Summary
Genetik fareler prostat kanseri mekanizmaları araştıran için yararlı modellerdir. Burada bir fare ürogenital sistemden prostat loblar incelemek, Histoloji üzerinde göre ayırt etmek ve yalıtmak ve pulcuklarının aşağı akım analizleri için olarak birincil Prostat hücreleri vitro kültür için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Genetiği fare modelleri (GEMMs) en tip-in insan kanser, prostat kanseri (PCa) dahil olmak üzere araştırma için etkili önceden klinik modelleri olarak hizmet vermektedir. Anatomi ve histoloji fare prostat anlama, hayvan tür modeller uygun karakterizasyonu ve verimli kullanım için önemlidir. Fare prostat dört ayrı çift lob, her biri kendi özellikleri vardır. Bu makalede, diseksiyon uygun yöntem ve fare prostat lob hastalığı analiz için kimlik gösterilir. Sonrası diseksiyon, prostat hücreler kültürlü vitro mekanik anlamak için daha fazla olabilir. Fare beri prostat primer hücre normal özellikleri kaybolur gideriz ne zaman kültürlü vitro, biz anahat burada hücreleri izole ve onları fizyolojik korumak için etkili olduğu 3D küresel kültürler büyüyen bir yöntem hücre özellikleri. Bu 3D kültürler hücre morfolojisi ve değiştirilmiş davranışı soruşturma fizyolojik koşullarda düzeyleri ve yerelleştirmeler anahtar proteinlerin ve yollarının geliştirilmesinde rol ve hastalığın ilerleme çözümlemek ve bakmak için kullanılabilir ilaç tedavileri için yanıt.
Introduction
Bilimsel topluluk yıllardır insan kanseri gelişiminin karmaşık mekanizma aydınlatmak kurmaya çalışıyor. Oysa potansiyel anahtar oyuncular ve uyuşturucu hedefleri tanımlaması hasta hücre ve doku çalışmaları ile başlar, translasyonel uygulama gibi bulgular genelde önceden klinik hayvan modelleri kullanılmasını gerektirir. Genetik fareler modelleri (GEMMs) modeli insan kanser için fare modelleri, insan kanser Konsorsiyumu (ncı-MMHCC), hangi tarif ve fare kanser özellikleri birleştirmek için aranan bir komite kurulması beri sayısı giderek kullanımı modeller için bilim adamları Dünya çapında1,2. Fare modelleri mekanik çalışmalar kanser gelişme, ilerleme, yanıt-e doğru tedaviler, anlamak için çoğu türleri önceden klinik çalışmalarda ihtiyacını yerine getirmek ve direnç3satın aldı.
Prostat kanseri erkeklerde her yıl4üzerinde 160.000 erkekleri etkileyen en sık meydana gelen kanserdir. Hastalığın agresif formlarını on binlerce her yıl hayatını iddia. Ancak, hastalık progresyon mekanizma hala kötü anlaşılmaktadır. Etkili tedavi seçenekleri Gelişmiş ve metastatik prostat kanseri, yüksek ölüm oranı gelişmiş prostat kanseri hastalar4kanıtladığı gibi ciddi bir eksikliği sonuçlanır. Bu nedenle, prostat kanseri eğitim önceden klinik modeller için büyüyen bir ihtiyaç vardır. Bar Harbor sınıflandırma sistemi fare histopatolojik değişikliklerin anahatları 2004 ' te kullanılmaya başlanan kadar ancak, fare ve insan prostat arasında içsel farklılıklar nedeniyle modelleme GEMMs prostat kanserinin popülerlik elde değil Prostat genetik manipülasyon, neoplastik değişiklikler tanımlaması ve insanlar5ilerlemesinde kanseri aşamaları onların ilişkisi üzerine. Bir önemli herhangi bir prostat et modeli eğitim sırasında dikkate alınması gereken fare prostat özelliğidir lob dört ayrı çift varlığı: ön, yan, ventral ve dorsal. Loblar histopatoloji ve gen ifade deseni6önemli farklılıklar mevcut. Probasin protein ifade deseninin Cre tabanlı et modelleri çoğunlukla tasarlanmıştır beri hangi probasin tabanlı promotor kullanarak Pb-Cre47adı verilen düşünülmelidir genç sonrası ergenlik fareler7, loblar arasında değişebilir. Cre ifade kez ortaya çıkan kayma ve temporal farklılıkları tümör başlama ve ilerleme zaman çizelgeleri farklılıkları yanı sıra neoplastik değişiklikler farklılıkları loblar arasında yol. Bu nedenle, tümör geliştirme prostat GEMMs okurken bu tür farklılıklar için hesap önemlidir ve bireysel loblar tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için ayrı ayrı değerlendirilmesi gerekebilir. Bu makalenin ilk bölümünde bir fare prostat incelemek, tanımlamak ve her lob ayırmak ve loblar histolojik farklılıkları tanımak için uygun yöntemleri açıklar.
Tümör büyüme ve histopatoloji Analizi değerli tümör geliştirme kazandırabileceğini iken, onlar moleküler mekanizmaları hakkında çok fazla bilgi vermeyin. Tümör gelişimi ve ilerlemesi mekanizması çalışmaya, genellikle tümör hücreleri içinde vitroanaliz etmek yararlı olduğu. Birkaç yöntem süspansiyon kültürler, 3D kültürler8 de dahil olmak üzere bu hücreleri kültürleri içeren yıllar içinde tavsiye ettiler ve son zamanlarda, normal 2D9kültürler. Bu yöntemlerin çoğu iyi hücre hayatta kalma ve nükleer silahların yayılmasına karşı fiyatlarına neden ise 3D kültürler için fizyolojik şartlarda en yakın olan bir ortam sağlamak. Membran hücre dışı matriks (ECM) içinde yetiştirilen 3D veya küresel kültürlerde tamamen farklı luminal hücreleri genellikle çok düşük sağkalım oranı var; Ancak, Bazal ve orta düzey hücreleri (çoğunlukla kök hücre) yayar ve pulcuklarının10denilen hücre kümeleri oluşturmak edebiliyoruz. Epitel kanser kök hücreleri (halk kanser kök hücreleri da bilinen)11' den kaynaklanan inanılıyor bu yana bu bir kanser çalışma için uygun yapar. Bu iletişim kuralı ikinci bölümü 3D kültürlerde fare prostat hücre kültürü çalışmalarının bir yöntem açıklanır. Elde edilen küreler aşağı akım analizleri, insan organoid Morfoloji ve canlı hücre, farklı proteinler için boyama ayirt Imaging davranışı ve kemoterapötik yanıtlarını çalışmanın da dahil olmak üzere çeşitli türleri için kullanılabilir tedaviler.
Genel olarak, bu iletişim kuralının amacı fare prostat anatomi ve diseksiyon teknikleri ve küresel kültür ve vitro analiz için doku işleme açıklayarak prostat kanserinde fare modelleri kullanmak için en iyi yöntemleri anahat etmektir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm fare deneyleri kurumsal IACUC onaylı protokolleri SUNY şehir dışında Tıp Üniversitesi'nde özetlenen yönergelere göre yapıldı.
1. ürogenital sistem (UGS) diseksiyon
Not: Şematik resim 1' de sunulmuştur.
- CO2 inhalational ötenazi yöntemi veya başka bir onaylanmış teknik kullanarak 3 aylık erkek C57BL/6 fare ötenazi.
Not: Fareler 3 ve 12 ay yaşları arasında başarılı bir şekilde deneme için kullanılabilir. Büyük fareler (> 6 ay) en büyük olasılıkla temizlenmesi gerekir UGS etrafında daha fazla yağ olacak. Kimlik ve loblar birbirinden ayrılması zor kez farelerde 3 aydan daha genç. Diğer suşların deneme için de kullanılabilir. - Sırtında fareyi getirin ve hayvan ventral tarafında maruz iğne kullanılarak bacaklar güvenli.
- % 70 etanol fare'nın karnına sprey ve temizle.
Not: diseksiyon gerekli değildir önce karın saç tıraş. - Kas tabakası ile birlikte karın derisini orta künt forseps bir çift ile Asansör ve makas kullanarak karnına bir ters Y şeklinde kesi yapmak.
- Önce göğüs kemiği (Şekil 2a) için hemen penis üzerinde keskin makas ile düz bir kesi yapılır.
- Belgili tanımlık kesme doğru uyluk (Şekil 2b) kadar her ayak tabanından kesti. Geri cilt her iki tarafta ve tüm karın bölgesi (Şekil 2 c-e) görüntülemek için alt kat.
Not: Kesim boyutu değişir fare yaş ve boyutu bağlıdır. Belgili tanımlık ilk düz kesme boyutu 1,5 dan fare büyüklüğüne bağlı olarak 4 cm alanı.
- UGS ortaya çıkarmak için diğer organlar üzerinde hareket. Asansör ve kahverengi-sarı bağırsak (Şekil 2f) taşıyın. Forseps ile karın yağ yastıkları (opak beyaz süngerimsi doku) almak ve iki taraf (Şekil 2 g) taşıyın.
Not: UGS seminal veziküller, üretra, prostat, duktus deferens (vas deferens) ve idrar kesesi oluşmaktadır. Opak beyaz yuvarlak kemerli, (ki seminal veziküller) karakteristik çifti tarafından tabanına bağlı sıvı dolu mesane sac ile belirlenebilir. Prostat, seminal veziküller hemen altında yer alan yarı saydam dokudur. - UGS bulun, sıkıca mesane künt forseps ile tutun ve tüm UGS fare karın üzerinden yukarı doğru kaldırın.
Not: mesane dolu ise, ilk forseps ile daha iyi bir tutuş sağlar ve mesane parçalanma riskini azaltmak için küçük bir şırınga ile boşaltmak. - Mesane, omurga, slayda makas prostat ve mesane altında sonuna kadar yukarı çekin ve bir kesim yapmak devam. Karın boşluğu (Şekil 2 h ve 2i) için kalan herhangi bir bağlantıyı kesti. Çok yakın UGS herhangi bir prostat doku ile yanlışlıkla kesme önlemek için kesmemeye dikkat et.
Not: böylece kesme vertebral sütunun de enstantane UGS altında kesim yaparken, makas ta fareyi, arkasına doğru takılmalıdır. Bu yöntem neredeyse tüm UGS ve bir parça fare dokuya ayıklamak için gereken süreyi azaltarak, karın boşluğunda arasında bağlantı kesilmesinin sonuçlanır. - UGS çıkarın ve 2-6 mL (yeterli doku kapsayacak şekilde) yerleştirin fosfat tuz (PBS) arabelleğe alınmış veya Dulbecco'nın kartal Orta (DMEM, yüksek glikoz) 6 cm Petri kabına (2j anlamaya ve 2 k) değiştiren ve diseksiyon mikroskop (10 X için hareket büyütme).
Not: diseksiyon medya kalan adımları gerektiği gibi değiştirin.
2. prostat anatomi
- Her iki taraftan dorsal ve ventral iyi forseps ve mikrodiseksiyon makas (Şekil 3a) bir çift ile tüm yağ temizleyin. Benzer cerrahi aletler diseksiyon protokolü için kullanabilir.
Not: Yağ kez yakından (beyaz süngerimsi görünümünü tarafından tanımlanabilir) UGS ile dolaşık; Bu nedenle, bu adımı yanlışlıkla herhangi bir prostat doku kırpma önlemek için dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmelidir. O kadar tüm yağ temizlemek için 10-15 dk sürebilir. - Tutun ve mesane forseps ile çekin ve makasla (Şekil 3b) vasıl belgili tanımlık temel kesik.
- Kalan doku ventral yan yerleştirin. Bir duktus deferens forseps ile tutun, makasla, üsse izini ve makasla kesme bu (Şekil 3 c), sonra diğer tarafta tekrarlayın. Şimdi prostat (yarı saydam ve solucan), seminal veziküller bırakarak duktus deferens kaldırmak (opak ve beyaz, doğusu) ve üretra (pembe-kırmızı ve opak tüp) (şekil 3d ve 3e).
- Forseps seminal veziküller ve prostat doku ön lob iç kemer arasında yerleştirin. Ayrı seminal veziküller Gözetlemek ve prostat ve gerekli (Şekil 3f) olarak herhangi bir bağ dokusu makasla kesme. Kendi tabanına üretra, seminal veziküller izlemek ve bunları (Şekil 3 g ve 3 h) kaldırın. Onları delmek değil dikkatli olun.
- Bireysel prostat loblar incelemek için devam edin.
3. (rakamlar 3i-e-n, Şekil 4) prostat ve bireysel lob mikrodiseksiyon Gross anatomi
- Böylece bir kelebeğin kanatları benzer dorsal loblar gösterilen, dorsal yüzü dönük doku künt forseps bir çift ile fiske vurmak.
- LOB forseps ile tutarak ve makas ile (Şekil 3j) vasıl belgili tanımlık temel kırpma dorsal loblar toplamak.
- Ventral tarafında kalan doku üzerinde ters çevirin.
- Küçük yan loblar toplamak ve genellikle üretra tarafında, hangi ön, ventral ve dorsal loblar (Şekil 3 k) arasında sıkışmış sarın.
- Ardından, hangi yan loblar büyüktür ve üretra üzerinde ventrally yalan ventral loblar toplamak (Şekil 3 l).
- Son, anterior loblar, en büyük kesme ve üretra (Şekil 3 m) atarak tarafından dört, hasat.
- Doku parçaları deneysel ihtiyaçlarına göre işlem. Bölüm 4 Histoloji için veya bölüm 5 küresel kültür için devam edin.
4. lob kimlik ve morfoloji Hematoksilen ve eozin lekeli slaytlar
- Prostat doku tamir ve parafin içinde embed. Hematoksilen eozin (H & E) görüntülemek ve prostat loblar histoloji, Oliveira ve arktarafından özetlenen özellikleri kullanılarak temel farklılıkları belirlemek için ile slaytlar boyama ile devam edin. 12 (Şekil 5).
5. doku 3D kültür10 işleniyor
Not: Bu Şekil 6' da gösterilmiştir.
- Deneysel ihtiyaçlarına göre bütün prostat veya bireysel loblar kültürü ile devam edin. Prostat doku DMEM 2-3 mL içeren bir 10 cm çanak aktarın. Bir neşter ile ince ve diseksiyon mikroskop altında mümkün olduğunca eşit olarak prostat tübüllerin kıyma.
- Steril koşullarda bir doku kültürü başlık altında kalan adımlarla devam edin.
- Doku parçaları ile birlikte DMEM 15 mL tüp aktarmak ve ses DMEM ile 9 ml arttırmak. 1 mL 10 x collagenase stok çözeltisi DMEM-doku karışımı ve girdap karışımı ekleyin.
Not: Collagenase hisse senedi çözüm 10 mg/mL Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta ise 15 mL tüp son konsantrasyonu 1 mg/mL. - Tüp üzerinde gyratory bir shaker yerleştirin veya rotator hücre dışı matriks düşer collagenase için 37 ° C'de 2 h için tüp.
- 400 x g oda sıcaklığında 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant atın ve 2 mL sıcak % 0.05 tripsin EDTA hücre-hücre ve hücre-matris yapışıklıklar ayırmak için resuspend. Tüp 37 ° C 5 min için transfer.
Not: doku parçaları karıştırın kadar büyük iseniz, pipet ucu daha geniş bir delik yapmak için bir tıraş bıçağı ile kesti. - P1000 pipet ile 8 - 10 kez pipetting, o zaman P200 pipet ile yinelenen tarafından herhangi bir doku kümeleri kadar break.
- Tripsin tam DMEM 3 mL ile etkisiz hale getirin. 500 DNAase U eklemek ben ve iyi karıştırın.
- 5 mL şırınga ile 5 - 10 kat 18 G iğne ile geçmek. Sonra 5 kez bir 20 G iğne ile geçer.
- Çözüm hala büyük doku parçaları içerir 4-8 bir kez daha yineleyin.
- Filtre bir 40 mikron filtre aracılığıyla hücre süspansiyon bir 50 mL tüp yerleştirilir. 15 mL tüp DMEM 5 mL ile durulayın ve aynı filtreden geçmek. Durulama yineleyin.
- Filtre atın ve akışı ile 400 x g oda sıcaklığında 5 min için de içeren tüp santrifüj kapasitesi.
6. kaplama ve hücre kültürü çalışmalarının
- Pelet 0.5 mL tam prostat epitel hücre büyüme orta (PrEGM) resuspend. Bir hücre sayaç veya hemasitometre kullanarak hücre yoğunluğu saymak ve 5 x 105 hücre/mL tam PrEGM hücrelere oranında seyreltin.
Not: Bir 3-ay-yaşlı fare tüm prostat dan verim 3 x 105-106 hücrelerden arasında olabilir. Bu nedenle, başlangıçta istenen hücre yoğunluğu, hatta düşük verim ile elde edilebilir (yukarıda belirtildiği gibi) en fazla 0.5 ml PrEGM Pelet resuspend önemlidir. - Mix gerekli birim hücre membran ECM 2:3 hacim oranı (% 60'ı membran ECM ve % 40 hücre süspansiyon) ve çok iyi plaka veya odası slayt deneysel ihtiyaçlarına göre plaka ile.
Not: İmmunostaining, cam-alt plakalar veya odası slaytlar, plaka için tüm iyi veya iyi orta kapsayan. Kuyunun ağız ortaya çıkan organoids sayma Eğer plaka veya daha yüksek birimleri kaplama Eğer her yerinde iyi birkaç damlacıkları plaka. Çok kalın veya çok ince değil yaymaya daha dikkatli ol. En az 100 µL alan kaplama, 1 cm2 başına matris hücresine karışımı plaka; Örneğin, bir 2 cm2odası slaytta yer-de yüzey alanı, 5 x 104 hücreleri içeren matris hücresine karışımı 200 µL kaplama. - Plaka/slayt membran ECM kuvvetlendirmek için 30 dk için bir 37 ° C kuluçka makinesi-%5 CO2 ile aktarın. Sonra önceden ısıtılmış tam PrEGM membran ECM tak bozmamaya dikkat çekici şey, kapsayacak şekilde ekleyin.
- Medya yarısı kaldırın ve 2-3 günde taze medya ekleyin. Pulcuklarının 5-10 gün boyunca büyümeye.
- (7. adım), immunostaining (adım 8) hasat ve/veya görüntüleme için downstream uygulamalarında ile devam edin.
7. hasat küreler
- Küreler hasat için medya dikkatle membran ECM jel tak bozmadan Aspire edin ve 1 mL 1 mg/mL dispase çözeltisi içinde PrEGM membran ECM 100 µL ekleyin.
Not: Eğer onlar iyi veya RIM (yerine kapsayan tüm iyi) ortasında kaplama pulcuklarının hasat kolaydır dispase çözüm yeterli miktarda kuyuya eklenebilir emin olmak için. - Alt plaka membran ECM jel dispase-PrEGM çözüm içine kapalı kaldırmak için hücre sıyırıcı ile kazı.
- 1000 µL pipet ucu veya jel tak daha küçük parçalara bölmek için 5 mL pipet pipet bir kez geniş bir ile yukarı ve aşağı tüm çözüm taşıyordu.
Not: geniş geçişli bahşiş yapmak bir tıraş bıçağı ile 1000 µL pipet ucu ucu kesilmiş. - Membran ECM tamamen çözülmüş kadar 1-2 h için % 5 CO2 bir 37 ° C kuluçka kuluçkaya.
Not: Bu jel yok daha fazla boyutta kalmasını onaylamak için plaka eğerek süre görsel denetim iyi alt tarafından sağlanmış olur. - 15 mL konik tüp hücre süspansiyon toplamak.
- Küreler 250 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi ve aşağı akım uygulamalar ile devam eder.
8. Immunostaining küre13
Not: pulcuklarının istediğiniz süreyi için büyüdü sonra membran ECM çözünmüş ve küreler Colicino vd içinde açıklandığı gibi boyanabilen 13.
- Kısaca, PBS kültürlerle durulayın ve doğrudan membran ECM jel fiş %4 paraformaldehyde (PFA) ekleyin. Membran ECM tamamen taze PFA her 30 dk yerine eriyene kadar yavaş sallayarak ile Oda sıcaklığında 30-90 dk için kuluçkaya.
Not: PFA jel tak dağıtılması ve bu işlem sırasında pulcuklarının düzeltmek. - Ardından, PBS 3 kez ile yıkayın ve 50 mM amonyum klorür PFA üzerinden herhangi bir autofluorescence gidermek için 10 dakika için ekleyin. PBS ile 3 yıkama için yineleyin.
- 5 dk ve PBSAT ile blok için %0,1 non-iyonik deterjan ile permeabilize (PBS, % 1 BSA, % 0.5 Triton X-100) 30 dk için.
- Gecede 4 ° C'de PBSAT ve oda sıcaklığında 2 h için ikincil bir antikor PBSAT içinde 3 yıkar ardından, PBSAT içinde birincil bir antikor ile kuluçkaya.
- PBSAT ile yıkama ve leke DAPI ile üreticinin protokole göre istenirse yineleyin. 3 veya daha fazla kez PBS ile yıkayın.
- PBS ile 200 mM 1,4-diazabicyclo [2.2.2] oktan (DABCO) antifade reaktif ekleyin ve görüntüleme için devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare prostat loblar belirlenebilir ve seminal veziküller ve üretra ile ilgili konumlarını kullanarak disseke. Fare prostat 4 çift seminal veziküller ve üretra lob dorsally yer alan ve ventrally oluşur. Şekil 4a ve 4b (ilk) olduğu gibi prostat, seminal veziküller ve üretra ile birlikte dorsal ve ventral görünümlerini göstermek. (Şekil 4 c ve 4 d) alt paneller için kimlik özetlenen farklı loblar göster. Loblar üzerinden fare 3 ay kadar genç ayrılabilir.
Farklı prostat loblar Histoloji (Şekil 5) önemli ölçüde farklılık gösterir. Tüm fare prostat loblar salgı epitel hücreleri tarafından çevrili bir lümen oluşan birden çok bezi profil oluşur; Ancak, loblar şekli, hücreleri organizasyonu ve salgı doğası farklı lob LOB. H & E lekeli fare prostat verimli Oliveira vd tarafından açıklanan olmuştur tanımlayıcı özellikleri burada kısaca özetlenen 12. Ön lob sık infoldings ve şiddetle Eozinofilik salgısı ile orta büyük acini var. Dorsal loblar görünür Eozinofilik salgısı ile ön gibi ama çok daha küçük acini ve daha az infoldings vardır. Yan loblar karakteristik düz luminal Kenarlıklar ve Eozinofilik salgısı ile büyük küçük acini var. Ventral loblar yapısal olarak da düz luminal kenarlıklı yan loblar gibi ancak benzersiz bir soluk Eozinofilik luminal salgılanması.
Fare prostat hücre membran ECM pulcuklarının olarak kültürlü ve epitel benzeri özellikleri sergilemek. Bu Şekil 6'dakibir şematik olarak gösterilmiştir. Hücre yukarıda ve kültürlü membran ECM içinde anlatılan fare prostat dan izole edildi. Hücreleri gibi erken kültürünün 4 gün içinde organoids içine büyüyen başlatın. Şekil 7 (üst) organoids Bodrum membran ECM gösterilen 8 günlük eski kültürlerden temsilcisi alanları gösterir. Yukarıda belirtilen kültür koşullar altında hücrelerin çoğu kısmi veya tam lümen içinde sahip bir kesir ile katı küre büyümek. Bu organoids genellikle bile küresel bir kara delik var. Organoids hasat edildi ve immunostained olarak Colicino ve ark. içinde açıklanan 13. Şekil 7 (alt paneli) bir organoid olmadan bir lümen (solda) ve bir lümen (sağda), phalloidin (F-aktin marker, yeşil) ve DAPI (çekirdek, mavi) ile lekeli gösterir. Β-catenin şiddetle epitel hücrelerinde hücre-hücre arabirimleri, ifade bir hücre-hücre adezyon belirtecidir. Şekil 8 güçlü β-catenin boyama hücre-hücre kavşak içinde F-aktin (kırmızı) ile birlikte yerelleştirmek pulcuklarının (yeşil) gösterir. Pulcuklarının da cytokeratin 5, cytokeratin 8, p63 ve kanıt pulcuklarının gerçekten10prostat kaynaklanan hücreleri türetilmiştir androjen reseptör proteinler ifade eder.
Şekil 1: fare ürogenital sistem diseksiyon ve yalıtım prostat gösteren şematik akış çizelgesi. İletişim kuralı adımları açıklandığı için akış şeması 1-2 bölümleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: fare UGS diseksiyon. Adım adım görüntüleri UGS 3 aylık fareden diseksiyon: (bir ve b) (c-e geri çekerek karın bölgesinde ortaya çıkarmak için cilt) kesik, yapma (f) değişen bağırsak, (g) hareket karın yağ yastıkları, (h ve ben) UGS çıkarılması Karın boşluğu, (j) ayıklanan UGS, (k) ayıklanan UGS ile farklı organ ve dokularda işaretlenmiş aşağıdaki gibi: SV (sarı) seminal veziküller; = P (kırmızı) prostat; = F (mor) yağ; = V (açık mavi) vas deferens; = ve B (yeşil) mesane =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: fare prostat diseksiyon. Adım adım görüntüleri UGS fare prostattan diseksiyon için: (a) kaldırma yağ, (b) mesane, (c), vas deferens, üretra, prostat idrar ile (e) dorsal görünümü ile prostat (d) ventral görünümü kaldırma kaldırma (f-h) seminal veziküller, kaldırma (ı) (j) prostat, anatomi, ventral görünümü dorsal lob, (k) yan lob anatomi (l) anatomi ventral lob, (m) bir ön lob ve (n) disseke prostat loblar anatomi: anterior AP, dorsal = DP, = yanal LP = ve ventral VP =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: fare prostat lob anatomisi. 3-ay-yaşlı fare UGS yağ, mesane ve vas deferens çıkarıldıktan sonra temsilcisi görüntülerden. Resimleri göster seminal veziküller ve dorsal ile üretra prostat loblar (a ve c) ve ventral (b ve d) sayısı. «Ana sayfa» panelleri (bir ve b) alt paneller (c ve d) loblar özetlenen mavi (dorsal), kırmızı (ön), sarı (ventral) ve yeşil (lateral) gösterirken el değmemiş görüntüleri gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: farklı prostat loblar önemli ölçüde Histoloji içinde değişir. İşte bir H & tüm prostat görüntü E-lekeli seminal veziküller, üretra ve dört prostat loblar gösteren. Loblar turuncu (ön), ana hatlarıyla mavi (dorsal), yeşil (lateral) ve siyah (ventral). İç metin: 10 x amaç altında alınan her lob temsilcisi görüntülerden. Ölçek çubuğu temsil eden 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: sindirim prostat ve sonraki Küresel kültürlerin gösteren şematik akış çizelgesi. Akış şeması Protokolü adımlar için 5 ve 6 bölümlerde açıklanan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: Prostat hücreleri bile küresel pulcuklarının ile veya olmadan bir lümen içine büyümek. Prostat doku bir vahşi tipi 3-ay-yaşlı fare hasat Protokolü gereğince kültürlü. Kültürler pulcuklarının (üst) oluşumu gösterilen bir plaka Imager üzerinde 8 gün sonrası kültürüne, 4 X amaç altında görüntüsü. Pulcuklarının hasat ve iplik disk confocal mikroskop altında bir 40 su amaç (alt) X üzerinde yansıma bir floresan boya Birleşik phalloidin F-aktin (yeşil) ve DAPI için çekirdek (mavi), için iletişim açıklandığı gibi lekeli. Sağdaki küresel bir lümen kanıtı gösterir. Ölçek çubuklar 50 mikron gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: fare prostat organoids β-catenin bileske yerelleştirme göster. 6 bayat 3D kültürler hasat pulcuklarının, β-catenin karşı birincil bir antikor ve floresan bir boya Birleşik ikincil antikor kullanarak ve iplik disk confocal mikroskop altında bir 40 su amaç X üzerinde yansıma lekeli. Temsili resim β-catenin (yeşil, sol), F-aktin (kırmızı, orta) ve DAPI immunostaining (mavi) göstermek. Doğru kapı aynası birleştirilmiş tüm 3 kanal gösterir. Ölçek çubuğu 20 mikron temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kağıt fare prostat diseksiyon ve bireysel loblar tanımlaması için yöntemleri özetlenmektedir. Ayrıca fare Prostat hücreleri vitro analiz için 3D bir kültür kültür protokolüdür.
Bir kritik diseksiyon Protokolü (1) fare dışında tüm UGS hasat ve diseksiyon mikroskop altında bireysel organları ayıran adımdır. Prostat doku çok küçük ve UGS geri kalanı ile çevrili; Böylece, tüm dört çift lob sağlam tedarik ederken doğrudan doğruya--dan vücut boşluğu organ hasat pratik olarak mümkün değildir. Bu nedenle, tüm UGS fareden hasat ve prostat ayıklamak için devam etmek önemlidir. Bu Protokolü (2)'de önemlidir adımları izleyerek zamanında ama titiz kalır. Zaman diseksiyon sırasında doku bozulması en aza indirmek için önemlidir. UGS fare ayıklamak için burada açıklanan belirli teknik alternatifler daha hızlı karşılaştırılır ve şiddetle tavsiye edilir. Bütün diseksiyon ve LOB yalıtım prosedür genellikle daha fazla uygulama ile 25 dk indirdi 35-40 dk sürer. Diseksiyon en zor kısmı toplam diseksiyon zaman büyük bir kısmını alır UGS çevreleyen yağ temizliyor. Hiç bir şey ile prostat kalır, ancak yanlışlıkla sürecinde herhangi bir prostat doku kaybetmemek son derece dikkatli olmak önemlidir emin olmak için yağ titizlikle kaldırılması gerekir. Başka bir önemli adım (3) Üretra prostat loblar birbirinden ayrılması önce değil kaldırmaktır. Üretra aslında temel alınarak loblar düzenlenir prostat hangi tüm dört çift oluşturur. Onlar hala mekansal dağılımı üretra ile ilgili temel üretra, ekli loblar tanımlamak en kolay yoldur.
Bir kritik küresel kültür Protokolü (1) doku de kıyma adımdır. Özellikle prostat doku yapışkan bir doğa olduğundan bir neşter ile prostat doku kıyma bir sıkıcı adım olduğunu. Ancak, mümkün olduğu kadar küçük doku kıyma maksimum verim elde etmek için önemlidir. Başka bir önemli adım (2) trypsinization sonra pipetting ve boyutları şırınga geçen post-neutralization belirtilen olur. Her iki adımları doğru olarak gerçekleştirilen ve tekrarlanan, gerekirse optimum hücre verim elde etmek için gerekir. Son olarak, (önemli 3 membran ECM çok kalın veya çok ince plaka değil) olduğunu. Eğer membran ECM çok ince kaplama (i.e., 100 µL/cm2' den az), hücreleri değil nerede jel-ecek var olmak ince iyi ortasında uygun organoids içine büyür. Çok kalın kaplama (i.e., 250 µL/cm2' den fazla) değil düzgün katılaşıyor ve kapalı ortam değişiklikleri sırasında sürgülü membran ECM neden olur. Kaplama iyi ortasında en bile jel kalınlığı elde etmek için yardımcı olacaktır.
Açıklanan protokol biraz deneysel ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir. UGS çıkarma karın boşluğu için teknik Mesane sağlam bir tutuş forseps ile gerektirir. Mesane dolu olması durumunda, 1 mL şırınga ile mesane drenaj ve ince önemlidir (26G veya benzer) iğne dokuya ayıklamak başlamadan önce uygun bir kavrama sağlamak için. Doku diseksiyon süreci boyunca PBS veya DMEM ile nemli tutulmalıdır. Eğer doku küresel kültürler için kullanılmak üzere DMEM kullanarak tercih edilir. Hasat hücre süspansiyon hücre kaplama önce alt nüfus istenirse, Lukacs ve arktarafından açıklandığı gibi izole etmek için akış sitometresi göre sıralanabilir. 10.
Bu protokol için farklı prostat lob histolojik özellikleri ana hatlarıyla ve bir bu yönergeleri izleyerek loblar sağlıklı prostat doku tanımlamak gerekir. Ancak, işlemin bazı sınırlamalar vardır. Hiperplazi veya agresif tümör durumlarında, hangi bu önemli ölçüde daha fazla H & E boyama dayalı loblar birbirinden ayırt etmek yapabilirsiniz epitel morfoloji bozulur. Böyle durumlarda, loblar birbirinden ayrılması (Bu protokol için özetlenen) gömme ve boyama önce LOB özgü bilgileri gerekirse gereklidir. Hatta sağlıklı doku, anatomi ve histoloji geniş değişkenlik sunmak ve farklı ifade imzalar6var beri loblar ayrı ayrı analiz etmek gereklidir. İnsan prostat loblar bölünmüş değil beri Ancak, loblar fare prostat içinde ayırma translasyonel alaka, tartışma konusu. Buna rağmen PCa vivo içindeçalışmaya en iyi model fare kalır ve birkaç fare modelleri Gelişmiş14,15olmuştur. 3D kültür yöntemi özellikle mekanizmaları hastalık araştırmak için kullanılan bir anahtar tekniktir. Ancak, küresel kültür yönteminin bir uyarı Cre recombinase prostat kanseri fare modelleri için yaygın olarak kullanılan organizatörü olan fark ifade desenini probasin, kaynaklanmaktadır. Probasin düzenleyici luminal ve orta düzey hücreleri ama Bazal Hücre7içinde ağırlıklı olarak etkinleştirilir. Burada anlatılan kültür koşulları küresel oluşumu ağırlıklı olarak hücrelerin bazal ve ara ancak luminal hücreleri10teşvik. Dolayısıyla, ortaya çıkan kültür aslında Cre ifade etme ve Cre ifade pulcuklarının karışımı üretmek (i.e., denetim ve knock-out pulcuklarının karışımı). Sonuç olarak, çözümleme sırasında immunostain knock-out organoids tanımlamak ve organoid davranışı gen knock-muhalifler üzerinde göre sonuçlara faiz protein için önemlidir.
Bu yöntemler önemini prostat kanseri çalışmalarda GEMMs kullanımının çok yönlü uygulamalar yer almaktadır. Açıklanan diseksiyon yöntem prostat daha hızlı ve daha etkili bir şekilde çıkarmak araştırmacılar sağlayacak adımları ayrıntılı. Diseksiyon işlem sırasını bireysel loblar tespit ve hatta prostat diseksiyonlarının içinde çok az deneyime sahip olanlar tarafından çıkarılan sağlamak için tasarlanmıştır. Ana hatlarıyla kültür yöntemi et modelleri prostat kanserinin daha ileri düzeyde çözümlemek için kullanılabilir. Kültür koşulları, gelişim ve hayatta kalma hem denetim hem de tümör hücrelerinin için izin vermelidir. Deneyim, başarıyla MPIN16sergi et prostat kullanmıştır. Fare prostat ile daha yüksek dereceli tümörler de küresel kültür analizi17için kullandık. Denetim fare pulcuklarının bile küresel bir morfoloji sergi; Ancak, prostat tümör hücrelerden türetilmiş pulcuklarının Morfoloji ve davranış nedeniyle neoplastik potansiyellerini farklılıklar görülebilir. Bu nedenle, organoid davranış vitro okuyan bir genişletilmiş sağlayacaktır bu hücrelerin özellikleri ve muhtemelen gözlemler küresel davranış içine canlı hücre görüntüleme aracılığıyla gerçek zamanlı bakmak.
Sonuç olarak, prostat diseksiyon ve kültür yöntemleri bu protokol için açıklanan tüm aşağı akım uygulamalarda prostat kanseri bilgi vermeye devam GEMMs ilgili çalışmalar çeşitli türleri içine dahil edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal Kanser Enstitüsü, R01CA161018 LK için hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
- Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
- Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Society, A. C. Cancer Facts and Figures. , (2018).
- Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q.
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
- Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
- Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O.
- Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26 (2012).
- Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).
