arabellek. Slaytlar kurumasına izin vermemeye özen.
- Her slayt için doku doku üzerine çözüm engelleme pipetting 200 µL tarafından blok ve slayt oksijen bir odaya koyun. Odası ıslak kağıt havlu içeren bir pipet ucu kutusunun içinde bir slayt raf yerleştirerek oluşturmak. Bir yüzeyin 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya. Engelleme çözüm tam olarak doku kapsar olun.
- Aspirasyon tarafından engelleme çözümü kaldırmak ve 100-150 µL birincil antikor çözüm doku üzerine pipette. Yeterli miktarda antikor mevcuttur ve bölüm antikor çözüm bir yana havuzu oluşturma önlemek için bir yüzeyin üzerinde olduğundan emin olun. Oksijen odasında gecede 4 ºC, kuluçkaya.
- İkincil antikor karışımı ve DAPI nükleer counterstain hazırlayın.
- Her slayt için karışımı keçi Anti-fare Alexa 488 1,5 µL ve keçi Anti-fare BSA-TBS 147 µL Texas kırmızı 1,5 µL ekleyerek ikincil antikor (1: 100 dilutions) 150 µL hazırlamak ve buz üzerinde bırakın
- Hazırlama 0,1 µg/mL DAPI seri seyreltme tarafından counterstain. Hisse senedi çözüm iyice karıştırın ve 1 µL olarak hisse senedi 5 mg/mL 5 µg/mL solüsyon 1 mL yapmak TBS 999 DAPI oranında seyreltin. Her slayt için seyreltik 3 µ5 µg/mL solüsyon L ile TBS 147 µL son konsantrasyonu olarak 0.1 µg/mL.
Dikkat: DAPI bilinen bir alkil olduğunu ve dikkatle ele alınmalıdır.
- Aspirasyon tarafından birincil antikor kaldırın. TBS-Triton ve nazik bir orbital Çalkalayıcı karıştırma ile 5 min için yıkama 30 mL içeren kavanoz boyama bir cam slayt daldırın. Taze TBS-Triton ile yıkama adımı yineleyin. Dış görev aşırı TBS-Triton fitil ve 100-150 µL her slayt için ikincil antikor karışımı pipet.
- Emin olun doku tarafından antikor karışım tamamen kaplıdır. Karanlıkta oksijen odasında oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
- Ve slayt içeren TBS (Triton) 30 mL kavanoz boyama cam içine transfer aspirasyon tarafından ikincil antikor karışımı çıkarın. Nazik bir orbital Çalkalayıcı karıştırma ile 5 dakika yıkayın. Taze TBS. yıkama adımla 0.1 µg/mL DAPI counterstain 100-150 µL her slayta uygulamak ve karanlık oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya Yinele.
- Slaytları bir cam kavanoz TBS içeren boyama transfer ve 3 kez nazik 5 min her, taze TBS her yıkama için kullanarak için karıştırma ile yıkayın. Fitil uzakta aşırı arabellek.
- Sulu montaj orta doku olarak uygulamak 3 damla. Forseps kullanarak, bir temiz cam coverslip bir kenar ile başlayan ve yavaş yavaş diğer kenarına hava kabarcıkları yakalama önlemek için düşürücü dokusu üzerine yavaşça indirin. Coverslip hemen Imaging Eğer çıkarmak değil için dikkat ediniz. Aksi takdirde, karanlıkta 4 ºC, saklamadan önce kuru montaj orta izin.
4. Floresans mikroskobu
- dönüş floresan lamba, mikroskop hem de bilgisayarda ve 15 dk. lekeli doku slaytlar floresan mikroskop aşamasında yer için ısıtmak lamba sağlar. 10 x büyütme oranında dokuyu bulmak için parlak alan görüntü kullanın.
- Bir damla GKD 2 O coverslip yüzeye uygulamak ve bir 20 x su daldırma objektif lens kullanmak (NA = 1,0). 4-line ortalama uçak tarama ayarı seçin. İğne deliği boyutu ~ 3 mikron optik bir dilim veren 1 havadar birimini ayarlayın. Lazer uyarma ve emisyon dalga boylarında her fluorophore için en iyi sinyal için ayrı parça seçin.
Not: Alexa 488: λ ex 488 nm (argon lazer) λ em = 493-570 nm; = λ Texas kırmızı: ex 561 = nm (DPSS 561 nm lazer), λ em 601-635 nm; = λ DAPI: ex = 405 nm (diyot 405 lazer), λ em 410-507 nm =.- Lazer güç ayarlamak ve sinyal şiddeti her parça için en iyi duruma getirmek için ayarları kazanç. Bileşik görüntü toplayabilir ve kaydedebilirsiniz. Floresans yoğunluklarda farklı bir slayt içinde karşılaştırmak için aynı lazer ayarları kullanın.
- Floresan yoğunluğu her kanaldaki görselleştirme için RGB profil araçları makro ImageJ 10 için yükleyin. Makroyu Microsoft Web sitesinden (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt) metin dosyası olarak kaydedin. ImageJ menüde Eklentiler - > makrolar - > yüklemek; RGB profillerini aracını yüklemek için metin dosyasını seçin.
- İçinde ImageJ confocal görüntü dosyasını açın ve bileşik görüntüler 3 yığınları RGB'ye aşağıdakileri gerçekleştirerek dönüştürmek: görüntü - > renk - > kanal aracı. Seçin " kompozit " açılır menü ve onay tüm üç kanal. Sonra görüntü - seçin > türü - > RGB renk.
- RGB profil Araçları simgesini seçin ve profiled için görüntünün bölümünde arasında bir çizgi çizin. Komplo için bir elektronik tablo olarak yoğunluğu verileri kaydetmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Photobleaching ön arıtma adım standart ayirt protokolü hemen önce antijen alımı ve immunostaining (şekil 1A) eklenebilir. Derleme photobleaching cihazları da çeşitli, kullanarak gerçekleştirilebilir ucuz, kapalı bileşenleri (şekil 1B). Beyaz fosfor emisyon spektrum LED'ler kapsar geniş menzilli photobleaching için uygundur dalga boyu geniş bir yelpazesi ile önceki raporlar (şekil 1 c)5,11kabul. 48 saat photobleaching sonra lipofuscin yanı sıra genel arka plan Floresans benzer autofluorescent speckles yoğunluğu önemli ölçüde her iki emisyon dalga boylarında FTLD-T (şekil 1 d) günahı bir kısmında düşürüldü. Photobleaching etkinliği gösterdiği için hyperphosphorylated tau patolojik tau kapanımlar bir durumda FTLD-t iki farklı ikincil antikorları kullanarak görselleştirmek için lekeli. Tau kapanımlar farklı şekil ve aynı zamanda etiketleme için iki kromofor kullanımı güvenle autofluorescent özellikleri teknik doğrulamak için istenen hedeflerden ayırt etmemizi sağlar.
Daha düşük büyütmede bileşik Albümdeki Alexa 488 ve Texas kırmızı kanalları, arada gelen sarı lekeli tau-pozitif kapanımlar morfolojisi halka şeklinde koleksiyonları olarak adlandırılır kısa cep işlemleri oluşur ' astrositik plaklar (şekil 2a-c). Bu Morfoloji hangi davayı patoloji raporu ile aynı fikirde corticobasal dejenerasyon (CBD)12,13, özelliğidir. Tedavi edilmemiş örnekte çok sayıda yapıları tau kapanımlar benzer değil ve floresan autofluorescence olduğunu düşündüren öncelikle kırmızı kanal, gösterdi kompozit görüntü mevcut amaçlanan antikor boyama yerine. Arka plan Floresans belli bir düzeyde de görüş alanı (şekil 2a) boyunca bu kanaldaki görülür. Bu autofluorescent özellikleri kaldırılır ve genel görüntü daha temiz görünür örnekleri photobleaching (PB) ve kimyasal içki (şekil 2b-c) ile tedavi edildi.
O zaman bu örnekler Floresans farklılıkları her örnek küçük bir bölgede profil oluşturma sayılabilir. Bir tek astrositik plak karşılaştırma (şekil 2B-r) için her tedavi durumu gösterilir. Tedavi edilmemiş örnekte arka plan Floresans tüm üç kanalları var ama ikincil antikor Floresans Alexa 488 ve Texas kırmızı antikorları için nispeten yüksek (incir 2h). Ancak, tedavi edilmemiş örnekte mevcut autofluorescent yapıları tau (Şekil 2 h) lekeli Texas kırmızı ikincil antikor karşılaştırılabilir Texas kırmızı kanaldaki Floresans yoğunluklarda vardı. Eğer hedef protein ayrı, tahmin edilebilir olan Morfoloji tau gibi bizim durumumuzda yoktu, doku autofluorescence görüntü uninterpretable hale.
Buna ek olarak, ne zaman photobleaching ön arıtma immunostaining, arka plan Floresans Alexa 488 yılında önce uygulandı ve Texas kırmızı kanallarını önemli ölçüde azaltılmış tedavi edilmezse örnek ve immunostained tau floresan ile karşılaştırıldığında etkilenmemiş kaldı (şekil 2i-m). Ticari kimyasal içki Alexa 488 kanaldaki autofluorescence photobleaching olarak etkili söndürülür. Ayrıca 48 h photobleaching tedavi (Şekil 2 m) tarafından etkilenmez DAPI arka plan Floresans bastırılır. Ancak, kimyasal içki de ters su verme (şekil 2n-r) belirli bir ölçüde düşündüren Texas kırmızı ikincil ve DAPI sinyalleri, yoğunluğu azalır.
Resim 1 : Photobleaching ön arıtma standart ayirt iş akışında uygulanması. A) Basitleştirilmiş şematik görüntüleme için doku edinme standart ayirt iletişim kuralı. Birincil ve ikincil floresan antikor uygulanması karikatürler tarafından temsil edilir. Bir temsilci mikroskop görüntüsü elde edilir. Ölçek çubuğu 100 µm. B =) kapalı bileşenleri (yansıtıcı kapak gösterilmez) kullanılarak inşa bir temsil photobleaching aparatı. C) beyaz LED dizi emisyon spektrum. Bir dar emisyon tepe 450 nm ve 550 geniş bir zirve nm gözlenen. D) etkisi photobleaching endojen arka plan floresan FTLD-T doku Alexa 488 (493-570 nm) ve Texas kırmızı (601-635 nm) emisyon dalga boylarında. Lipofuscin benzeyen Autofluorescent speckles gözle görülür 48 h photobleaching sonra azalır. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2:autofluorescence kaldırma görüntü kalitesi ile anti-fosforile tau immunostaining. FTLD-T doku olgusu üzerinde etkisini a-c) düşük büyütme, bileşik ayirt görüntüleri temsilcisi alanları görmek tedavi edilmemiş (a), (c) örnekleri photobleached 48 h (b) ve kimyasal içki için tedavi. Renkleri temsil Floresans aşağıdaki kanalları yolu ile onların anılan sıraya göre ışık kaynakları tarafından uyarma: Alexa 488 (yeşil): λex 488 nm (argon lazer) λem = 493-570 nm; = Texas Red (kırmızı): λex 561 = nm (DPSS 561 nm lazer), λem 601-635 nm; = DAPI (mavi): λex = 405 nm (diyot 405 lazer), λem 410-507 nm =. Ölçek çubuğu = 100 µm. d-r) tedavi edilmemiş (d-g), photobleached (i-l) ve kimyasal içki (n-q) tedavi örnekleri, ayrı Floresans kanalları, noktalı bölgeler yüksek büyütme görüntüler birleştirilmiş görüntü ve sayısal Floresans sinyal profilleri. Noktalı çizgiler (g, l, q) birleştirilmiş kanallarda hangi sinyali profilleri (h, m, r) oluşturulan satırı temsil eder. Ölçek çubuğu 50 µm. Autofluorescent parçacıklar (af) =immunolabeled tau floresan (tau) ve çekirdeği sinyal (nuc) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu el yazması açıklanan dokuların photobleaching ön arıtma kapalı bileşenleri kullanarak autofluorescence etkili eleme için sağlar. Protokol ayirt görüntüleme fosforile tau toplamları insan beyninin formalin sabit doku ikincil antikorlar Alexa 488 ve Texas kırmızı, DAPI bir nükleer counterstain olarak Birleşik kullanarak açıklar. Diğer dokulara yöntemi uygulamak için bir başlangıç noktası olarak örnek bir 48 h photobleaching ön arıtma yapmak tavsiye. Photobleaching sonra için iletişim kuralı özellikleri üreticinin önerilerini takip antikor dilutions kullanarak ilgi boyama standart ayirt gerçekleştirin. Arka plan Floresans hala varsa, photobleaching süresi ve/veya adımları boyama antikor değiştirilmesi gerekir. Photobleaching süresi aparatı ve autofluorescence örnek düzeyi oluşturmak için seçilen lamba bağlı olarak değişir. Her benzersiz lamba aparatı için uygun beyazlatma zaman belirlenmelidir. Bu TBS-azid içinde monte ve floresan mikroskop kullanarak 12 h aralıklarla slaydın Floresans endojen ölçme günahı, bir coverslipped doku bölümüne photobleaching tarafından yapılabilir. Önceki raporlarda, parçacık analizi ile lipofuscin photobleaching izlenen ve eğri üstel çürümesi için uygun işlevleri5ama kolaylık olması için düzenli aralıklarla bölümlerin görsel gözlem yargılamak eşit derecede etkili olabilir süre sonunda floresan çoğu olur söndürülür. Yaşlı beyin dokusu lipofuscin pigmentler yüksek miktarda içeren bizim durumumuzda, 48 h kuluçka bir 800 lux lamba ile yeterli. Belirli sinyal photobleaching sonra arka plana göre zayıf kalırsa, boyama sırasında birincil ve ikincil antikorları konsantrasyon artırmayı düşünün. Arka plan sinyal ikincil non-spesifik antikor bağlama tarafından neden değildir sağlamak için ikincil bir salt antikor kontrolü yapmak önemlidir. Take care değil cross-react antikorlar seçin, özellikle çoklu hedefleri için boyama zaman. Ayrıca, belirli sinyalleri yanlışlıkla boyama işlemi sırasında söndürülür değil emin olun. Örneğin, Nisl leke (için nöronlar boyama) tarafından BSA söndürülür. Bu durumda, engelleme çözümünün BSA bileşeni balık cilt jelatin5gibi alternatifleri ile değiştirilmelidir.
Photobleaching için beyaz fosfor LED kullanımı belirli sınırlamaları nedeniyle kendi emisyon spektrum üzerinden 420 vardır nm 650 nm. Böylece, UV dalga boylarında önemli hiçbir photobleaching mümkündür. Ayrıca, geniş emisyon spektrumlu nedeniyle photobleaching kromofor belirli dalga boylarında, renk filtresi sayfalarını istenmeyen emisyon dalga boylarında filtre uygulamak için LED diziler yukarıda overlaying gibi değişiklikler gerektirir. Ayrıca, photobleaching doku diğer yöntemlere göre daha uzun işlem süreleri gerektirebilir. Bu durumda, beyin dokusundan (89-yıl-yaşlı bireyin), yaş ve 2 günden fazla uzun aldehid fiksasyon süre nedeniyle, 48 h photobleaching süresi gerekli oldu. Hiçbir etkin işlem zamanı gerekli olsa da, bir göz önünde photobleaching zaman ve boyama oturum planlamanızı buna göre yapın. Önemli ölçüde daha yüksek parlaklık LED lambalar veya birden çok lambalar kullanımı foton akı basit artış photobleaching süreyi azaltabilirsiniz.
Varolan yöntemlerine göre bizim teknik birkaç önemli avantajlar sunar. Floresans mikroskobu tarama lazerler kullanarak photobleaching, biz fotoğraf indüklenen zarar LED photobleaching kullanarak bizim örnekleri belirtisi yok gözlenen. Cihazlarımızı başka bir büyük avantajı maliyet önemli azalma diğer teknikleri üzerinde olmasıdır. Cihazlarımızı Meclisi maliyeti yaklaşık $10 YTL, ve öyle ki yeterince herhangi bir laboratuvar photobleacher kendilerine ait sürümünü kabul edebilirsiniz Montaj cihazları esnek. Karşılaştırma, chambers soğutma gerektirir kadar 10008oluşturmak için ABD Doları ve diğer yöntemleri kullanarak mutispectral diziler özel slayt sahipleri yol açtı. Ayrıca, ticari kimyasal quenchers $120 USD 100 slayt için maliyet ve potansiyel olarak istenmeyen bileşikleri örnek tanıtmak sarf malzemeleri vardır. Büyük olasılıkla da çalışmanın Karşılaştırmada kullanılan kimyasal içki lipoproteinler immunostaining ile girişime neden olabilir lipid-bağlama Sudan siyah boya içerir.
Genel olarak, en kritik adımları photobleaching ön arıtma ve immunostaining örnek bölüm işleme sırasında immunostaining içerir. Bu bölüm photobleaching sırasında rehydrated sonra bu herhangi bir sonraki adım kurumasına izin verilmez ki önemlidir. Slayt kurutma antikorlar düzensiz dağılımı neden ve uninterpretable yapıları oluşturun. Zaman ve potansiyel olarak değerli örnekleri kaybını önlemek için iletişim kuralı birkaç adımda, özen göstermelidir. Antijen alımına sonra doku TBS-Triton permeabilization çözüm aktarmadan önce soğutmak izin vermek. Örnek yüksek sıcaklıklara ısıtıldığında hava maruz kalmaktan bile anlık anlık doku kurutma neden olur. Ayrıca antikor, engelleme veya counterstain çözümleri tam belgili tanımlık doku uygulama sırasında kapak emin olun. Bu doku tam çözüm axım önlemek için hidrofobik kalem tarafından özetlenen ve tüm çözümler bir yüzeyin üzerinde oksijen odasında uygulanır emin yaparak elde edilebilir. Bu gece incubations (birincil antikor bağlama) sırasında özellikle önemlidir.
Photobleaching boyama önce beyaz fosfor LED kullanarak başarılı uygulama ayirt yöntemleri uygulama arşivlenmiş dokulara kolaylaştırabilir. Biz gelecekte çok çeşitli örnekler mükellef olmasını bekliyoruz çok yönlü ve ucuz bir tedavidir. Biz sadece insan beyin dokusu ile bu yöntem uygulamış olan rağmen bu tekniği kolayca herhangi bir boyama Protokolü dahil edilebilir hangi autofluorescence arzu edilen sonuçlar, özellikle postmitotic doku iskelet ya da kalp gibi engelliyor kasları nerede lipofucin birikir olasılığı daha yüksektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışma tamamen veya kısmen Kanada Konsorsiyumu ateş ve yaşlanma (CCNA), Kanada Enstitüsü, Sağlık Araştırma (CIHR), Kanada (ALS Kanada) ALS Derneği ve Alzheimer Derneği Kanada (ASC) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Sultan Darvesh ve Andrew Reid bankadan deniz beyin dokusu FTLD beyin dokuları sağlamak için Milan Ganguly Spatio-Temporal hedefleme ve radyasyon amplifikasyon yanıt (STTARR) programı ve onun bağlı teşekkür etmek istiyorum Ajanslar gömme ve Hizmetleri ve gelişmiş optik mikroskobu tesisi (mikroskopi aletleri sağlamak için AOMF) kesit doku için finansman. Kevin Hadley el yazması kritik inceleme için teşekkür etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T.
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al.
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
