Identifikasjon og histologiske karakteristikken Disseksjon av musen prostata Lobes for i Vitro 3D Spheroid kultur modeller

Summary

Genmodifiserte mus er nyttige modeller for å undersøke prostatakreft mekanismer. Her presenterer vi en protokoll for å identifisere og dissekere prostata lobes fra en mus urogenital system, skille dem basert på histology, og isolere og kultur primære prostata celler i vitro som spheroids for nedstrøms analyser.

Abstract

Genmodifiserte musen modeller (GEMMs) være effektiv pre-klinisk modeller for å undersøke de fleste typer kreft hos mennesker, inkludert prostatakreft (PCa). Forstå anatomi og histology av musen prostata er viktige for effektiv og riktig karakteristikk av slike dyr modeller. Musen prostata har fire forskjellige parene av fliker, hver med sine egne egenskaper. Denne artikkelen viser den passende metoden for disseksjon og identifisering av musen prostata lobes for sykdom analyse. Etter disseksjon, prostata celler kan være mer kultivert i vitro for mekanistisk forståelse. Siden musen prostata primære celler tendens til å miste deres vanlige egenskaper når kulturperler i vitro, vi skissere her en metode for å isolere cellene og voksende dem som 3D-formet kulturer, som er effektive for å bevare det fysiologiske egenskapene til cellene. Disse 3D kulturer kan brukes til å analysere celle morfologi og atferd i nær-fysiologiske forhold, undersøker endret nivåer og lokaliseringer viktige proteiner og veier involvert i utviklingen og progresjon av en sykdom, og ser på Svar å medikamentelle behandlinger.

Introduction

Det vitenskapelige samfunnet har forsøkt å belyse kompleks mekanisme menneskelige hudkreft i flere tiår. Mens identifisering av potensielle nøkkelspillere og narkotika mål begynner med pasienten celler og vev studier, krever translasjonsforskning anvendelsen av slike funn ofte bruk av pre-klinisk dyremodeller. Bruk av genmodifiserte mus modeller (GEMMs) til modell kreft hos mennesker har stadig økt siden musen modeller av menneskelig kreft Consortium (NCI-MMHCC), en komité som forsøkte å beskrive og forene kjennetegner musen kreft modeller for forskere verden over^1,2. Musen modeller oppfylle behovet for mekanistisk studier i pre kliniske studier av de fleste typer kreft, for å forstå utviklingen, progresjon, svar på behandlinger, og kjøpte motstand³.

Prostatakreft er hyppigst forekommende kreft i menn, påvirker over 160 000 menn hvert år⁴. Aggressive former av sykdommen hevder titusenvis av liv hvert år. Men er mekanismen av sykdomsprogresjon fremdeles dårlig forstått. Dette resulterer i en alvorlig mangel på effektive behandlingstilbud for avanserte og metastatisk prostatakreft, noe som gjenspeiles av den høye dødeligheten i avansert prostata kreft pasienter⁴. Derfor er det et økende behov for pre-klinisk modeller å studere prostatakreft. Men på grunn av den iboende forskjellen mellom musen og menneskelig prostata få modellering av prostata kreft i GEMMs ikke popularitet til Bar Harbor klassifikasjonssystem ble introdusert i 2004, som skissert histopathological endringer i musen prostata på genetisk manipulasjon, identifikasjon av neoplastic endringer og deres forhold til stadier av kreft i mennesker⁵. En viktig karakteristikk av musen prostata som må tas i betraktning når studere noen prostata GEMM modell er tilstedeværelsen av fire forskjellige parene av fliker: fremre, lateral, ventral og dorsal. Lobes presenterer betydelige forskjeller i histopatologi og gene expression mønster⁶. Probasin protein uttrykksmønster kan variere mellom flikene i unge etter puberteten mus⁷, som må vurderes grobunn-baserte GEMM modeller er hovedsakelig laget ved hjelp av en probasin-baserte promotor kalles Pb-Cre4⁷. Resulterende romlige og tidsmessige forskjellene i grobunn uttrykk ofte føre til forskjeller i svulst initiering og progresjon tidslinjer som forskjeller i neoplastic endringer mellom lobes. Derfor er det viktig å ta hensyn til slike forskjeller mens han studerte tumor utvikling i prostata GEMMs, og personlige lobes må vurderes separat for å oppnå reproduserbar resultater. Den første delen av denne artikkelen beskriver metodene riktig å dissekere musen prostatakreft, identifisere og skille hver lobe og gjenkjenne histologiske forskjellene mellom lobes.

Mens analyse av tumor vekst og histopatologi kan gi verdifull innsikt i tumor utvikling, gir de ikke mye informasjon om molekylære mekanismer. For å studere mekanismen av tumor utvikling og progresjon, er det ofte nyttig å analysere tumor celler i vitro. Flere metoder er foreslått årene som involverer kulturer av disse cellene, inkludert suspensjon kulturer, 3D kulturer⁸ og nylig vanlige 2D kulturer⁹. Mens de fleste av disse metodene resultere i god celle overlevelse og spredning priser, gir 3D kulturer et miljø som ligner fysiologiske forhold. I 3D eller spheroid kulturer dyrket i en kjeller membran ekstracellulær matrix (EFM), har fullt differensiert luminal cellene vanligvis svært lav overlevelse; men er basale og mellomliggende cellene (hovedsakelig stamceller) kjøpedyktig Overfør og produsere celle klynger kalt spheroids¹⁰. Dette gjør det egnet for en kreft studie siden epithelial kreft antas å stamme fra stamceller (populært kjent som kreft stamceller)¹¹. Den andre delen av denne protokollen beskriver en metode for dyrking musen prostata celler i 3D kulturer. Den resulterende kuler kan brukes for flere typer nedstrøms analyser, inkludert studiet av organoid morfologi og oppførsel av levende celle imaging, immunofluorescence flekker for ulike proteiner, og studiet av Svar å chemotherapeutic behandlinger.

Samlet er mål denne protokollen å skissere optimal metoder for å bruke musen modeller i prostata kreft ved å beskrive anatomi og disseksjon teknikker av musen prostata og behandling av vevet for spheroid kulturer og i vitro analyse .

Protocol

Alle mus eksperimenter beskrevet her ble utført i henhold til retningslinjene i institusjonelle IACUC-godkjent protokollene på SUNY storbyen medisinske universitet.

1. Urogenital System (UGS) disseksjon

Merk: Skjematiske vises i figur 1.

1. Euthanize en 3-måneden-gamle mannlige C57BL/6 mus ved hjelp av metoden CO₂ inhalasjon-anestesimiddel euthanasia eller en annen godkjent teknikk.
   Merk: Mus mellom 3 og 12 måneder kan brukes med hell for eksperimentet. Eldre mus (> 6 måneder) vil mest sannsynlig har mer fett rundt UGS, som må tømmes. Identifikasjon og separasjon av lobes er ofte vanskelig i mus yngre enn 3 måneder. Andre stammer kan brukes for eksperimentet, også.
2. Plasser musen på ryggen og sikre bena med pinner slik at den ventral siden av dyret er utsatt.
3. Spray 70% etanol på musen er magen og tørk den ren.
   Merk: Barbering magen håret før disseksjon ikke kreves.
4. Løft huden fra magen, sammen med muskel laget, med et par medium sløv tang og gjør et omvendt Y-formet snitt på magen med saks.
   1. Først lager du en rett snitt med en skarp saks fra like over penis til sternum (figur 2a).
   2. Klipp fra bunnen av innsnitt mot hver toe, opp til lårene (figur 2b). Brett tilbake huden på begge sider og nederst for å vise hele mageområdet (figur 2 c-e).
      Merk: Kutt størrelsen varierer avhengig av musen alder og størrelse. Størrelsen på den opprinnelige rette snittet kan variere fra 1,5 til 4 cm, avhengig av musen.
5. Flytt over til andre organer å avsløre UGS. Løft og flytte brun-gult tarmen (figur 2f). Plukk opp abdominal fett pads (ugjennomsiktig hvit spongy vev) med tang og flytte dem til sidene (figur 2 g).
   Merk: UGS består av sædblærene, urinrør, prostata, ductus deferens (vas deferens) og urinblæren. Det kan identifiseres av de karakteristiske to ugjennomsiktig hvit halvsirkelformet buer (som sædblærene), med væskefylte blæren sac festet til basen. Gjennomskinnelig vevet ligger rett under sædblærene er prostata.
6. Finn UGS, fast holder urinblæren med sløv tang, og løfte hele UGS oppover fra musen magen.
   Merk: Hvis blæren er full, renne den først med en liten sprøyte gir bedre grep med tang og redusere risikoen for rupturing blæren.
7. Fortsetter å trekke opp på blæren, lysbilde et par saks under blære og prostate helt til ryggraden, og gjøre et kutt. Skjære gjennom alle gjenværende tilkoblinger til bukhulen (figur 2 h og 2i). Pass på at du ikke kutte for nær UGS å unngå utilsiktet skjære gjennom alle prostate vev.
   Merk: Samtidig som kutt under UGS, saksen skal settes til baksiden av musen, slik at kuttet festes virvelsøylen også. Denne metoden gir kuttet nesten alle tilkoblinger mellom UGS og bukhulen i en bekkasin, redusere tiden det tar å trekke vev fra musen.
8. Fjern UGS og plassere den i 2-6 mL (nok til å dekke vev) av fosfat bufret saltvann (PBS) eller Dulbeccos endret Eagle medium (DMEM, høy glukose) i en 6 cm Petriskål (figur 2j og 2 k) og flytte den til et disseksjon mikroskop (10 X forstørrelse).
   Merk: Endre dissecting mediet som kreves i trinnene.

2. dissekere prostata

1. Fjern alt fettet fra både rygg- og ventrale sidene med et par fine tang og microdissection saks (figur 3a). Bruk lignende Kirurgiske instrumenter for resten av disseksjon protokollen.
   Merk: Fett er ofte nøye omslynget med UGS (kan identifiseres ved sin hvite svampaktig utseende); Derfor må dette trinnet utføres nøye for å unngå uhell snipping av noen prostate vev. Det kan ta opptil 10-15 min å fjerne alt fettet.
2. Hold og dra blæren med tang og klipp det på basen med saksen (figur 3b).
3. Plass de resterende vev ventrale siden opp. Hold en ductus deferens med tang, spore den til basen med saks, bekkasin det (Figur 3 c), og gjenta på den andre siden. Fjerne ductus deferens, nå forlate bak prostate (gjennomskinnelig og verminous), sædblærene (ugjennomsiktig og hvit, halvsirkelformet), og urinrøret (rosa-rød og ugjennomsiktig rør) (figur 3d og 3e).
4. Sett inn tang mellom indre buen av sædblærene og prostate vev fremre lobes. Lirke fra hverandre sædblærene og prostata og klipp noen bindevev som nødvendig (figur 3f). Spore sædblærene til sin base på urethra og fjerne dem (Figur 3 g og 3 h). Pass på at du ikke punktere dem.
5. Fortsette å dissekere ut personlige prostata lobes.

3. grov anatomi av prostata og individuelle Lobe Microdissection (tall 3i-n, figur 4)

1. Vend vevet med en stump tang slik at dorsal side ansikter, viser dorsal lobes, som ligner på en sommerfugl vinger.
2. Samle dorsal lobes ved å holde flik med tang og snipping på basen med saks (figur 3j).
3. Snu gjenværende vevet til ventral side.
4. Samle lateral lobes, som er små og vanligvis brytes urinrøret på siden, som er klemt fast mellom fremre ventrale og dorsal lobes (Figur 3 k).
5. Deretter samle ventrale lobes, som er større enn lateral lobes og ligge på urethra ventrally (Figur 3 l).
6. Siste, høste fremre lobes, den største av fire, ved å klippe og forkaster urinrøret (Figur 3 m).
7. Behandle vev bitene eksperimentelle behov. Fortsette avsnitt 4 angående histology eller seksjon 5 for spheroid kultur.

4. lobe identifikasjon og morfologi fra Hematoxylin og Eosin-farget lysbilder

1. Fikse det prostate vev og bygges inn i parafin. Fortsett med flekker lysbildene med hematoxylin og eosin (H & E) for å vise og identifisere forskjeller i prostata lobes basert på histology, bruke egenskapene beskrevet av Oliveira et al. ¹² (figur 5).

5. behandling vev for 3D kultur¹⁰

Merk: Dette er skissert i figur 6.

1. Fortsett med dyrking hele prostata eller personlige lobes som eksperimentelle behov. Overføre prostate vev til en 10 cm tallerken med 2-3 mL av DMEM. Med en skalpell, hakke på prostata tubuli som fint og jevnt som mulig under disseksjon mikroskop.
2. Fortsett med trinnene under vev kultur hette, under sterile forhold.
3. Overføre vev bitene sammen med DMEM til en 15 mL tube og øke volumet til 9 mL med DMEM. Legg til 1 mL av 10 x collagenase lagerløsning DMEM-vev blanding og vortex å blande.
   Merk: Collagenase lagerløsning er 10 mg/mL i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, og den endelige konsentrasjonen i 15 mL tube er 1 mg/mL.
4. Sett røret på en gyratory shaker eller rør omdreiende for 2t på 37 ° C, collagenase å nedverdige den ekstracellulære matrisen.
5. Sentrifuge røret på 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
6. Forkast nedbryting og resuspend i 2 mL av varm 0,05% trypsin-EDTA deler i celle-celle og celle-matrise adhesjon. Overføre røret til 37 ° C i 5 minutter.
   Merk: Hvis vev biter til blandingen, kuttet pipette spissen med et barberblad å en bredere bar.
7. Bryte opp noen vev klumper av pipettering med en P1000 pipette 8 - 10 ganger, og deretter gjenta med en P200 pipette.
8. Nøytralisere trypsin med 3 mL fullstendig DMEM. Legge til 500 U DNAase jeg og bland godt.
9. Passere gjennom en 5 mL sprøyte 5 - 10 ganger med en 18 G nål. Deretter passere gjennom 5 ganger med en 20 G nål.
10. Gjenta trinn 4-8 igjen hvis løsningen inneholder store vev biter.
11. Filtrere celle suspensjon gjennom en 40 μm filter plassert på en 50 mL tube. Skyll den 15 mL tuben med 5 mL DMEM og passerer det samme filteret. Gjenta skylling.
12. Slett filteret og sentrifuge røret som inneholder gjennomflytsenhet 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur.

6. plating og dyrking cellene

1. Resuspend pellet i 0,5 mL av komplett prostata Epithelial celle vekst Medium (PrEGM). Telle celle tetthet bruker en celle counter eller hemocytometer og fortynne cellene til 5 x 10⁵ celler/mL i fullstendig PrEGM.
   Merk: Avkastningen fra 3-måneden-gamle musen hele prostatakreft kan variere fra 3 x 10⁵-10⁶ celler. Derfor er det viktig å først resuspend pellets i ikke mer enn 0,5 mL av PrEGM (som nevnt ovenfor) slik at ønsket celle tetthet kan oppnås, selv med lav yield.
2. Blanding nødvendig volumet av celler med kjelleren membranen ECM 2:3 volumkontrollen (60% kjelleren membran ECM og 40% celle suspension) og plate i flere godt plate eller kammer lysbildet som eksperimentelle behov.
   Merk: For immunostaining, plate glass bunn plater eller kammer lysbilder, dekker hele bra eller midten av brønnen. Plate rundt kanten av brønnen hvis teller den resulterende organoids eller plate flere dråper hele brønnen hvis plating høyere volumer. Vær oppmerksom på å ikke spre den for tykk eller for tynn. Plate minst 100 µL av matrisecelle blanding per 1 cm² for plating området; for eksempel i et kammer lysbilde med 2 cm²-tillegg overflate område, 200 µL av matrisecelle blanding med 5 x 10-⁴ celler skal være belagt.
3. Overføre plate/lysbildet til en 37 ° C inkubator med 5% CO₂ i 30 min for kjelleren membranen ECM å stivne. Legg deretter til forvarmes komplett PrEGM for å dekke godt, ta vare ikke for å forstyrre kjelleren membran ECM pluggen.
4. Ta halvparten av media og legge frisk media hver 2-3 dager. Vokse spheroids for 5-10 dager.
5. Fortsett med høsting (trinn 7), immunostaining (trinn 8), og/eller imaging for nedstrøms programmer.

7. høsting kulene

1. For å høste kuler, Sug opp media nøye uten å forstyrre kjelleren membran ECM gel pluggen og tilsett 1 mL 1 mg/mL dispase løsning i PrEGM per 100 µL av kjelleren membran ECM.
   Merk: Det er enklere å høste spheroids hvis de er belagt i brønnen eller rim (i stedet for dekker hele brønnen), slik at en tilstrekkelig mengde dispase løsningen kan legges til brønnen.
2. Skrap bunnen av platen med en celle skraper å løfte av kjelleren membran ECM gel i dispase-PrEGM-løsning.
3. Pipetter hele løsningen opp og ned én gang med et bredt bar 1000 µL pipette tips eller 5 mL pipette å bryte opp gel pluggen i mindre biter.
   Merk: Kutte spissen av en 1000 µL pipette tips med et barberblad å gjøre et bredt bar tips.
4. Inkuber i en 37 ° C inkubator med 5% CO₂ for 1-2 h til kjelleren membranen ECM har helt oppløst.
   Merk: Dette kan sikres ved by visuell inspeksjon av godt bunnen mens vippe platen for å bekrefte at ingen flere biter av gel forblir.
5. Samle celle suspensjon i et 15 mL konisk rør.
6. Sentrifuge kuler på 250 x g i 5 minutter ved romtemperatur og fortsette med nedstrøms programmer.

8. Immunostaining kuler¹³

Merk: Etter spheroids har vokst for ønsket mengde tid, kjelleren membranen ECM kan forsvinne og kuler kan være farget som beskrevet i Colicino et al. ¹³.

1. Kort, skyll kulturer med PBS og legge til 4% paraformaldehyde (PFA) direkte i kjelleren membran ECM gel pluggen. Inkuber i 30-90 min ved romtemperatur med langsom risting, til kjelleren membranen ECM er fullstendig oppløst, erstatte frisk PFA enhver 30 min.
   Merk: PFA vil oppløse gel pluggen og fastsette spheroids under denne prosessen.
2. Vask med PBS 3 ganger, og Legg 50 mM salmiakk i 10 min å slukke eventuelle autofluorescence fra PFA. Gjenta for 3 vasker med PBS.
3. Permeabilize med 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel for 5 min og blokk med PBSAT (PBS, 1% BSA, 0,5% Triton X-100) i 30 min.
4. Inkuber med en primær antistoff PBSAT overnatting på 4 ° C, etterfulgt av 3 vasker med PBSAT og en sekundær antistoff PBSAT for 2 timer ved romtemperatur.
5. Gjenta vasker med PBSAT og beis med DAPI i henhold til produsentens protokollen, om ønskelig. Vask 3 eller flere ganger med PBS.
6. Legge til PBS med 200 mM 1,4-diazabicyclo [2.2.2] oktan (DABCO) antifade reagens og Fortsett til bildebehandling.

Representative Results

Musen prostata lobes kan identifiseres og dissekert ved hjelp av deres steder med hensyn til sædblærene og urinrøret. Musen prostata består av 4 parene av fliker ligger på ryggen og ventrally sædblærene og urinrøret. Figur 4a og 4b (øverst) viser visningene dorsal og ventrale til intakt prostata, sædblærene og urinrøret. Den nedre paneler (Figur 4 c og 4 d) vise ulike lobes skissert for identifikasjon. Lobes kan skilles fra mus så unge som 3 måneder.

Forskjellige prostata lobes varierer betydelig i histology (figur 5). Alle mus prostata lobes består av flere kjertel profiler består av en lumen omgitt av sekretoriske epitelceller; Men formen på lobes, organisasjon av celler og natur utskillelsen varierer fra lobe til lobe. Identifisere kjennetegn fra H & E-farget musen prostates har vært effektivt skissert av Oliveira et al. ¹², kort skissert her. Fremre lobes har moderat til store acini med hyppige infoldings og sterkt eosinophilic sekret. Dorsal lobes vises som fremre med eosinophilic sekresjon, men har mye mindre acini og mindre infoldings. Lateral lobes har stort acini, med karakteristiske flatt luminal grenser og eosinophilic sekret. Ventrale lobes er strukturelt som lateral fliker, også med flat luminal grenser, men har en unik blek ikke-eosinophilic luminal sekret.

Musen prostata celler kan kultivert som spheroids i kjelleren membranen ECM og utstillingen epithelial-lignende egenskaper. Dette er beskrevet som en skjematisk i figur 6. Cellene ble isolert fra mus prostata som beskrevet ovenfor og kultivert i kjelleren membranen ECM. Cellene starte vokse i organoids i så tidlig som 4 dager med kultur. Figur 7 (øverst) viser representant felt fra 8 dager gamle kulturer viser organoids i kjelleren membranen ECM. Under de nevnte kultur forholdene vokse de fleste cellene i solid sfærer, med en brøkdel å ha en delvis eller full lumen inne. Disse organoids har vanligvis en selv sfærisk morfologi. Organoids ble høstet og immunostained som beskrevet i Colicino et al. ¹³. figur 7 (nedre panelet) viser en organoid uten en lumen (venstre) og med en lumen (høyre), beiset med phalloidin (F-utgangen markør, grønn) og DAPI (kjernen, blå). Β-catenin er en celle-celle adhesjon markør sterkt uttrykt på celle-celle grensesnitt i epitelceller. Figur 8 viser sterk β-catenin flekker (grønn) på celle-celle knutepunktene i spheroids som co Lokaliser med F-utgangen (rød). Spheroids uttrykker også cytokeratin 5, cytokeratin 8, p63 og androgen reseptoren proteiner, noe som beviser at spheroids er faktisk utledet fra cellene stammer i prostata¹⁰.

Figur 1: skjematisk flytskjema som viser Disseksjon av musen urogenital systemet og isolering av prostata. Flytskjema delene for protokollen trinnene beskrevet i 1-2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Disseksjon av musen UGS. Trinnvise bilder fra Disseksjon av UGS fra en 3-måneden-gamle mus: (en og b) gjør snittene (c-e) trekke tilbake huden til å utsette mageområdet, (f) skiftende det tarmen, (g) flytte abdominal fett pads, (h og jeg) utpakking av UGS fra den bukhulen, (j) den utpakkede UGS, (k) den utpakkede UGS med ulike organer og vev merket slik: SV (gul) = sædblærene; P (rød) = prostata; F (lilla) = fat. V (lys blå) = vas deferens; og B (grønn) = blæren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Disseksjon av musen prostata. Trinnvis bilder for Disseksjon av musen prostata fra UGS: (a) fjerne fett, (b) fjerne urinblæren, (c) fjerne vas deferens, (d) opprydning prostata med urinrøret, (e) dorsal visning av prostata med urinrøret, (f-h) fjerne sædblærene, (i) opprydning av prostata, (j) dissekere en dorsal lobe, (k) dissekere en lateral lobe, (l) dissekere en ventrale lobe, (m) dissekere en fremre lobe og (n) dissekert prostata lobes: fremre = AP, dorsal = DP, lateral = LP og ventrale = VP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: anatomi av musen prostata lobes. Representant bilder fra 3-måneden-gamle musen UGS etter fjerning av fett, blære og vas deferens. Bildene viser prostata lobes sædblærene og urinrøret, med dorsal (a og c) og ventrale (b og d). Topp paneler (en og b) viser urørt bilder, mens bunnen panel (c og d) viser lobes skissert i blått (rygg), rød (anterior), gul (ventrale) og grønn (lateral). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: forskjellige prostata lobes varierer betydelig i histology. Her er en H & E-farget hele prostata bildet viser sædblærene, urinrør og fire prostata lobes. Lobes er skissert i oransje (anterior), blå (rygg), grønn (lateral) og svart (ventrale). Innfelt: representant bilder fra hver lobe, tatt under et 10 x mål. Skala linjen representerer 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: skjematisk flytskjema demonstrere fordøyelsen prostates og påfølgende spheroid kulturer. Flytskjema for protokollen trinnene beskrevet i avsnitt 5 og 6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7: prostata celler vokse inn selv sfærisk spheroids med eller uten en lumen. Prostate vev høstet fra en vill-type 3-måneden-gamle mus ble kultivert som protokollen. Kulturer ble fotografert på en plate imager under et 4 X mål, på 8 dager etter kultur, viser dannelsen av spheroids (øverst). Spheroids ble høstet og farget som beskrevet i protokollen med et fluorescerende farge-konjugerte phalloidin for F-utgangen (grønn) og DAPI for kjerner (blå), deretter fotografert på spinning disk AC confocal mikroskop under en 40 X vann mål (nederst). Formet til høyre viser bevis på en lumen. Skala barer representerer 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8: mus prostata organoids Vis junctional lokalisering av β-catenin. Spheroids høstes fra 6 dager gamle 3D kulturer ble farget, bruker en primær antistoff mot β-catenin og en fluorescerende farge-konjugerte sekundære antistoff, og fotografert på spinning disk AC confocal mikroskop under en 40 X vann mål. Representant bilder viser immunostaining for β-catenin (grønn, venstre), F-utgangen (rød, midten) og DAPI (blå). På høyre side viser alle 3 kanaler flettes. Skala linjen representerer 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dette dokumentet beskriver metodene for Disseksjon av musen prostata og identifikasjon av personlige lobes. Også beskrevet er protokollen for dyrking musen prostata celler i en 3D kultur for i vitro analyse.

En avgjørende skritt i disseksjon protokollen er (1) høsting av hele UGS av musen og skille organene under disseksjon mikroskop. Prostate vev er svært liten og omgitt av resten av UGS; Dermed er det praktisk talt umulig å høste orgelet direkte fra kroppens hulrom mens skaffe alle fire par lobes intakt. Derfor er det viktig å høste den hele UGS fra musen og så fortsette å trekke prostata. Det er også viktig i denne protokollen for (2) utfører trinnene i tide men fortsatt grundig. Tid er kjernen i disseksjon for å minimere vev degradering. Bestemt teknikken beskrevet her for uttrekking av UGS fra musen er raskere i forhold til alternativer og anbefales sterkt. Hele disseksjon og flik isolasjon prosedyren tar vanligvis 35-40 min, som kan senkes til 25 min med mer trening. Den mest utfordrende delen av dissection er rengjøring fett rundt UGS, som tar opp en stor andel av beskytningen tid. Fettet må fjernes omhyggelig for å sikre at ingen av det fortsatt med prostata, men det er viktig å være svært forsiktig med å tilfeldigvis miste noen prostate vev i prosessen. Et annet viktig skritt er (3) ikke fjerne urinrøret før separasjon av prostata lobes. Urinrøret egentlig danner base på som alle fire par prostata lobes er ordnet. Det er enklest å identifisere lobes hvis de er fortsatt knyttet til urinrøret, basert på deres geografiske fordeling med hensyn til urinrøret.

En avgjørende skritt i spheroid kultur protokollen er (1) hakking vevet godt. Hakking prostate vev med skalpell er kjedelig, spesielt siden den prostate vev har en klissete natur. Men er hakking vevet så liten som mulig avgjørende for å få maksimal avkastning. Et annet viktig skritt er (2) pipettering etter trypsinization og passerer gjennom sprøyter størrelsene på angitt post-neutralization. Begge disse trinnene må utføres riktig og gjentatt, hvis nødvendig, for å oppnå optimal celle avkastning. Endelig, er det viktig (3) ikke til plate kjelleren membranen ECM for tykk eller for tynn. Hvis kjelleren membranen ECM gullbelagt for tynn (dvs., mindre enn 100 µL/cm²), celler vil ikke vokse til riktig organoids i brønnen, der gel vil være den tynneste. Kontaktflate det for tykk (dvs., mer enn 250 µL/cm²) vil resultere i kjelleren membran ECM ikke stivner riktig og glir av under media endringer. Plating i brønnen vil bidra til å oppnå de selv gel tykkelse.

Protokollen beskrevet kan endres litt eksperimentell behov. Teknikken for utvinning av UGS fra bukhulen krever et fast grep på urinblæren med tang. I tilfelle blæren er for full, er det viktig å tømme blæren med en 1 mL sprøyte og tynn (26G eller lignende) p å sikre et riktig grep før du begynner å trekke vevet. Vevet bør holdes fuktig med PBS eller DMEM gjennom disseksjon prosessen. Bruke DMEM foretrekkes hvis vevet skal brukes for spheroid kulturer. Høstet celle suspensjon kan sorteres etter flowcytometri å isolere undergrupper av celler før plating, eventuelt som beskrevet av Lukacs et al. ¹⁰.

Histologiske kjennetegner forskjellige prostata lobes har blitt beskrevet i denne protokollen, og man kunne identifisere lobes i sunn prostate vev ved å følge disse retningslinjene. Det er imidlertid visse begrensninger av prosessen. I tilfeller av hyperplasia eller aggressiv svulster, blir epithelial morfologi forstyrret, som kan gjøre det betydelig vanskeligere å skille mellom lobes basert på den H & E flekker. I slike tilfeller separasjon av fliker (som beskrevet i denne protokollen) før innebygging og flekker er nødvendig hvis lobe-spesifikk informasjon er nødvendig. Selv i friskt vev er det ofte nødvendig å analysere lobes separat siden de presentere bred variasjon i anatomi og histology og har differensial uttrykk signaturer⁶. Imidlertid kan translasjonsforskning relevansen av skille lobes i musen prostata diskuteres, siden menneskelig prostata ikke er delt i fliker. Til tross for dette, musen er fortsatt den beste modellen å studere PCa i vivo, og flere musen modeller har vært utviklet^14,15. Metoden 3D kultur er spesielt en viktig teknikk som kan brukes til å undersøke mekanismer av sykdommen. Men oppstår en påminnelse av metoden spheroid kultur differensial uttrykksmønster av probasin, som brukte arrangøren for grobunn recombinase prostatakreft musen modeller. Probasin selskapet er hovedsakelig aktivert i luminal og mellomliggende celler, men ikke i basal celler⁷. Kultur betingelsene beskrevet her fremme formet formasjon hovedsakelig fra basal og mellomliggende celler, men ikke fra luminal cellene¹⁰. Derfor de endelige kulturene faktisk produserer en blanding av grobunn-uttrykker og ikke-Cre-uttrykke spheroids (dvs., en blanding av kontroll og knock-out spheroids). Resultatet i analyse er det viktig å immunostai for protein av interesse å identifisere knock-out organoids og trekke konklusjoner på organoid atferd basert på gene banker-outs.

Betydningen av disse metodene ligger i mangesidig programmer ved å bruke GEMMs i prostata kreft studier. Disseksjon metoden beskrevet har detaljert fremgangsmåte som gjør forskerne å trekke prostates raskere og mer effektivt. Sekvensen av disseksjon prosessen er utformet for å sikre at personlige lobes kan identifiseres og utdraget, selv av de med minimal erfaring i prostata disseksjoner. Kultur metoden skissert kan brukes å analysere GEMM modeller av prostatakreft. Kultur betingelsene bør tillate vekst og overlevelse av både kontrollen og tumor celler. I vår erfaring, har vi brukt GEMM prostates som viser mPIN¹⁶. Musen prostates med høyere klasse svulster har også blitt brukt for spheroid kultur analyse¹⁷. Kontroll musen spheroids viser en selv sfærisk morfologi; men kan spheroids avledet fra prostata tumorceller vise forskjeller i morfologi og atferd på grunn av deres neoplastic potensial. Derfor studerer organoid oppførsel i vitro vil gi en utvidet se på egenskapene til disse cellene, og muligens observasjoner av spheroid atferd i sanntid gjennom live-celle avbildning.

Avslutningsvis kan prostata disseksjon og kultur-metodene som er beskrevet i denne protokollen bli innlemmet i ulike studier som involverer GEMMs for å fortsette å gi informasjon om prostatakreft i alle nedstrøms programmer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI medium	Thermofisher Scientific	11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS)	Thermofisher Scientific	11965-084
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	10438018
PBS (Phosphate buffered saline)	Thermofisher Scientific	10010031
Collagenase	Thermofisher Scientific	17018029	Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
Syringes and Needles	Fisher Scientific
Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	Add all componenets, aliquot and store at -20 °C.
Matrigel membrane matrix	Thermofisher Scientific	CB-40234
Dispase II powder	Thermofisher Scientific	17105041	Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C