Summary
Фон аутофлюоресценция биологических образцов зачастую осложняет на основе флуоресценции методы визуализации, особенно в возрасте человека постмитотических тканей. Этот протокол описывает, как можно эффективно удалить аутофлюоресценция из этих образцов использование коммерчески доступных Светоиспускающий диод свет источника в photobleach образце до иммуноокрашивания.
Abstract
Иммунофлюоресценции это общий метод, используемый для визуализации субцеллюлярные отсеков и определить локализацию специфических белков в образец ткани. Большим препятствием для приобретения иммунофлюоресценции изображения высокого качества — эндогенного аутофлюоресценция тканей, вызванных старения пигменты как липофусцин или общих процессов подготовки образцов таких как альдегид фиксации. Этот протокол описывает, как фон флуоресцирования можно значительно сократить через Фотообесцвечивание, с использованием белого фосфора Светоиспускающий диод (LED) массивов до лечения с флуоресцентных зондов. Широкий спектр эмиссии белого фосфора светодиоды позволяют для отбеливания флуорофоров по целому ряду пики выбросов. Аппарат Фотообесцвечивание могут быть построены из готовых компонентов по очень низкой цене и доступной альтернативой коммерчески доступных химических quenchers. Фотообесцвечивание Предварительная обработка ткани, следуют обычных иммунофлюоресценции пятнать генерирует изображения бесплатно аутофлюоресценция фон. По сравнению создан химических quenchers, которые сократили зонд, а также фон сигналов, Фотообесцвечивание лечения было не влияет на интенсивность флуоресценции зонда, в то время как она эффективно уменьшить фон и липофусцин флюоресценция. Хотя Фотообесцвечивание требует больше времени для предварительной обработки, более высокой интенсивности Светодиодные массивы могут использоваться для уменьшения времени Фотообесцвечивание. Этот простой метод потенциально может применяться в различных тканях, особенно постмитотических тканей, которые аккумулируют липофусцин например мозга и сердечной или скелетных мышц.
Introduction
Микроскопии флуоресцирования, с использованием антител против специфические белки обычно используется для визуализации протеинов интереса в культуре клеток и тканей. Серьезным осложнением на приобретение ясного и окончательного изображения в иммунофлуоресценции, Аутофлюоресценция, которое может быть вызвано эндогенно в тканях млекопитающих возраст пигмент липофусцин и белков эластина и коллагена в1, 2. Другие источники аутофлюоресценция могут быть введены через шаги подготовки образца как альдегид фиксации3. Липофусцин гранул, состоящий главным образом из окислительно модифицированных белков и липидов деградации остатков, накапливаются в Лонг живые клетки с повышенной возраст2. Это вызывает трудности в imaging постмитотических тканей мозга и сердечной или скелетных мышц, как спектр липофусцин флюоресценция выбросов является широкой и переменных, часто совпадает с длиной волны выбросов общей флуорофоров, используется для Маркировка4. Эти факторы делают изображений человеческого мозга ткани от случаев позднего начала нейродегенеративных заболеваний, таких как frontotemporal Лобар дегенерация (FTLD) особенно сложной.
Чтобы уменьшить аутофлюоресценция, мы разработали технику, в которой мы облучить разделов слайд установлен ткани с белым Светоиспускающий диод (LED) массива с использованием бытовых стол лампа5. Этот простой метод предоставляет альтернативу методы, которые используют химические quenchers например CuSO4 в Ацетат аммония, или коммерчески доступных, закалки красителей Судан черный B и Эриохром черный Т6. Она также имеет значительные экономии более многоспектральных привело лампа Фотообесцвечивание методы и избежать осложнений и артефакты, создаваемые цифровой аутофлюоресценция методы удаления как спектральные снимите смешивания7,8. Белый фосфор светодиоды имеют широкий спектр излучения, высокая яркость и низкой стоимости производства, что делает их идеальными как готовый компонент для Фотообесцвечивание различных хромофоры5,9.
В этом протоколе мы продемонстрировать строительство Фотообесцвечивание аппарат, с помощью доступных компонентов и применить Фотообесцвечивание к делу FTLD ткани, содержащие Тау положительных включений (FTLD-T) с использованием антител специфических для фосфорилированных Тау. Мы продемонстрировать влияние Фотообесцвечивание на визуализации дневно обозначенного антитела, используя два часто используемых хромофоры: Alexa 488 и Техас красный. Эффект Фотообесцвечивание по сравнению с необработанной секции или тех, кто лечится коммерческих химических утоления количественно и сравнить. Этот Фотообесцвечивание до лечения могут быть включены в любой стандартный иммунофлюоресценции окрашивание протокол для удаления аутофлюоресценция в биологическом образце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: представленных работ была выполнена в соответствии с признанным международным стандартам, в том числе на международной конференции по гармонизации (мкг), Совет международных научно-медицинских организаций (СМНМО) и принципы Хельсинкской декларации. Использование тканей человека был с одобрения Совета этики научных исследований Университета здоровья сети. Человеческий мозг образцы были собраны как часть морского банка тканей мозга. Во время сбора, информированное согласие было получено от всех больных.
1. Строительство Фотообесцвечивание аппарат и решения
- подготовка запасов решения.
- Подготовить 1 L 1 x запасов трис буфер солевой раствор (1 x TBS) раствор (150 мм NaCl, 50 мм трис-Cl, рН 7,4), растворяя 8.77 г NaCl и 6.06 г трис базы в 800 мл ddH 2 O и скорректировать рН 7,4, с использованием HCl. Принесите вверх объемом 1 Л и автоклав. < / Li >
- подготовить азид натрия 10% (200 x бульон), растворяя 1 g азид натрия в 10 мл ddH 2 O (10%, 200 x фондовой).
- Для 1-3 Стандартный размер слайдов, использовать единый 100 мм x 100 мм прозрачный, квадратный Петри как слайд камеры. Один слайд камеры добавьте 0,25 мл акций азид натрия 200 x 50 мл 1 x TBS чтобы сделать азид TBS раствор 0,05%. Стек 2-3 слайд камер по вертикали, чтобы обрабатывать дополнительные слайды. Подготовить дополнительные 50 мл раствора азид TBS для каждой камеры.
- Создать леску поднять слайд chamber(s), таким образом, что голова лампа может поместиться под.
- Для 100 мм x 100 мм слайд палата, вырезать отверстия в дне и по бокам 100 мм x 100 мм x 30 мм пластиковая еда контейнера и инвертировать контейнера. Обеспечить достаточно большой, чтобы соответствовать светодиодный источник света и обеспечить открытие нижней достаточно большой, таким образом, чтобы свет от источника света достигает палате образец без препятствий боковых отверстия.
- Применять Изоленты на эшафот увеличить сцепление между эшафот и образец камеры/benchtop. Использовать любые альтернативные материалы для построения леска до тех пор, пока он надежно поднимает камеру слайд без противодействия свет от достижения образца.
- Удалить любой диффузоры или непрозрачного пластика из настольную лампу, которая может препятствовать светодиодный свет непосредственно добраться до образца (если возможно) и ориентировать светодиодов вверх. Место chamber(s) леску и слайд над светодиодов. Использовать лампы с гибким горлышком для легкой манипуляции.
- Конструкция отражающих купол крышка для аппарата, подкладка внутри коробки достаточно большой, чтобы покрыть слайд камеры и леска с алюминиевой фольгой. Используйте поле наконечник пипетки 1 мл для одной камеры или 150 мм х 150 мм х 150 мм картонную коробку для нескольких, вертикально сложены камер.
2. Фотообесцвечивание Предварительная обработка разделов ткани
Примечание: раздел Подготовка тканей может варьироваться в зависимости от источник ткани и фиксации и внедрение методов, используемых. Здесь, было зафиксировано мозговой ткани (орбитофронтальной Извилин) от случай FTLD-T ~ 2 дня в формалин, запустить через градиент сахарозы, встроенные в OCT и сократить до 10 мкм толщиной разделов с помощью криостата.
- В 4 ºC холодная комната, холодная кабинета или Холодильник, Ориент лампа под леску и поместить в камеру образец на эшафот. Залить 50 мл раствора азид TBS в камеру образец.
- Submerge ткани разделы монтируются на стандартных стеклянных скольжениях микроскопа в камеру слайд, содержащие азид TBS, используя чистые пинцет. Для нескольких слайдов, убедитесь, что слайды размещены в камере в единственном слое.
- Покрытия аппарат с отражающей купол, включите светодиодная лампа и инкубировать в течение 48 часов при температуре 4 °.
3. Иммунофлюоресценции
- пятно тканей для фосфорилированных Тау, используя DAPI изображение и Alexa 488 - и Техас красно-конъюгированных вторичные антитела, сначала подготовить решения для антигена, permeabilization, блокировка и первичной антитела binding.
- Подготовить 500 мл антигена извлечения буфер (лимонная кислота 10 мм, 2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота, 0,05% 20 анимации; рН 6,2) путем растворения 0,92 г лимонной кислоты и 0,37 г Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в 500 мл ddH 2 O. Adjust pH 6.2 с NaOH и добавить 0,25 мл анимации 20.
- Подготовить 500 мл 0,025% Тритон X-100 в растворе (TBS-Тритон) TBS, добавив 0,125 мл Тритон X-100 500 мл 1 x TBS.
- Подготовить раствор 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в TBS (BSA-TBS буфера), растворяя 0,1 г BSA в 10 мл TBS.
- Подготовить блокирующие решение путем добавления 0,2 мл сыворотки нормальной коза 1,8 мл 1% BSA/TBS.
- Для каждого слайда, подготовьте 150 мкл раствора первичного антитела (разбавления 1: 100), дозирования 1.5 мкл анти фосфо PHF-Тау pSer202 + Thr205 (AT8) антител в 148.5 мкл 1% BSA-TBS буфер и оставить на льду
- Для выполнения поиска антигена, погрузите photobleached слайды вертикально в коллекторе слайд, содержащий 25 мл буфера получения антигена. Закрепите коллектор с ленты и/или строки таким образом, что коллектор не попадают в водяной бане. Тепла коллекционера в водяной бане при температуре 90 ° для 30 мин и позволяют сборщику остыть до комнатной температуры на 30 минут перед удалением слайды. ДУ не удалить слайды сразу же, как он вызовет разделы высыхать.
- Передачи слайды из коллектора извлечения антигена в окрашивание банку заполнены с 30 мл TBS-Тритона и мыть в разделах 5 мин на орбитальный шейкер с нежным встряхивания. Повторите один раз промыть свежим TBS-Тритон. Фитиль от избыточного буфер безворсовой салфеткой и наметить ткани с гидрофобным пера. Будьте осторожны, не допустить слайды высохнуть.
- Для каждого слайда, блокировать ткани, дозирования 200 мкл блокирования раствор на ткань и место слайда в камере увлажненной. Постройте камеры, поместив слайд стойку внутри коробки наконечник пипетки, содержащий влажной салфеткой. Инкубации при комнатной температуре на 2 ч на ровной поверхности. Убедитесь, что блокирование решение полностью покрывает ткань.
- Удалить блокирующий решение путем аспирации и Пипетка 100-150 мкл раствора первичного антитела на ткани. Обеспечить достаточное количество антител присутствует и что раздел находится на ровной поверхности, чтобы избежать объединения раствор антител в одну сторону. Инкубируйте на 4 ° c на ночь в камере увлажненные.
- Подготовить смесь вторичного антитела и DAPI ядерной изображение.
- Для каждого слайда, подготовить 150 мкл вторичное антитело смесь (1: 100 разведений) путем добавления 1,5 мкл коза анти мыши Alexa 488 и 1,5 мкл коза анти мыши Техас красного до 147 мкл BSA-TBS и оставить на ДВС.
- Подготовка 0,1 мкг/мл DAPI изображение путем последовательного растворения. Стоковый раствор тщательно перемешать и разбавить 1 мкл акций 5 мг/мл DAPI в 999 TBS сделать 1 мл 5 мкг/мл раствора. Для каждого слайда разбавьте 3 мкгL 5 мкг/мл раствора с 147 мкл TBS в конечной концентрации 0,1 мкг/мл.
Предупреждение: DAPI является известный мутагены и должны быть обработаны с осторожностью.
- Удаления основного антитела путем аспирации. Опускайте слайды в стакане, окрашивание jar, содержащий 30 мл TBS-Тритон и мыть за 5 мин с нежным смешивания на орбитальный шейкер. Повторите шаг мыть с свежими TBS-Тритон. Фитиль от избыточного TBS-Тритон и Пипетка 100-150 мкл смеси вторичного антитела к каждому слайду.
- Обеспечить ткани полностью охватываются смесь антител. Проинкубируйте втечение 2 ч при комнатной температуре в увлажненные камере в темноте.
- Снимите смесь вторичного антитела путем аспирации и передача слайд в стакан пятнать jar, содержащий 30 мл TBS (не «Тритон»). Мыть за 5 мин с нежным смешивания на орбитальный шейкер. Повторите шаг мыть с TBS. свежие применить к каждому слайду 100-150 мкл рабочего раствора 0,1 мкг/мл DAPI изображение и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре в темноте.
- Передачи слайдов на стакан, окрашивание jar, содержащий TBS и мыть 3 раза с нежным смешивания 5 минут каждый, с использованием свежих TBS для каждой стирки. Фитиль от избыточного буфера.
- Применить 3 капли водный монтажа средних тканей. С помощью щипцов, аккуратно опустите чистого стекла coverslip на ткани, начиная с одного края и медленно снижение другой край, чтобы избежать захвата воздушных пузырьков. Будьте осторожны, не выбить coverslip если изображений сразу. В противном случае, позволяют монтаж среднего высохнуть, прежде чем хранить при 4 ° c в темноте.
4. Микроскопии флуоресцирования
- поворот на люминесцентная лампа, микроскоп и компьютер и разрешить лампы тепло за 15 мин место окрашенных тканей слайды в флуоресценции микроскопа. Используйте светлые области изображения для поиска ткани при 10-кратном.
- Применять капли ddH 2 O на coverslip поверхность и использовать объектив погружения воды 20 x (NA = 1.0). Выберите настройки сканирования 4-строчный средняя плоскость. Задайте размер обскуры 1 Эйри единица, которая дает оптических ломтик ~ 3 мкм. В отдельных треков для лучших сигнала выберите лазерного возбуждения и выбросов длин волн для каждого Флюорофор.
Примечание: Alexa 488: λ ex = 488 нм (аргоновый лазер) λ ет = 493-570 Нм; Техас красный: λ ex = 561 Нм (СППЗ 561 Нм лазер), Эм λ = 601-635 нм; DAPI: λ ex = 405 нм (лазерный диод 405), Эм λ = 410-507 Нм.- Отрегулировать мощность лазера и получить параметры для оптимизации интенсивности сигнала для каждого трека. Собирать составное изображение и сохранить. Используйте те же параметры лазера для сравнения интенсивности флуоресценции в другой слайд.
- Для визуализации интенсивности флуоресценции в каждом канале, установить макрос инструменты профиля RGB для ImageJ 10. Сохраните макрос из веб-страницы в виде текстового файла (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). ImageJ меню, выберите плагины - > макросы - > установки; Выберите текстовый файл, чтобы установить средство профили RGB.
- Открыть файл конфокальное изображение в ImageJ и преобразования композитных изображений из 3 стеки в RGB, выполнив следующие действия: изображение - > цвет - > канал инструмент. Выберите " композитных " из раскрывающегося меню и проверьте все три каналы. Затем, выберите изображение - > тип - > цвет RGB.
- Выберите значок инструменты профиль RGB и нарисовать линию через раздел в изображении для профилирования. Сохранить интенсивность данных как электронную таблицу для черчения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На этапе предварительной обработки Фотообесцвечивание могут добавляться стандартный иммунофлюоресценции протокола непосредственно до получения антигена и иммуноокрашивания (рис. 1A). Ассамблея Фотообесцвечивание аппарата может также выполняться с использованием различных, недорогой, готовых компонентов (рис. 1B). Спектр излучения белого фосфора светодиоды охватывает широкий спектр длин волн, что делает их подходящими для широкого диапазона Фотообесцвечивание, согласившись с предыдущих докладов (рис. 1 c)5,11. После 48 ч Фотообесцвечивание интенсивность autofluorescent крапинками, которые напоминают липофусцина, а также общий фон флуоресценции был значительно сокращены в обоих выбросов волн в неокрашенных секции FTLD-T (рис. 1 d). Продемонстрирована эффективность Фотообесцвечивание, мы витражи для Тау hyperphosphorylated для визуализации патологических Тау включений в случае FTLD-T с помощью двух различных вторичных антител. Различные формы Тау включений и использование двух хромофоры для маркировки также позволяет нам уверенно различать autofluorescent функции от предназначены для проверки метода.
В композитных изображений на нижней масштаб, морфология Тау позитивных включений, окрашенные желтые от комбинации Alexa 488 и Техас красный каналы, состоит из кольцевых коллекций коротких клеточных процессов, которые называются ' Астроцитарная бляшки (Рисунок 2a-c). Этот морфологии характерно corticobasal дегенерация (КБР)12,13, который соглашается с патологии доклад этого дела. В образце необработанной, многочисленные структуры присутствуют в составное изображение, которые не напоминают Тау включений и показал флуоресценции преимущественно в красный канал, предполагая, что это аутофлюоресценция вместо предполагаемой антитело пятная. Заметный уровень фона флуоресценции видна также в этом канале во всем поле зрения (рис. 2a). Эти функции autofluorescent будут удалены, а общий образ появляется намного чище, когда образцы были относиться с Фотообесцвечивание (PB) и химической утоления (Рисунок 2b-c).
Затем мы количественно флуоресценции различия в этих образцах путем профилирования меньшего региона в каждом образце. Один Астроцитарная налета представлен в каждом лечение условие для сравнения (Рисунок 2d-r). В образце необработанных флуоресценции фон присутствует во всех трех каналах, но вторичные антитела флуоресценции для Alexa 488 и Техас красный антител был относительно высоким (рис. 2h). Однако autofluorescent структуры, присутствующие в untreated образец был интенсивностью флюоресценции в Техас красный канал, сопоставимые с Техас красный вторичное антитело, что витражи для Тау (Рисунок 2 h). Если в нашем случае целевого белка не собственный, предсказуемой морфология как Тау, Аутофлюоресценция в ткани бы вынесли изображения нечитаемое.
В отличие от этого, когда предшествующее лечение Фотообесцвечивание был применен до иммуноокрашивания, фон флуоресценции в Alexa 488 и Техас красный каналы был значительно сокращен по сравнению с необработанной образца и флуоресценции Тау immunostained оставался неизменным (Рисунок 2i-м). Коммерческих химических утоления закаленном аутофлюоресценция в Alexa 488 канале так же эффективно, как Фотообесцвечивание. Он также подавил DAPI фон флуоресценции, который не был затронут 48 h Фотообесцвечивание лечения (рис. 2 m). Однако химической утоления также сократить интенсивность Техас красный среднего и DAPI сигналов, предлагая определенной степени контрпродуктивной закалочные (Рисунок 2n-r).
Рисунок 1 : Применение Фотообесцвечивание предварительной обработки в процессе стандартного иммунофлюоресценции. A) упрощенная схема стандартного иммунофлюоресценции протокола от приобретения тканей для изображений. Применения первичных и вторичных антител флуоресцентные представлена мультфильмы. Представитель Микроскоп изображения производится. Шкалы бар = 100 µm. B) представитель Фотообесцвечивание аппарат, построенных с использованием готовых компонентов (светоотражающая крышка не показан). C) спектр излучения белых светодиодов. Узкая выбросов пик на 450 нм и широкий пик на 550 Нм наблюдаются. D) влияние Фотообесцвечивание на флуоресценции эндогенного фон FTLD-T ткани на Alexa 488 (493-570 Нм) и Техас красный (601-635 нм) выбросов длин волн. Autofluorescent крапинками, напоминающие липофусцин заметно снижаются после 48 ч Фотообесцвечивание. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2:эффект удаления аутофлюоресценция на качество изображения случая FTLD-T ткани с анти фосфорилированных Тау иммуноокрашивания. a-c) малое увеличение, изображения Композитный иммунофлюоресценции представитель поля зрения в неочищенные (), photobleached за 48 ч (b) и химических утоления лечение (c) образцов. Цвета представляют флуоресценции в следующие каналы через возбуждение в их соответствующих источников света: Alexa 488 (зеленый): λex = 488 нм (аргоновый лазер) λет = 493-570 Нм; Техас Red (красный): λex = 561 Нм (СППЗ 561 Нм лазер),Эм λ = 601-635 нм; DAPI (синий): λex = 405 нм (лазерный диод 405),Эм λ = 410-507 Нм. Шкалы бар = 100 µm. д р) выше увеличение изображения пунктирной регионов в необработанной (d-g), photobleached (i-l) и образцы химических утоления лечение (n-q), с отдельной флуоресценции каналами, слияние изображений и количественно флуоресценции сигнал профилей. Пунктирные линии в Объединенном каналов (g, l, q) представляют собой строки, на которой сигнал были созданы профили (h, m, r). Шкалы бар = 50 µm. Autofluorescent частиц (af),указаны полученных Тау флуоресценции (Тау) и ядро сигнал (КНУ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Фотообесцвечивание Предварительная обработка тканей, описанные в этой рукописи позволяет для эффективной ликвидации аутофлюоресценция, с использованием готовых компонентов. Протокол описывает иммунофлюоресценции изображений фосфорилированных Тау агрегатов в формалин Исправлена человеческий мозг ткани, используя вторичные антитела, конъюгированных Alexa 488 и Техас красный, с DAPI как ядерной изображение. Чтобы применить этот метод к других тканей, мы рекомендуем 48 h Фотообесцвечивание предварительной обработки в образце в качестве отправной точки. После Фотообесцвечивание выполняют стандартные иммунофлюоресценции, окрашивание протокол для функции интерес с помощью разбавления антитела следуя рекомендациям изготовителя. Если фон флуоресценции все еще присутствует, продолжительность Фотообесцвечивание и/или антитело пятная шаги должны быть изменены. Продолжительность Фотообесцвечивание будет варьироваться в зависимости от лампы, выбранных для строительства аппарат и уровень аутофлюоресценция в образце. Оптимальное время отбеливания для каждой уникальной лампа аппарат должен быть определен. Это можно сделать путем Фотообесцвечивание разделом безупречная, coverslipped ткани, монтируется в TBS-азид и измерения эндогенного флуоресценции слайд интервалом 12 ч, с помощью микроскопа флуоресценции. В предыдущих докладах, мы контролируется липофусцин Фотообесцвечивание анализ частиц и кривой экспоненциального распада функции5, но для простоты, визуальное наблюдение за разделами на регулярной основе может быть столь же эффективным судить продолжительность которых большая часть флюоресценция становится угасает. В нашем случае возрасте мозговой ткани, содержащие большое количество липофусцин пигментов недостаточно 48ч инкубации с лампой 800 люкс. Если конкретный сигнал остается слабым по сравнению с фон после Фотообесцвечивание, рассмотреть возможность увеличения концентрации первичных и вторичных антител во время окрашивания. Это также важно для выполнения вторичного антитела-управления только чтобы убедиться, что сигнал фон не вызваны неспецифической вторичные антитела связывая. Позаботьтесь, чтобы выбрать антитела, которые не cross-react, особенно когда окрашивания для нескольких целей. Кроме того убедитесь, что конкретные сигналы являются не угасает непреднамеренно в процессе окрашивания. Например пятно Ниссль (для окрашивания нейронов) является закаленном, BSA. В этом экземпляре BSA компонент блокирования решения заменить такие альтернативы, как рыба кожи желатин5.
Использование белого фосфора светодиоды для Фотообесцвечивание имеет определенные ограничения, обусловленные его спектр излучения от 420 Нм до 650 Нм. Таким образом без значительных Фотообесцвечивание в волнах УФ возможна. Кроме того из-за широкий спектр излучения, Фотообесцвечивание хромофоры определенных длин волн требует модификации, такие как наложение фильтр цвета листы выше LED массивов для фильтрации нежелательных выбросов длин волн. Кроме того Фотообесцвечивание ткани может потребовать больше времени обработки, чем другие методы. В этом случае из-за возраста мозговой ткани (от 89-летний человек) и длинные альдегид фиксации период более чем 2 дня, продолжительность 48 h Фотообесцвечивание требуется. Хотя не активное время обработки требуется, необходимо принимать во внимание время Фотообесцвечивание и планировать окрашивание сессии соответственно. Светодиодные лампы более высокой яркости или использование нескольких ламп может значительно сократить время Фотообесцвечивание простым увеличением поток фотонов.
По сравнению с существующими методами, наша техника предлагает ряд значительных преимуществ. В отличие от Фотообесцвечивание, с помощью сканирования лазеров в микроскопии флуоресцирования мы наблюдали никаких признаков фото индуцированного повреждения наших образцов, используя светодиодные Фотообесцвечивание. Другим большим преимуществом нашего аппарата является значительное сокращение расходов над другими методами. Стоимость Ассамблеи нашего аппарата составляет примерно $10 долларов США, и Ассамблея аппарата является гибким, поэтому любой лаборатории может принять свою собственную версию photobleacher. Для сравнения другие методы, с помощью mutispectral привело массивы с пользовательских слайд Держатели и холодильные камеры требует до 1000 долларов для строительства8. Кроме того коммерческих химических quenchers, расходных материалов, которые стоит $120 USD за 100 слайдов и внедрить потенциально нежелательных соединений в образце. Химическая утоления, используемый для сравнения в настоящем исследовании вероятно содержит Судан черный краситель липидов привязки, которая может помешать с иммуноокрашивания липопротеинов.
В целом наиболее важные шаги предварительной обработки Фотообесцвечивание и иммуноокрашивания образца включает обработки секции во время иммуноокрашивания. Важно, что после того, как Секция Регидратированные во время Фотообесцвечивание, не допускается высохнуть в любом из последующих этапов. Сушка слайд будет причиной неравномерного распределения антител и создавать нечитаемое артефакты. Чтобы избежать потери времени и потенциально ценные образцы, необходимо позаботиться на несколько шагов в протоколе. После извлечения антигена позволяют ткани остыть перед передачей в TBS-Тритон permeabilization решение. Даже кратковременный воздействие воздуха когда образец нагревается до высокой температуры приведет к мгновенной сушки ткани. Также убедитесь, что антитела, блокирование или изображение решения полностью охватывают тканей во время применения. Это может быть достигнуто, убедившись, что ткани полностью предложенный гидрофобные перо, чтобы избежать решения стока и что все решения применяются в камере увлажненные на ровной поверхности. Это особенно важно во время ночи инкубаций (основного антитела binding).
Успешное применение Фотообесцвечивание, с использованием белого фосфора светодиоды до окрашивания может облегчить применение методов иммунофлюоресценции архивных тканей. Это универсальный и недорогой лечение, которое мы ожидаем в будущем подпадать широкий спектр образцов. Хотя мы только применяется этот метод к ткани человеческого мозга, этот метод может быть легко включены в любой окраски протокол в котором аутофлюоресценция является предотвращение желаемые результаты, особенно в постмитотических тканей, таких как инфаркт или скелета мышцы, где lipofucin более склонны накапливать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано в целом или в части канадского консорциум нейродегенеративные и старения (CCNA), Канадский институт из медицинских исследований (КНИИЗ), ALS общества Канады (ALS Канада) и болезнь Альцгеймера общества Канады (ASC). Авторы хотели бы поблагодарить Султан Darvesh и Эндрю Рид из морской мозга ткани банка для предоставления в ткани мозга FTLD, Милан Гангули от пространственно-временной ориентации и усиление излучения ответ (STTARR) программы и ее аффилированными финансирующие учреждения для ткани встраивание и секционирование служб и расширенный оптической микроскопии фонда (AOMF) для предоставления инструментов микроскопии. Кевин Hadley поблагодарил за критический обзор рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T.
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al.
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
