Summary
このプロトコルでバキュロ ウイルスは Sf9 細胞にトランスフェクション バキュロ ウイルス プラスミドのプロデュース、無血清培養で増幅されます。上清はヘパリン親和性クロマトグラフィーによる精製、超遠心法でさらに集中しています。このプロトコルは、生産およびバキュロ ウイルス遺伝子治療応用のための浄化に役立ちます。
Abstract
バキュロ ウイルスは、組換えタンパク質、ワクチンの生産のため伝統的に使用されています。しかし、最近では、バキュロ ウイルスは遺伝子治療応用のための有望なベクトルとして現れています。ここでは、バキュロ ウイルス バキュロ ウイルス プラスミド DNA (バクミド) のトランスフェクション Sf9 細胞の付着性文化で生産されています。バキュロ ウイルスは、希望の音量が得られるまでその後 Sf9 細胞の無血清培養に拡張されます。それは、ヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いた培養上清の文化から精製します。ウイルス上清は、バキュロ ウイルスのエンベロープ糖蛋白のヘパリンの親和性により上澄みでバキュロ ウイルス粒子を結合するヘパリンの列に読み込まれます。列は汚染物質を除去するためのバッファーで洗浄、バキュロ ウイルスは高塩バッファーを持つ列から溶離されます。溶出液が等張液の塩濃度に希釈され、バキュロ ウイルス粒子がさらに遠心を使用して集中しています。このメソッドを使用して、バキュロ ウイルス感染粒子の 25% 回復を 500-fold まで集中してすることができます。ただし、ここで説明されているプロトコルは、1 L までの文化から生産と精製、バキュロ ウイルスを示します、メソッドできますがスケール アップ遺伝子治療応用のための臨床グレードのベクトル生成閉鎖系の培養における。
Introduction
バキュロ ウイルスは主に組換えタンパク質とチョウ目ハスモンヨトウ fugiperda (Sf) 9 でワクチンの生産の使用組換えハイブリッドバキュロとmulticapsid の核多角体病ウイルス (AcMNPV) を用いた昆虫細胞1,2,3,4. もっと最近、遺伝子療法アプリケーション5の有望なベクトルとして浮上しています。幅広いホストおよび組織の親和性を持っている知られているし、静止して増殖細胞に感染して、非病原性はホスト染色体4,5,6には統合されていません。また、スケーラブルでありクローズド システムの将来の臨床生産1の処理は、無血清浮遊培養でバキュロ ウイルスを生成できます。
バキュロ ウイルス粒子の純度は細胞毒性7,8,9を最小限に抑えながら効果的な伝達を達成するために重要です。バキュロ ウイルスは、遠心または接線流ろ過 (TFF) 伝染性の影響は限定的で集中することができます。しかし、これらの手順だけでなくウイルス粒子を集中、また細胞の残骸と Sf9 から蛋白質文化、毒性の in vitro (個人的な観察) できるし、炎症や使用する免疫反応を引き起こす可能性があります生体内で。ウイルス株を集中して高度な場合は特に、これを避けるため、バキュロ ウイルス感染を精製し、粒子を汚染から分離する必要があります。
いくつかの方法は、バキュロ ウイルスのベクトル10、11,12の濃縮精製に報告されています。使用可能なアプローチのヘパリン アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーは低濃度タンパク質12を汚染の浄化のシングル ステップの高レベルのことができます。メソッドは、バキュロ ウイルス13,14の受容体としてのヘパラン硫酸の同定に基づいています。列とバキュロ ウイルスのバインディングに Sf9 細胞上清をロードした後列は非連結またはゆるく縛られた汚染粒子を除去する生理学的な (等張性) バッファーで洗浄できます。ヘパリンへのバインドはリバーシブルなのでバキュロ ウイルス粒子は不活性化を防ぐために生理学的 (等張性) 塩濃度に希釈はしてすぐに浸透衝撃12高 salt のバッファーで溶出することができます。また、上のキャプチャと同様に、バキュロ ウイルスの生産とクロマトグラフィー カラムからの溶出実行できます現在の優れた製造基準 (cGMP) に互換性のあるクローズド システム プロセスを使用しています。
ここでは、製造、精製、およびアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーおよび遠心分離を用いた感染バキュロ ウイルスの濃度の詳細なプロトコルを提供します。簡単に言えば、付着性文化のバキュロ ウイルス プラスミッド DNA と Sf9 細胞のトランスフェクションによってバキュロ ウイルスを制作・無血清培養で感染バキュロ ウイルスをさらに拡大します。我々 はヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いたバキュロ ウイルスを浄化し、高い遺伝子治療用ベクターを集中する最後のステップとして遠心を使用します。
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Protocol
プロトコルをまとめた図は、図 1を参照してください。
1. バキュロ ウイルス プラスミド DNA の精製
- 流体培養基 LB の抗生物質; での 200 mL の baculoviral プラスミド DNA (バクミド)14を含む細菌文化を成長します。カナマイシン (50 μ G/ml)、テトラサイクリン (10 μ G/ml)、ゲンタマイシン (7 μ g/mL)、300 rpm で軌道シェーカー設定 37 ° C で 16 時間。
- 標準散プロトコル15を使用して細菌文化からバクミド DNA を浄化し、TE バッファーでバクミドを溶解します。
2. バキュロ ウイルスの生産
- 135 rpm、ポリカーボネート昆虫無血清培1,2,3を含む三角フラスコで 28 ° C で軌道シェーカー インキュベーターで培養 Sf9 細胞。
注:Sf9 細胞が凍結ストックからフリーズ解除、回復し、成長指数段階を入力するセルのために少なくとも二週間を許可します。 - トリパン ブルー染色後の診断と成長指数段階で収穫した Sf9 細胞を数えます。種子 1 x 106 Sf9 細胞培地 2 mL に 6 ウェル培養処理プレートのウェルあたり。インキュベーターで 28 ° C で 1 時間付けるセルを許可します。
- 成長培地を無血清培グレースの昆虫培養液 1 mL に置き換えます。
- 昆虫の細胞のトランスフェクション試薬を用いた Sf9 細胞に DNA バクミドを transfect します。
- ミックス 8 μ L 昆虫の細胞のトランスフェクション試薬グレースの昆虫媒体の 100 μ L で。
- 希釈培昆虫媒体の 100 μ L に DNA バクミドの 2 μ g、ボルテックスで軽く混ぜます。
- 希釈昆虫細胞のトランスフェクション試薬を希釈した DNA を組み合わせて、軽く混ぜます。室温で 15 〜 30 分間インキュベートします。
- セル上に滴下し DNA 脂質混合物を追加します。28 ° c 約 5 h のインキュベーターで孵化させなさい。
- 細胞からトランスフェクション混合物を削除し、2 ml の PBS のセルを洗浄します。
- 昆虫培養液 2 mL を追加し、インキュベーターで 28 ° C で、文化メディアを変更せずに続行します。
注:バクミドには蛍光タンパク質が含まれています、その式がセル 48 時間後トランスフェクションで検出できます。バキュロ ウイルスは transfected Sf9 細胞によって生成され、その後融合細胞を感染する培養液に分泌されます。セル全体人口は、5 日間でバキュロ ウイルス感染し、細胞変性効果とも呼ばれます、ウイルス感染の兆候を示しています。細胞直径が含まれます、細胞質、細胞増殖の停止と死亡または分離細胞の液胞/顆粒が細胞培養の存在。ただし、トランスフェクションや感染効率が最適ではない、文化がない明らかな細胞変性効果が表示されます。200-400 倍の倍率で倒立位相差顕微鏡で細胞変性効果を視覚化できます。バキュロ ウイルス感染細胞は、抗 gp64 抗体11との汚損によって検出できます。 - 収穫バキュロ ウイルス上清 5 日トランスフェクションとラベル後 P1ウイルス ストックとして。
- PBS、バキュロ ウイルス上清、0.5% ウシ血清アルブミン (BSA) で暗闇の中、光に敏感であるに格納します。短期 (90 日まで) のための 4 ° c または長期的には-80 ° C で保存します。
- 昆虫培養培地 10 mL に 10 cm 培養処理板のシード 6 × 106 Sf9 細胞。セルに初期バキュロ ウイルス上清 (1P) の 1 つの mL を追加します。
- バキュロ ウイルス上清 (P2) 5th日後感染症での収穫します。
- シード 50 mL 三角フラスコ 250 mL ポリカーボネートで昆虫培地の培養における Sf9 細胞 (3 x 106セル/mL) と軌道シェーカー インキュベーターでフラスコの場所。セルに P2株式の 2 mL を追加し、28 ° c. の一定した温度を維持しながら 135 回転で振る
注:感染後 3 〜 4 日 Sf9 細胞母集団高価バキュロ ウイルス生産の指標である細胞変性効果が表示されます。 - 音量 (P3P4、...) を取得するまで、順番にバキュロ ウイルス上清を増幅する各後続の感染における細胞培養の 50 のボリュームを 10 増。
注:P3は感染 Sf9 の 1 l、500 mL の細胞培養は、P2バキュロ ウイルス上清; の 10 〜 20 mL に感染することのラウンド 3rdP4は感染 Sf9 のどの 5 ~ 10 L の細胞培養は、P3バキュロ ウイルス上清の 100 に 200 mL に感染することのラウンド 4thです。通常、ml 昆虫無血清培地で/3 × 106細胞 Sf9 細胞がシードされます。 - バキュロ ウイルス細胞の残骸を削除し、ゲノム DNA および RNA を消化する 37 ° C で 2 h の 50 単位/ml ヌクレアーゼ (250 単位/μ L の株式) と清のバキュロ ウイルスの治療に 4 ° C で 30 分間 1,000 x g で上清を遠心します。0.45 μ m のろ過ユニットを介して培養上清をフィルター処理します。
3. クロマトグラフィー システムの準備
- 順番に、サンプルとバッファー ライン各滅菌水、1 N 水酸化ナトリウム、水の洗浄によってクロマトグラフィー システムを準備し、線形流量 50 mL/分で洗浄バッファー (含む 150 mM 20 mM リン酸ナトリウム塩化ナトリウム バッファー、pH 7.0)。
- カラムの洗浄バッファー (5 CV 滅菌 20 mM リン酸ナトリウム バッファー含む 2 M の塩化ナトリウム、pH 7.0) を順番に実行して、ヘパリン 50 μ m 列 (10 × 10 cm、7.9 mL 列ボリューム (CV)) を準備および線形流量 7 mL/min で 5 CV 洗浄バッファー。
バキュロ ウイルスをベクターの清浄化
- クロマトグラフィー システムをとおり設定します。
- バキュロ ウイルス上清をロードするための入口ポートを読み込むサンプルを使用します。
- 洗浄バッファーの読み込みバッファーの入口ポート A1 を使用します。洗浄バッファーの少なくとも 500 ml のボトルを準備し、瓶の中に洗浄バッファーの行を配置します。
- 溶出バッファー (1.5 M の塩化ナトリウム、pH 8.0 で 20 mM リン酸ナトリウム) を読み込むためのバッファー入口ポート A2 を使用します。溶出バッファーの少なくとも 500 mL の瓶を準備し、瓶の中に溶出バッファーの行を配置します。
- 列パススルー バキュロ ウイルス上清を収集する一部のコレクター、洗浄バッファー、および溶出バキュロ ウイルスいくつかの 50 mL の円錐管に挿入します。
- 洗浄バッファー (40 mL) 線形流量 7.0 mL/分での 5 つの 7.9 mL 列ボリューム (CVs) とヘパリン コラムを平衡させ。
- バキュロ ウイルス上清 2.0 mL/min の線形流量でクロマトグラフィー システムのサンプル ポンプ (入口サンプル ポート) を使用して、ヘパリン列に 250 mL をロードします。
- 紫外線 (UV) 吸光度曲線になるまで洗浄バッファーの線形 2.0 mL/min の流量でヘパリン列を介して 10 CVs (80 mL) を実行 (280 nm) がベースラインに戻ったなり安定します。
- ヘパリン列からバキュロ ウイルス粒子を切り離して考えるとき線形流量 4.0 mL/分時計タンパク質クロマト グラム上のシャープな溶出ピークで溶出バッファーの 5 CVs (40 mL) を持つ 7.9 mL ヘパリン列からバキュロ ウイルス粒子を溶出します。
- 後の溶出、すぐに 10 倍その後遠心分離中に浸透衝撃からバキュロ ウイルス粒子の不活性化を防ぐために水に 20 mM リン酸ナトリウム緩衝を使用して溶出バキュロ ウイルス上清を希釈します。
- 各分画の 100 μ L をストアは、バキュロ ウイルス上清、洗浄バッファー、および溶出液の読み込み中に収集された列の通過など。HT1080 浄化プロセス (セクション 6 を参照) を評価するためにこれらのバキュロ ウイルスの分数に感染します。
- カラムの洗浄バッファーと洗浄バッファーで列をきれいに。最後に、線形 7.0 mL/分の流量で 5 CV 滅菌 20% エタノール水で列を洗い、4 ° C で保存
- 水、1 N 水酸化ナトリウムを水と再び 20% エタノール水 50.0 mL/min の線流速とクロマトグラフィー システムをきれいにし、20% エタノールでシステムを格納します。
5. バキュロ ウイルスの濃度
- オートクレーブを用いた遠心管を消毒済み。ティッシュ文化フードの各遠心チューブにバキュロ ウイルス上清の等しいボリュームを追加します。バランス チューブの重量を測定し、滅菌 PBS で遠心管の内容の重さを調整します。
- SW 32 Ti ローターのバケツを反対に超遠心機チューブのそれぞれを配置します。
- 80,000 × g で、超遠心機を実行4 ° C で 90 分
- ティッシュ文化フードの遠心管を開き、無菌バキュロ ウイルス ペレットを削除せず、液体を吸引します。
- 積極的に上下に 200 μ L 0.5% (w/巻) BSA を含む PBS でピペッティングによる各チューブのペレットを再懸濁します。
- クリオバイアル (バイアルあたり 50 に 100 μ L) に集中バキュロ ウイルスを転送し、-80 ° C で保存
6. バキュロ ウイルスの滴定
- 感染、前日は、トリパン ブルーとセルを青色に染色後、検定を用いた HT1080 細胞をカウントします。2 ml のダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) を含む 6 ウェル プレートのウェルあたりの種子 1 x 105 HT1080 細胞。種子いくつか追加井戸細胞感染の時に存在の正確な数を決定することができます。37 ° C、5% CO2でインキュベーターで培養します。
注:HT1080 細胞は、他のセル行16と比較するとヘパラン硫酸のより高いレベルを表現しており、滴定に使用されます。HT1080 細胞が付着、滴定はより簡単なより伝統的な Sf9 による滴定を使用する場合に比べて時間がかかる。 - 感染症の日に井戸からセルをカウントすることによってウェルあたりの細胞数を決定します。設定されていた脇カラム精製前とサンプル列の流れを通じて、洗浄、および溶出画分から、希薄化後の元バキュロ ウイルスを追加することによって、細胞に感染します。各サンプルの希釈と経験的バキュロ ウイルス感染粒子に基づいてボリュームを決定し、3 通の各ウェルに感染します。
- 感染後 2 日間は、興味の遺伝子の表現のための細胞を分析します。細胞を蛍光蛋白質 (例えばGFP)17を表する場合流れの cytometer を使用して分析できます。
- 細胞感染、希釈倍率、数式を使用してセルの蛍光蛋白質の割合の時に存在の数に基づいて価 (1 mL あたり感染単位) を計算: (蛍光タンパク質の感染 × 割合の中にセルの数陽性細胞 × 希釈倍率)/mL でバキュロ ウイルスのボリューム。
注:たとえば、感染症の時もあたりのセル数の合計が 1.2 × 105、蛍光タンパク質の割合は 5%、希釈倍率は 100、追加希薄バキュロ ウイルスの量は 10 μ L、力価は 6 × 107感染単位 (IU)/mL です。
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Representative Results
提示されたプロトコルは、フロー図 (図 1)。手順にはバクミド板の付着性文化、無血清培養、ヌクレアーゼ治療、遠心分離と濾過によって明確化以降の増幅でバキュロ ウイルスを生成する DNA と Sf9 細胞のトランスフェクションが含まれます超遠心法による濃度がヘパリン親和性クロマトグラフィーによる浄化が続きます。
後融解、Sf9 細胞を回復する、少なくとも 2 週間は必要し、指数関数的成長の段階に入る。Sf9 を積極的に成長して細胞付着性文化の DNA バクミド発現が。トランスフェクション、バキュロ ウイルスの封筒の糖蛋白質の発現後 2 日間は、gp64 が検出され、その後、バキュロ ウイルスの生産が開始される11。バキュロ ウイルスは複製有能なため、感染細胞の数は、成長媒体に分泌される新しく作り出されたバキュロ ウイルスと細胞の進行性感染症のため徐々 に増えます。バキュロ ウイルスを含む細胞培養上清は、セル全体の人口が感染したとトランスフェクション後 5 日間収穫です。この最初のウイルス上清は 1 (1) 株式の通路として指定されています。P1株は大きなプレートで Sf9 細胞の新しく種をまかれた付着性文化の後の感染に使用されます。セル全体の人口は、細胞変性効果 (図 2) と呼ばれる 5 日間で感染の兆候を示しています。2 番目の付着性細胞培養上清は、収穫され、P2銘柄に指定されています。Sf9 昆虫無血清細胞培養培地とシェーカーのフラスコの中の新鮮な追加 Sf9 細胞の継続的な感染を培養でバキュロ ウイルス上清をさらに増幅します。各感染症のサイクルの終わりには、細胞の大部分は細胞径の増加とバキュロ ウイルス感染の兆候がある人が死亡または分離の細胞変性効果を表示します。バキュロ ウイルス ストックは、適切なボリュームが (P3P4、...) を得られるまで順番に増幅されます。上清は低速遠心分離、精製・濃縮の以降のステップで使用される前に 0.45 μ m 膜濾過粘度を下げるためのヌクレアーゼで治療で Sf9 細胞から区切られます。
バキュロ ウイルスを浄化するには、感染 Sf9 細胞上清はヘパリンの列に読み込まれます。ヘパリン列は徐々 に厳密にバインドされたバキュロ ウイルスとゆるく縛られた蛋白質の汚染物で飽和状態になります。ヘパリン列は紫外線 (UV) 吸光度曲線まで汚染物質を除去する洗浄バッファーで洗浄 (280 nm) とベースラインに戻りが安定し、列から非連結コントロールとゆるく縛られた材料の除去を示します。バキュロ ウイルス粒子に対し強くヘパリン列にバインドします。したがって、列の洗浄バッファーで大量のウイルスは検出されません。ヘパリン バインド バキュロ ウイルス粒子は、1.5 M pH 8.0、10 倍希釈で塩化ナトリウムの isotonicity を達成し、ウイルスの不活性化を防ぐためにバッファーとの溶出されます。バキュロ ウイルス分数 (図 3) に相当する溶出時に蛋白の鋭いピークが観察されます。サンプルの読み込み、洗浄、精製した感染バキュロ ウイルス粒子のこのクロマトグラフィー プロトコル収量よりも 50% 回復で使用される溶出に最適化された条件。希釈培養上清は最大 500-fold 遠心濃縮さらに利回り純 25% 回復110.5 %bsa を含む PBS で策定します。
図 1.生産とバキュロ ウイルスの精製の概略図。Sf9 細胞がバクミド DNA をトランスフェクション細胞培養処理板にシードされます。バキュロ ウイルス上清は収穫し、付着性文化の新しい Sf9 細胞に感染するために使用します。その後、感染細胞は無血清培養で反映されます。バキュロ ウイルス上清はヌクレアーゼと扱われ、遠心分離、フィルターします。バキュロ ウイルスはヘパリン親和性クロマトグラフィーによる精製、バッファーで希釈した、超遠心法による無菌集中。最後に、バキュロ ウイルス上清は-80 ° C で保存します。(2016 年 Mol そこ方法臨床開発 2016; 図が Nasimuzzamanらから適応されているアクセス許可を持つ 3:16071)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.バキュロ ウイルスの細胞変性効果感染 Sf9 細胞。バキュロ ウイルス上清は感染 Sf9 細胞培養処理板に使われました。感染後 5 日間細胞は、倒立位相差顕微鏡で視覚化しました。A)コントロールとして感染 Sf9 細胞。B)バキュロ ウイルス感染 Sf9 細胞変性効果を示します。セルは、200 倍の倍率で表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.ヘパリン親和性クロマトグラフィーの中に流れを通じて感染バキュロ ウイルスの数。バキュロ ウイルス力価は、HT1080 細胞の感染によって推定されました。テスト サンプルが列スルー、洗浄と溶出液のなどを含みます。必要に応じて、サンプルが希釈されました。ライン (暗いダイヤモンド) は、各分画のバキュロ ウイルスの総感染単位 (IU) を示しています。列のサンプルの流れを洗浄バッファーの分数サイズ各管で 40 mL、溶出液各管内 10 mL であった。(2016 年 Mol そこ方法臨床開発 2016; 図が Nasimuzzamanらから適応されているアクセス許可を持つ 3:16071)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで提示されたプロトコルでは、Sf9 細胞懸濁培養におけるバキュロ ウイルスの生産とヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いたバキュロ ウイルスの精製をについて説明します。このプロトコルで使用されるパラメーターは収量を最大化し、感染バキュロ ウイルスの不活性化を最小限に抑えます。ここで提供されるプロトコルは、9他の人が達成したバキュロ ウイルス粒子のリカバリと比較して大幅に改善回復を示しています。
中枢神経系、肝臓、目、卵巣、前立腺、睾丸バキュロ ウイルス媒介性遺伝子配達5,6,7,8 の広いホストの範囲およびティッシュの親和性によりいくつかの研究を行った.バキュロウイルスベクター自殺遺伝子、癌抑制遺伝子、遺伝子の符号化の腫瘍特異的抗原は正常に臨床で行われているなどの治療遺伝子を含む動物は、18,19をモデル化します。バキュロ ウイルスは人間の細胞を変換することができます、ただしそれ昆虫細胞でのみ伝達できます、その結果、人間の受取人に危険をもたらすがないです。
バキュロ ウイルス昆虫細胞にトランスフェクション バクミド DNA の生産されています。バクミドの品質は高価バキュロ ウイルスの生産のために重要です。通常、時間の長い期間のため、冷蔵庫で保存されるより作りたてバクミドを実行します。Sf9 を積極的に成長して細胞が transfected 効率的に高価バキュロ ウイルスを作り出す。増幅段階では、懸濁培養細胞濃度を最適化することが重要だし、感染症のバキュロ ウイルス上清のボリュームが使用されます。セルにバキュロ ウイルス粒子の比が最適でない場合バキュロ ウイルスの収量が予想される (個人的な観察、MN) よりも低い可能性があります。
バキュロ ウイルス ヘパリン列に上清を読み込み中、列を通過することがありますウイルス粒子の通過を確認することが重要です。場合は、必要があります実行速度より低い列または列に上澄みの小さいボリュームを読み込む必要があります。バキュロ ウイルス上清中に存在の汚染物質のほとんどクロマトグラフィー実行の洗浄のステップ中に洗浄されます。ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の銀染色によりバキュロ ウイルスの純度を調べた-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) ゲルと電子顕微鏡的研究、当社精製バキュロいる質の良い12。
我々 は慎重に結合条件を最適化し、ポロス ヘパリン培地が優れて他のヘパリン メディア (例えば。HiTrap またはコロマントキャプト ヘパリン) バキュロ ウイルス粒子 (個人的な観察) を捕獲する能力。高いサンプル速度と容量でバキュロ ウイルスを結合するヘパリンの機能は大規模な製造プロセスの下流の処理時間を最小限に抑えるために重要です。バキュロ ウイルスのほかヘパリン媒体はまたヘパリンの親和性を持つ他の汚染タンパク質を連結します。低分子汚染のほとんどは、実行ヘパリン クロマトグラフィーの正接フローろ過 (TFF) の下流ステップを含む、回避できます。TFF は、製品20を集中する遠心分離する代わりとしても使用されます。
このプロトコルは、他のウイルスやヘパリンに親和性を持つ蛋白質の浄化のため使用することができます。ただし、洗うと溶出バッファー組成と流量の変更必要があります。
組換えタンパク質の生産は、まあ直接 unpurified バキュロ ウイルス上清を使用して動作します。したがって、原油バキュロ ウイルスは遺伝子組換えタンパク質生産のため使用できます。ただし、バキュロを生体内で遺伝子の転送用、またはワクチンとしてベクトルとして使用する場合、クロマトグラフィー、ゲルろ過、遠心など追加精製手順が純度、濃縮バキュロ ウイルスを取得する必要粒子、毒性、炎症および免疫反応を避けるためにプロデューサー細胞と培地由来不純物を最小限に抑えます。
結論としては、生産とすることがでくスケール アップ製造組換えタンパク質、ワクチン、遺伝子治療用ベクターのバキュロ ウイルスの精製のための単純なプロトコルを説明しました。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作品は一部で、スタートアップ資金援助によって支えシンシナティ小児研究財団 (CCRF) から m. n.、革新的なコア付与 (ICG) の下で健康の国民の協会の進めるトランスレーショナル科学センターでサポートされています。受賞番号 UL1 TR001425。 内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
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