Summary
الفئران المهندسة وراثيا نماذج مفيدة للتحقيق وآليات سرطان البروستاتا. نقدم هنا بروتوكولا لتحديد وتشريح البروستاتا الفصوص من ماوس الجهاز البولي التناسلي والتفريق بينهم على أساس في علم الأنسجة، وعزل والثقافة خلايا البروستاتا الأولية في المختبر الماغنيسيوم لتحليلات المتلقين للمعلومات.
Abstract
نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمس) تكون بمثابة نماذج قبل سريرية فعالة للتحقيق في معظم أنواع السرطانات البشرية، بما في ذلك سرطان البروستاتا (PCa). فهم التشريح وعلم الأنسجة البروستاتا الماوس مهم لكفاءة استخدام والتوصيف الصحيح لمثل هذه النماذج الحيوانية. وقد البروستاتا الماوس أربع متميزة أزواج من الفصوص، كل منها خصائصها. يوضح هذا المقال الأسلوب السليم للتشريح وتحديد الماوس الفصوص البروستاتا لتحليل الأمراض. بعد التشريح، خلايا البروستات يمكن كذلك مثقف في المختبر لفهم الميكانيكية. منذ الماوس خلايا البروستات الابتدائية تميل إلى فقدان خصائصها الطبيعية عندما مثقف في المختبر، ونحن مخطط هنا طريقة لعزل الخلايا وتنمو كالثقافات كروي ثلاثي الأبعاد، والتي فعالة للحفاظ على الفسيولوجية خصائص الخلايا. يمكن استخدام هذه الثقافات ثلاثي الأبعاد لتحليل مورفولوجيا الخلايا ومستويات السلوك في ظروف قرب الفسيولوجية، والتحقيق في تعديل وتعريب البروتينات الرئيسية وسبل المشاركة في تنمية وتطور المرض، ويبحث في ردود على العلاج بالعقاقير.
Introduction
ما فتئت تسعى الأوساط العلمية توضيح الآلية المعقدة للتنمية البشرية السرطان لعدة عقود. حين يبدأ تحديد اللاعبين الرئيسيين المحتملين وأهداف المخدرات مع خلايا المريض ودراسات الأنسجة، تطبيق متعدية الجنسيات مثل هذه النتائج غالباً ما يتطلب استخدام نماذج حيوانية قبل الإكلينيكية. استخدام الفئران المهندسة وراثيا نماذج (جيممس) للسرطانات البشرية نموذج ارتفع مطردا منذ إقامة "الماوس نماذج من البشر سرطانات الكونسورتيوم" (NCI-ممهكك)، لجنة الذي سعى إلى وصف وتوحيد الصفات المميزة للسرطان الماوس نماذج للعلماء في جميع أنحاء العالم1،2. نماذج الماوس تفي بالحاجة إلى الدراسات الميكانيكية في الدراسات ما قبل السريرية لمعظم أنواع السرطان، فهم في التنمية، والتقدم، استجابة للعلاج، واكتسبت مقاومة3.
سرطان البروستات هو السرطان الأكثر شيوعاً التي تحدث في الرجال، والتي تؤثر على الرجال أكثر من 160,000 كل سنة4. أشكال عدوانية من المرض تدعي عشرات آلاف أرواح كل عام. ومع ذلك، هو ما زالت غير مفهومة إليه تطور المرض. ينتج عن هذا نقص خطير في خيارات علاج فعال لسرطان البروستاتا المتقدم والمنتشر، كما يدل على ذلك ارتفاع معدل الوفيات في مرضى سرطان البروستاتا المتقدم4. ومن ثم، هناك حاجة متزايدة لنماذج ما قبل السريرية لدراسة سرطان البروستاتا. ومع ذلك، نظراً للخلافات المتأصلة بين الماوس والبروستاتا البشرية، النمذجة لسرطان البروستاتا في جيمس لم يحظ شعبية حتى تطبيق نظام "التصنيف بار هاربور" في عام 2004، الذي أوجز تغييرات نسيجية في الماوس البروستاتا عند التلاعب بالجينات وتحديد التغيرات الورمية، وعلاقتها بمراحل تطور السرطان في البشر5. من الخصائص الهامة للبروستاتا الماوس التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند دراسة أي نموذج جيمم البروستاتا هو وجود أربع متميزة أزواج من الفصوص: الأمامي والجانبي والبطني والظهريه. يقدم الفصوص اختلافات كبيرة في الأنسجة والجينات نمط التعبير6. يمكن أن يختلف نمط التعبير البروتين بروباسين بين الفصوص في الشباب بعد سن البلوغ الفئران7، التي يجب مراعاتها منذ معظمها صممت النماذج المستندة إلى لجنة المساواة العرقية جيمم مروج المستندة إلى بروباسين باستخدام استدعاء Pb-Cre47. الاختلافات المكانية والزمانية الناتجة في التعبير لجنة المساواة العرقية غالباً ما تؤدي إلى الاختلافات في مواعيد بدء وتطور الورم، فضلا عن الاختلافات في التغيرات الورمية بين الفصوص. ومن ثم، فمن المهم مراعاة لمثل هذه الخلافات أثناء دراسة التنمية ورم في البروستاتا جيمس، والفصوص الفردية قد تحتاج إلى تقييم كل على حدة لتحقيق النتائج استنساخه. ويصف الجزء الأول من هذه المقالة الأساليب المناسبة تشريح البروستاتا ماوس، وتحديد وفصل كل الفص والاعتراف بالفروق في غذائها الفصوص.
بينما تحليل نمو الأورام والأنسجة يمكن أن توفر أفكاراً قيمة في تطوير الورم، أنها لا توفر الكثير من المعلومات عن الآليات الجزيئية. دراسة إليه الورم التنمية والتقدم وغالباً مفيدة لتحليل الخلايا السرطانية في المختبر. تم اقتراح عدة أساليب على مر السنوات التي تنطوي على الثقافات لهذه الخلايا، بما في ذلك تعليق الثقافات والثقافات 3D8 ، وفي الآونة الأخيرة، الثقافات 2D العادية9. بينما يؤدي معظم هذه الأساليب في معدلات البقاء على قيد الحياة وانتشار الخلايا جيدة، ثقافات 3D توفر بيئة الأقرب إلى الظروف الفسيولوجية. في الثقافات 3D أو كروي نمت في مصفوفة خارج الخلية غشاء الطابق السفلي (ECM)، والخلايا لومينال متمايزة تماما عادة ما يكون معدل بقاء منخفضة جداً؛ الخلايا القاعدية والوسيطة (معظمها الخلايا الجذعية) غير قادرة على نشر وإنتاج مجموعات الخلية تسمى الماغنيسيوم10. وهذا يجعلها مناسبة لدراسة سرطان منذ سرطان طلائي يعتقد أنها تنشأ من الخلايا الجذعية (المعروفة شعبيا باسم الخلايا الجذعية السرطانية)11. ويصف الجزء الثاني من هذا البروتوكول طريقة لاستزراع خلايا البروستات الماوس في الثقافات 3D. يمكن استخدامها في المجالات الناتجة عن ذلك لعدة أنواع من التحليلات المتلقين للمعلومات، بما في ذلك دراسة مورفولوجية أورجانويد والسلوك بخلية يعيش التصوير، الفلورة تلطيخ للبروتينات المختلفة، ودراسة الردود على العلاج الكيميائي العلاجات.
عموما، والهدف من هذا البروتوكول بيان الأساليب المثلى لاستخدام نماذج الماوس في سرطان البروستاتا بوصف تقنيات التشريح والتشريح البروستاتا الماوس وتجهيز الأنسجة للثقافات كروي وتحليلها في المختبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب الماوس الموصوفة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في البروتوكولات وافق IACUC المؤسسي في جامعة ولاية نيويورك شمال ولاية الجامعة الطبية.
1-تشريح الجهاز البولي التناسلي (UGS)
ملاحظة: يتم عرض التخطيطي في الشكل 1.
- Euthanize ماوس C57BL/6 ذكور عمره 3 أشهر باستخدام أسلوب القتل الرحيم استنشاق أول أكسيد الكربون2 أو تقنية أخرى تمت الموافقة عليها.
ملاحظة: الفئران تتراوح أعمارهم ما بين 3 و 12 شهرا يمكن أن تستخدم بنجاح لهذه التجربة. الفئران الأكبر سنا (> 6 أشهر) سوف يكون على الأرجح المزيد من الدهون حول UGS، التي سوف تحتاج إلى أن يتم مسح. من الصعب غالباً تحديد وفصل الفصوص في الفئران الذين تقل أعمارهم عن 3 أشهر. يمكن استخدام سلالات أخرى للتجربة، كذلك. - ضع الماوس على ظهرها وتأمين الساقين استخدام دبابيس بحيث يتم عرضها على الجانب البطني للحيوان.
- رش الإيثانول 70% في البطن للماوس والقضاء عليها نظيفة.
ملاحظة: حلق شعر البطن قبل تشريح غير مطلوب. - رفع الجلد من البطن، جنبا إلى جنب مع طبقة العضلات، مع زوج من الملقط حادة المتوسطة وشق على شكل Y مقلوب في البطن باستخدام مقص.
- أولاً، إجراء شق مستقيم مع زوج من مقص حاد من فوق القضيب للقص (الشكل 2a).
- قطع من قاعدة للشق نحو كل إصبع، حتى الفخذين (الشكل 2). أمثال مرة أخرى الجلد على كلا الجانبين، وفي الجزء السفلي لعرض منطقة البطن بكاملها (الشكل 2 ج-ه).
ملاحظة: يختلف حجم قطع تعتمد على الماوس العمر والحجم. حجم شق مستقيم الأولية قد تتراوح بين 1.5 إلى 4 سم، تبعاً لحجم الماوس.
- حرك الأجهزة الأخرى لفضح UGS. رفع ونقل الأمعاء البنى والأصفر (الشكل 2 واو). التقاط منصات الدهون البطن (غير شفاف أبيض الاسفنجية الأنسجة) مع الملقط ونقلها إلى الجانبين (الشكل 2 ز).
ملاحظة: UGS تتألف من الحويصلات ومجرى البول والبروستاتا، والقناة deferens (الاسهر) والمثانة. يمكن التعرف عليه بزوج مميزة من كامد الأقواس نصف دائري أبيض (وهي الحويصلات)، مع الكيس المثانة مملوءة بسائل يعلق على القاعدة. الأنسجة شفافة يقع الحق بموجب الحويصلات من البروستات. - تحديد موقع في UGS وإيمانا راسخا عقد المثانة البولية مع الملقط حادة، ورفع UGS كامل صعودا من البطن الماوس.
ملاحظة: إذا كانت المثانة ممتلئة، استنزاف أولاً مع حقنه صغيرة لتوفير أفضل قبضة الملقط والحد من خطر تمزيق المثانة. - الاستمرار في سحب ما يصل على المثانة، الشريحة مقص تحت المثانة والبروستاتا وصولاً إلى العمود الفقري، وجعل قطع. قطع طريق أية اتصالات المتبقية إلى تجويف البطن (الشكل 2 ح و 2 طاء). أن يكون حريصا على عدم قطع قريبة جداً إلى UGS لتجنب قطع عرضي من خلال أي أنسجة البروستاتا.
ملاحظة: حين جعل القطع تحت UGS، المقص ينبغي إدراج وصولاً إلى الجزء الخلفي الماوس، حيث أن القطع يستقر العمود الفقري، وكذلك. ويؤدي هذا الأسلوب في قطع جميع الصلات القائمة بين UGS وتجويف البطن في قصاصة واحدة، تخفيض الوقت اللازم لاستخراج النسيج من الماوس تقريبا. - إزالة UGS ووضعه في 2-6 مل (ما يكفي لتغطية الأنسجة) الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة (دميم، الجلوكوز عالية) في 6 سم طبق بتري (الرقم 2j وك 2) ونقلها إلى مجهر تشريح (10 X التكبير).
ملاحظة: تغيير الوسائط تشريح كما هو مطلوب في الخطوات المتبقية.
2-تشريح البروستات
- قم بمسح جميع الدهون من كلا الجانبين الظهري والبطني مع زوج من غرامة ملقط ومقص ميكروديسيكشن (الشكل 3a). استخدام الأدوات الجراحية مماثلة لبقية البروتوكول التشريح.
ملاحظة: الدهون هو كثيرا ما تتداخل تداخلاً وثيقا مع UGS (يمكن تحديد من خلال مظهره الاسفنجية البيضاء)؛ ومن ثم، يجب إجراء هذه الخطوة بعناية لتجنب القطع بطريق الخطأ إيقاف أي أنسجة البروستاتا. يمكن أن يستغرق مدة تصل إلى 10-15 دقيقة لمسح جميع الدهون. - عقد وسحب المثانة مع الملقط وقص في القاعدة مع المقص (الشكل 3b).
- ضع الجانب البطني الأنسجة المتبقية أعلى. عقد واحد القناة deferens مع الملقط، تتبع ذلك إلى القاعدة مع مقص، وقص عليه (الشكل 3 جيم)، ثم كرر على الجانب الآخر. إزالة deferens القناة، الآن تاركين وراءهم البروستاتا (شفافة وفيرمينوس)، الحويصلات (كامد وأبيض، نصف دائري)، والإحليل (الأنبوب الأحمر الوردي ومبهمة) (الشكل 3d و 3e).
- إدراج الملقط بين القوس الداخلي من الحويصلات وأنسجة البروستاتا الفصوص الأمامية. حدق بعيداً في الحويصلات والبروستاتا وقص أي النسيج الضام كاللازمة (3f الشكل). تتبع الحويصلات إلى قاعدتهم في مجرى البول وإزالتها (الشكل 3 ز وح 3). كن حذراً لا للثقب لهم.
- الشروع في تشريح بها الفصوص البروستاتا الفردية.
3. تشريح الإجمالي ميكروديسيكشن الفص البروستاتا والفردية (الشكلان 3i-n، الرقم 4)
- الوجه الأنسجة مع زوج من الملقط حادة حيث أنه يواجه الجانب الظهرية، عرض الفصوص الظهرية، الذي سوف تشبه أجنحة الفراشة.
- جمع الفصوص الظهرية بالضغط الفص مع الملقط والقص في القاعدة مع المقص (3j الشكل).
- اقلب الأنسجة المتبقية إلى الجانب البطني.
- جمع الفصوص الجانبية، وصغيرة وعادة التفاف مجرى البول من ناحية، تقع بين الفصوص الأمامية والبطني والظهريه (الشكل 3 ك).
- بعد ذلك، جمع الفصوص البطني، التي هي أكبر من الفصوص الجانبية وتكمن في مجرى البول بطنيا (الشكل 3 لتر).
- الماضي، حصاد الفصوص الأمامية، أكبر من الأربعة، وخفض والتخلص من مجرى البول (الشكل 3 م).
- عملية قطع الأنسجة وفقا للاحتياجات التجريبية. انتقل إلى القسم 4 للأنسجة، أو إلى الباب 5 لثقافة كروي.
4-الفص تحديد الهوية ومورفولوجيا من الهيماتوكسيلين والشرائح ويوزين الملون
- إصلاح أنسجة البروستاتا، وتضمين ذلك في البارافين. المضي قدما في تلطيخ الشرائح والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) لعرض وتحديد الفروق في الفصوص البروستاتا استناداً إلى علم الأنسجة، باستخدام خصائص أوجزها أوليفيرا وآخرون. 12 (الشكل 5).
5-تجهيز الأنسجة للثقافة 3D10
ملاحظة: هذا هو المبين في الشكل 6.
- المضي قدما في استزراع الفصوص كله البروستاتا أو الفردية وفقا لاحتياجات التجريبية. نقل أنسجة البروستاتا لطبق 10 سم تحتوي على 2-3 مل دميم. مع مشرط، فرم الأنابيب البروستات ناعما بالتساوي قدر الإمكان تحت مجهر التشريح.
- متابعة تنفيذ الخطوات المتبقية تحت غطاء زراعة الأنسجة، تحت ظروف معقمة.
- نقل قطع الأنسجة جنبا إلى جنب مع دميم إلى أنبوب 15 مل وزيادة الحجم لمل 9 مع دميم. إضافة 1 مل من 10 x كولاجيناز حل الأسهم إلى خليط دميم-الأنسجة ودوامه لمزيج.
ملاحظة: حل الأسهم كولاجيناز 10 ملغ/مل في المتوسط معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي)، ويكون التركيز النهائي في أنبوب 15 مل 1 ملغ/مل. - ضع الأنبوب على شاكر إصدار أو أنبوب المدورة ح 2 في 37 درجة مئوية، كولاجيناز للحط من المصفوفة خارج الخلية.
- الطرد المركزي الأنبوب في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في 2 مل من الحارة 0.05% التربسين أدتا تنشق التصاقات خلية خلية والخلية-مصفوفة. نقل الأنبوب إلى 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: إذا قطع الأنسجة كبيرة جداً مزيج جيد، قص طرف الماصة مع شفرة حلاقة لجعل تتحمل أوسع. - تفكيك أي كتل الأنسجة بيبيتينج مع ماصة P1000 8-10 مرات، ثم تكرار مع ماصة P200.
- تحييد التربسين مع 3 مل دميم كاملة. إضافة 500 يو من دنيز الأول ومزيج جيد.
- تمرير من خلال حقنه 5 مل 5-10 مرات مع إبرة 18 جرام. ثم يمر عبر 5 مرات بإبرة 20 غ.
- كرر الخطوات من 4-8 مرة أخرى إذا كان الحل لا يزال يحتوي على أجزاء كبيرة من الأنسجة.
- وضع التصفية تعليق خلية من خلال عامل تصفية 40 ميكرومتر في أنبوب 50 مل. شطف الأنبوب 15 مل مع 5 مل دميم وتمر عبر نفس عامل التصفية. كرر الشطف.
- تجاهل عامل التصفية والطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على التدفق عبر في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6-طلاء واستزراع الخلايا
- ريسوسبيند بيليه في 0.5 مل من كامل "البروستاتا الظهارية الخلية النمو المتوسطة" (بريجم). حساب كثافة الخلية باستخدام عداد الخلية أو هيموسيتوميتير، وتمييع الخلايا إلى 5 × 105 خلايا/مل في بريجم كاملة.
ملاحظة: يمكن أن تتراوح الغلة من البروستاتا كلها ماوس عمره 3 أشهر من 3 × 105-106 خلايا. ومن ثم فمن المهم في البداية ريسوسبيند بيليه في لا يزيد عن 0.5 مل بريجم (كما ذكر أعلاه) حيث أن كثافة الخلايا المطلوب يمكن أن يتحقق، حتى مع انخفاض العائد. - ميكس حجم المطلوب من الخلايا التي تحتوي على الغشاء السفلي ECM في نسبة حجم (60% الغشاء ECM و 40% تعليق خلية) 2:3 ولوحة في لوحة متعددة جيدا أو شريحة الدائرة وفقا لاحتياجات التجريبية.
ملاحظة: إيمونوستينينج، لوحة على ألواح الزجاج السفلي أو شرائح الدائرة، وتغطي كامل جيدا أو الأوسط من البئر. لوحة حول حافة البئر إذا عد أورجانويدس الناجمة عن ذلك، أو لوحة قطرات عدة في جميع أنحاء البئر إذا كان الطلاء أعلى وحدات التخزين. أن تضع في اعتبارها عدم انتشار أنها سميكة جداً أو ضعيفة جداً. لوحة على الأقل 100 ميليلتر خليط خلايا مصفوفة كل 1 سم2 من طلاء المنطقة؛ على سبيل المثال، في شريحة دائرة مع 2 سم2-المساحة جيدا، وينبغي أن يكون مطلي 200 ميليلتر من خليط مصفوفة-الخلية التي تحتوي على 5 × 104 خلايا. - نقل اللوحة/الشريحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2 مدة 30 دقيقة للغشاء ECM ترسيخ. ثم أضف بريجم كاملة المعالجون مسبقاً لتغطية البئر، مع الحرص على عدم تعكير التوصيل الغشاء إدارة المحتوى في المؤسسة.
- إزالة نصف من وسائط الإعلام، وإضافة وسائط جديدة كل 2-3 أيام. تنمو الماغنيسيوم لمدة 5-10 أيام.
- المضي قدما في الحصاد (الخطوة 7)، إيمونوستاينينج (الخطوة 8)، و/أو التصوير للتطبيقات المتلقين للمعلومات.
7-الحصاد في المجالات
- حصاد المجالات، نضح وسائط الإعلام بعناية دون إزعاج التوصيل جل الغشاء إدارة المحتوى في المؤسسة وإضافة 1 مل من محلول ديسباسي 1 ملغ/مل في بريجم الواحد 100 ميليلتر من الغشاء إدارة المحتوى في المؤسسة.
ملاحظة: أنه من الأسهل لحصاد الماغنيسيوم إذا كانوا هم مطلي في منتصف البئر أو الحافة (بدلاً من تغطية البئر كله)، التأكد من أنه يمكن إضافة كمية كافية من الحل ديسباسي إلى البئر. - كشط الجزء السفلي من اللوحة مع مكشطة خلية رفع قبالة هلام الغشاء ECM في الحل ديسباسي-بريجم.
- ماصة الحل الكامل صعودا وهبوطاً مرة واحدة مع مجموعة واسعة تتحمل 1000 ميليلتر ماصة تلميح أو ماصة 5 مل لتفريق المكونات جل إلى أجزاء أصغر.
ملاحظة: قطع غيض من تلميح ماصة 1000 ميليلتر مع شفرة حلاقة جعل تلميح تتحمل على نطاق واسع. - احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ح 1-2 حتى الغشاء ECM قد حلت تماما.
ملاحظة: هذا يمكن ضمانها بالتفتيش البصري للجزء السفلي جيدا بينما إمالة لوحة للتأكد من أن يظل لا قطع أكثر من جيل. - جمع تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل.
- الطرد المركزي المجالات في ز 250 x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ومتابعة طلبات المتلقين للمعلومات.
8-إيمونوستينينج من الميادين13
ملاحظة: بعد قد نمت الماغنيسيوم للمبلغ المطلوب من الوقت، يمكن حله الغشاء إدارة المحتوى في المؤسسة ومجالات يمكن أن تكون الملون كما هو موضح في كوليسينو et al. 13.
- بإيجاز، شطف الثقافات مع برنامج تلفزيوني وإضافة 4% بارافورمالدهيد (PFA) مباشرة إلى سد جل الغشاء إدارة المحتوى في المؤسسة. احتضان لمدة 30-90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع المصافحة ببطء، حتى الغشاء ECM تماما يذوب، الاستعاضة عن منهاج عمل جديدة كل 30 دقيقة.
ملاحظة: سوف تذوب المكونات جل منهاج عمل بيجين وإصلاح الماغنيسيوم أثناء هذه العملية. - وبعد ذلك، يغسل مع برنامج تلفزيوني 3 مرات وإضافة كلوريد الأمونيوم 50 ملم لمدة 10 دقائق إخماد أي أوتوفلوريسسينسي من منهاج عمل بيجين. كرر يغسل 3 مع برنامج تلفزيوني.
- بيرميبيليزي مع المنظفات غير الأيونية 0.1% لمدة 5 دقائق وكتلة مع ببسات (برنامج تلفزيوني، جيش صرب البوسنة 1%، 0.5% Triton X-100) لمدة 30 دقيقة.
- احتضان مع جسم الأولية في ببسات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، تليها يغسل 3 مع ببسات وجسم ثانوية في ببسات ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
- كرر يغسل مع ببسات ووصمة عار مع DAPI وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، إذا رغبت في ذلك. أغسل مرات 3 أو أكثر مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة برنامج تلفزيوني مع 200 ملم 1، 4-ديازابيسيكلو [2.2.2] أوكتان (دابكو) أنتيفادي كاشف والشروع في التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن التعرف على الفصوص البروستاتا الماوس وتشريح استخدام مواقعها بالنسبة للحويصلات ومجرى البول. البروستاتا الماوس يتكون من 4 أزواج من الفصوص الواقعة دورسالي وبطنيا إلى الحويصلات ومجرى البول. الشكل 4a و 4b (أعلى) إظهار آراء الظهرية والبطني البروستاتا سليمة، جنبا إلى جنب مع الحويصلات ومجرى البول. تظهر لوحات السفلي (الشكل 4 ج ود 4) الفصوص المختلفة المحددة للهوية. يمكن فصل الفصوص من الفئران صغيرات 3 أشهر.
الفصوص البروستاتا مختلفة تختلف إلى حد كبير في علم الأنسجة (الشكل 5). جميع الفصوص البروستاتا الماوس تتكون من العديد من ملفات تعريف الغدة تتألف من التجويف محاطة بالخلايا الظهارية الافرازية؛ ومع ذلك، شكل الفصوص، منظمة للخلايا، وطبيعة إفراز تختلف من الفص للفص. تحديد خصائص من ح & الماوس الملون ه وقد أوجزت البروستاتا كفاءة طريق أوليفيرا et al. 12، بإيجاز هنا. وقد الفصوص الأمامية acini متوسطة إلى كبيرة مع إينفولدينجس المتكرر وإفراز اليوزيني بشدة. تظهر الفصوص الظهرية مثل الأمامي مع إفراز اليوزيني لكن acini أصغر بكثير وأقل إينفولدينجس. الفصوص الجانبية قد أسيني الصغيرة والكبيرة، مع حدود لومينال شقة مميزة وإفراز اليوزيني. الفصوص البطني هيكلياً مثل الفصوص الجانبية، أيضا مع حدود شقة لومينال، لكن إفراز لومينال غير اليوزيني بالي فريدة من نوعها.
خلايا البروستات الماوس يمكن مثقف الماغنيسيوم في غشاء الطابق السفلي ECM ويحمل خصائص مثل الظهارية. ويرد هذا تخطيطي في الشكل 6. الخلايا بمعزل عن البروستاتا الماوس كما هو موضح أعلاه ومثقف في غشاء الطابق السفلي إدارة المحتوى في المؤسسة. تبدأ الخلايا المتزايد في أورجانويدس في أقرب وقت 4 أيام للثقافة. الشكل 7 ويبين (أعلى) حقول الممثل من الثقافات عمره 8 أيام تبين أورجانويدس في غشاء الطابق السفلي ECM. في ظل الظروف المذكورة أعلاه الثقافة، تنمو معظم الخلايا في مجالات الصلب، مع كسر بعد تجويف جزئية أو كاملة داخل. عادة ما تكون هذه أورجانويدس التشكل حتى كروية. كانت تحصد أورجانويدس وإيمونوستينيد كما هو موضح في كوليسينو et al. 13-يبين الشكل 7 (أسفل اللوحة) أورجانويد دون تجويف (يسار) ومع تجويف (يمين)، الملون مع فالويدين (العلامة واكتين، الأخضر) و DAPI (نواة، الأزرق). بيتا-كاتينين علامة التصاق خلية أعربت بقوة في واجهات الخلية في الخلايا الظهارية. يوضح الشكل 8 بيتا-كاتينين قوية تلطيخ (الأخضر) في تقاطعات خلية خلية في الماغنيسيوم تعريب يشترك مع F-أكتين (أحمر). الماغنيسيوم أيضا التعبير عن سيتوكيراتين 5، سيتوكيراتين 8، p63، والبروتينات مستقبلات الاندروجين، والتي تقدم ما يثبت أن الماغنيسيوم الفعل مشتقة من خلايا المنشأ في البروستاتا10.
رقم 1: مخطط انسيابي التخطيطي إظهار تشريح الجهاز البولي التناسلي الماوس والعزلة من البروستات. الرسم البياني لوصف الخطوات البروتوكول في الفرعين 1-2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تشريح للماوس UGS- الصور خطوة بخطوة من التشريح UGS من ماوس عمره 3 أشهر: (وب) جعل الشقوق، (ج-ه) سحب الجلد للكشف عن منطقة البطن، تحويل (و) الأمعاء، (ز) نقل منصات الدهون البطن، (حاء وطاء) استخراج UGS من تجويف البطن، (ي) UGS المستخرجة، (ك) UGS المستخرجة مع مختلف الأعضاء والأنسجة علامة على النحو التالي: SV (أصفر) = الحويصلات؛ ف (أحمر) = البروستاتا؛ و (أرجواني) = الدهون؛ V (أزرق فاتح) = الاسهر؛ وب (الأخضر) = المثانة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تشريح البروستات الماوس. صور خطوة بخطوة لتشريح البروستات الماوس من UGS: (أ) إزالة الدهون، (ب) إزالة المثانة البولية، (ج) إزالة الاسهر، (د) البطني ويرى البروستاتا بمجرى البول، رأي (ه) الظهرية البروستاتا بمجرى البول، (وح) إزالة الحويصلات، (ط) عرض البطني من تشريح (ي) البروستاتا، الفص الظهرية، (ك) تشريح فص جانبي، تشريح (l) الفص البطني، (م) تشريح فص أمامي، والفصوص (ن) تشريح البروستاتا: الأمامي = AP، الظهرية = DP، الأفقي = ليرة لبنانية والبطني = نائب الرئيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تشريح الفصوص البروستاتا الماوس. صور الممثل من عمره 3 أشهر الماوس UGS بعد إزالة الدهون والمثانة، والاسهر. صور تظهر الفصوص البروستاتا مع الحويصلات ومجرى البول، مع الظهرية (وج) وآراء البطني (ب ود). أعلى لوحات (وب) تظهر الصور لم يمسها، بينما تظهر أسفل لوحات (c و d) الفصوص المبينة في الزرقاء (الظهرية)، أحمر اللون الأصفر (الأمامي)، (البطني)، والأخضر (الجانبي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الفصوص البروستاتا مختلفة تتفاوت تفاوتاً كبيرا في علم الأنسجة. هنا هو ح & صورة كاملة البروستاتا الملون ه تبين الحويصلات، ومجرى البول، والفصوص البروستات أربعة. يرد الفصوص باللون البرتقالي (الأمامي)، الأخضر (الظهرية)، الأزرق (الجانبي)، والأسود (البطني). داخلي: صور الممثل من كل فلقة، المتخذة في إطار هدف 10 x. يمثل الشريط مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: مخطط انسيابي التخطيطي إظهار الهضم البروستاتا والثقافات اللاحقة كروي. الرسم البياني للخطوات البروتوكول هو موضح في المقاطع 5 و 6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: تنمو خلايا البروستات في الماغنيسيوم كروية حتى مع أو بدون تجويف. وكان مثقف أنسجة البروستاتا حصادها من البرية من نوع ماوس عمره 3 أشهر وفقا للبروتوكول. تم تصوير الثقافات على تصوير لوحة تحت هدف X 4، في ثقافة ما بعد 8 أيام، عرض تشكيل الماغنيسيوم (أعلى). الماغنيسيوم حصادها والملون كما هو موضح في البروتوكول مع فلورسنت مترافق صبغ فالويدين واكتين (الأخضر) و DAPI لنوى (الأزرق)، ثم تصويرها على قرص غزل مجهر [كنفوكل] تحت 40 × المياه الهدف (أسفل). كروي على اليمين يظهر دليلاً التجويف. تمثل أشرطة مقياس 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: أورجانويدس البروستاتا الماوس إظهار الترجمة هالة من بيتا-كاتينين. كانت الملون الماغنيسيوم حصادها من الثقافات 3D عمره 6 أيام, استخدام جسم الأولية ضد بيتا-كاتينين وجسم ثانوي مترافق صبغة فلورسنت، والمصورة على قرص غزل مجهر [كنفوكل] تحت 40 × الهدف المياه. وتبين الصور الممثل immunostaining بيتا-كاتينين (الأخضر، الأيسر)، واكتين (الأحمر، الوسط)، و DAPI (أزرق). اللوحة اليسرى يظهر جميع القنوات 3 دمج. يمثل الشريط مقياس 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتلخص هذه الورقة طرق تشريح البروستات الماوس وتحديد الهوية من الفصوص الفردية. ووصف أيضا هو بروتوكول لاستزراع خلايا البروستات الماوس في ثقافة 3D للتحليل في المختبر .
خطوة حاسمة في تشريح البروتوكول هو حصاد UGS كامل من الماوس (1) وفصل الأجهزة الفردية تحت مجهر تشريح. أنسجة البروستاتا صغير جداً وتحيط بها بقية UGS؛ وهكذا، فإنه من المستحيل عمليا حصاد الجهاز مباشرة من تجويف الجسم لدى شراء جميع أزواج أربعة من الفصوص سليمة. ومن ثم فمن المهم أن حصاد UGS كامل من الماوس ومن ثم الانتقال لاستخراج البروستاتا. من المهم أيضا في هذا البروتوكول (2) نفذ الخطوات في الوقت مناسب ولكن يظل الدقيق. الوقت جوهر المسألة أثناء تشريح للتقليل من تدهور الأنسجة. تقنية معينة الموصوفة هنا لاستخراج UGS من الماوس هو أسرع مقارنة بالبدائل، وينصح بشدة. عادة ما يستغرق الإجراء عزلة كاملة تشريح والفص 35-40 دقيقة، التي يمكن أن تخفض إلى 25 دقيقة مع مزيد من الممارسة. الجزء الأكثر تحديا للتشريح هو تنظيف الدهون المحيطة UGS، الذي يأخذ جزء كبير من وقت تشريح الكلي. يجب إزالة الدهون دقة للتأكد من أن أيا من ذلك لا يزال مع البروستاتا، ولكن من المهم أن نكون حذرين للغاية ليس تفقد أي أنسجة البروستاتا في العملية بطريق الخطأ. هو خطوة حاسمة أخرى (3) لا إزالة مجرى البول قبل فصل الفصوص البروستاتا. مجرى البول يشكل أساسا القاعدة التي جميع أزواج أربعة من البروستات ويتم ترتيب الفصوص. فمن الأسهل للتعرف الفصوص إذا كانت لا تزال متصلة بمجرى البول، استناداً على التوزيع المكاني فيما يتعلق بمجرى البول.
خطوة حاسمة في البروتوكول ثقافة كروي (1) تنميق الأنسجة شكل جيد. تنميق أنسجة البروستاتا مع مشرط خطوة شاقة، لا سيما وأن أنسجة البروستاتا بطابع لزجة. ومع ذلك، تنميق الأنسجة صغيرة بقدر الإمكان ضروري للحصول على أقصى غلة. هو خطوة أساسية أخرى (2) بيبيتينج بعد تريبسينيزيشن ومروراً بحقن الأحجام المحددة بوستنيوتراليزيشن. كلا من هذه الخطوات يجب تنفيذها بشكل صحيح والمتكررة، إذا لزم الأمر، لتحقيق العائد الأمثل الخلية. أخيرا، من المهم (3) لا لوحة الغشاء ECM سميكة جداً أو ضعيفة جداً. إذا كان هو مطلي الغشاء ECM رقيقة جداً (أي.، أقل من 100 ميليلتر/سم2)، لن يتم تكبير الخلايا في أورجانويدس السليم في وسط البئر، حيث سيتم الهلام نحافة. طلاء سميكة جداً فإنه (أي.، أكثر من 250 ميليلتر/سم2) سيؤدي إلى ECM الغشاء ليس ترسيخ بشكل صحيح وانزلاق قبالة خلال تغييرات الوسائط. الطلاء في منتصف البئر ستساعد على تحقيق أكثر حتى جل سمك.
يمكن تعديل البروتوكول وصف قليلاً وفقا للاحتياجات التجريبية. تتطلب تقنية لاستخراج UGS من تجويف البطن من أحكام قبضتهم على المثانة البولية مع الملقط. في حالة المثانة ممتلئة جداً، من المهم أن استنزاف المثانة مع حقنه 1 مل ورقيقة (ز 26 أو ما شابه) إبرة، لضمان قبضة سليم قبل البدء في استخراج الأنسجة. ينبغي أن تظل الأنسجة رطبة مع برنامج تلفزيوني أو دميم طوال عملية التشريح. استخدام دميم المفضل إذا كان النسيج الذهاب إلى استخدامها للثقافات كروي. يمكن فرز تعليق خلية المقطوع بالتدفق الخلوي لعزل السكان الفرعية من الخلايا قبل الطلاء، إذا رغبت في ذلك، كما هو موضح وكاكس et al. 10.
النسيجي خصائص الفصوص البروستاتا المختلفة المبينة في هذا البروتوكول، وواحد ينبغي أن تكون قادرة على تحديد الفصوص في أنسجة البروستاتا سليمة باتباع هذه المبادئ التوجيهية. ومع ذلك، هناك بعض القيود العملية. في حالات فرط تنسج أو الأورام العدوانية، تعطل مورفولوجية الظهارية، التي يمكن أن تجعل من كبير صعوبة التمييز بين الفصوص استناداً إلى تلطيخ ح & ه. في مثل هذه الحالات، فصل الفصوص (كما هو مبين في هذا البروتوكول) قبل التضمين وتلطيخ ضروري إذا كانت هناك حاجة إلى معلومات خاصة بالفص. حتى في الأنسجة السليمة، من الضروري غالباً لتحليل الفصوص على حدة نظراً لأنها تقدم تباين واسع في علم التشريح وعلم الأنسجة ويكون التعبير التفاضلية تواقيع6. ومع ذلك، قد ناقش متعدية الجنسيات أهمية فصل الفصوص في البروستاتا الماوس، منذ البروستاتا البشرية لا ينقسم إلى الفصوص. على الرغم من ذلك، يظل الماوس أفضل نموذج لدراسة محكمة التحكيم الدائمة في فيفو، وكانت عدة نماذج الماوس المتقدمة14،15. خاصة هو الأسلوب الثقافة 3D تقنية رئيسية التي يمكن استخدامها للتحقيق وآليات للمرض. بيد أن التحذير واحدة من الأسلوب ثقافة كروي ينشأ من نمط التعبير التفاضلية من بروباسين، وهو مروج شائعة الاستخدام ل recombinase لجنة المساواة العرقية في نماذج الماوس سرطان البروستاتا. يتم تنشيط مروج بروباسين غالباً في الخلايا لومينال والمتوسط ولكن ليس في الخلايا القاعدية7. تعزيز الثقافة الشروط الموضحة هنا تشكيل كروي غالبيتها من الخلايا القاعدية والوسيطة، ولكن ليس من الخلايا لومينال10. ومن ثم إنتاج الثقافات الناتجة عن ذلك الواقع خليط الماغنيسيوم معربا عن لجنة المساواة العرقية، والإعراب عن عدم Cre (أي.، خليط الماغنيسيوم عنصر التحكم والمغلوب). نتيجة لذلك أثناء التحليل، من المهم أن إيمونوستين لبروتين الفائدة لتحديد أورجانويدس المغلوب واستخلاص استنتاجات بشأن السلوك أورجانويد استناداً إلى الجينات تدق الرافضة.
وتكمن أهمية هذه الأساليب في مجال التطبيقات متعددة الأوجه لاستخدام جيمس في دراسات سرطان البروستاتا. قد تشريح الطريقة الموضحة بالتفصيل الخطوات التي سوف تمكن الباحثين من استخراج البروستاتا أسرع وأكثر فعالية. تسلسل عملية تشريح يهدف إلى ضمان أن الفصوص الفردية يمكن تحديدها واستخراجها، حتى من جانب الذين يملكون خبرة ضئيلة في تشريح البروستاتا. يمكن استخدام الأسلوب الثقافة المبينة لمواصلة تحليل النماذج جيم من سرطان البروستاتا. وينبغي أن تسمح الظروف الثقافة للنمو والبقاء على قيد الحياة من السيطرة وورم الخلايا. في تجربتنا، نحن استخدمت بنجاح البروستاتا جيمم الذي يحمل مبين16. البروستاتا الماوس مع ارتفاع الصف الأورام استخدمت أيضا ل تحليل ثقافة كروي17. معرض الماغنيسيوم الماوس التحكم التشكل حتى كروية؛ ومع ذلك، قد تثبت الماغنيسيوم المستمدة من خلايا ورم البروستات الاختلافات في مورفولوجيا والسلوك بسبب إمكاناتها الورمية. ومن ثم، ستقدم دراسة أورجانويد السلوك في المختبر تمديد النظر في خصائص هذه الخلايا، وربما الملاحظات لسلوك كروي في الوقت الحقيقي من خلال تصوير خلية يعيش.
وفي الختام، يمكن إدراجها بتشريح البروستاتا والثقافة الأساليب المبينة في هذا البروتوكول في أنواع مختلفة من الدراسات التي تنطوي على جيمس مواصلة توفير المعلومات عن سرطان البروستاتا في كافة التطبيقات المتلقين للمعلومات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المنحة من المعهد الوطني للسرطان، R01CA161018 إلى LK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
- Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
- Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Society, A. C. Cancer Facts and Figures. , (2018).
- Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q.
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
- Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
- Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O.
- Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26 (2012).
- Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).
