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Cancer Research

पहचान, ऊतकवैज्ञानिक लक्षण वर्णन, और के लिए माउस प्रोस्टेट पालियों के विच्छेदन इन विट्रो 3d अंडाकार आकृति संस्कृति मॉडल

Published: September 18, 2018 doi: 10.3791/58397
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1, 1,2
1Department of Urology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, SUNY Upstate Medical University, 3Laboratory of Comparative Pathology, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 4Boulder BioPATH, Inc

Summary

आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों प्रोस्टेट कैंसर तंत्र की जांच के लिए उपयोगी मॉडल हैं । यहां हम एक माउस मूत्रजननांगी प्रणाली से पहचान और काटना प्रोस्टेट पालियों प्रोटोकॉल वर्तमान, उंहें प्रोटोकॉल के आधार पर अंतर है, और अलग और संस्कृति बहाव विश्लेषण के लिए spheroids के रूप में इन विट्रो में प्राथमिक प्रोस्टेट कोशिकाओं ।

Abstract

आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) प्रोस्टेट कैंसर सहित मानव कैंसर के अधिकांश प्रकार की जांच के लिए प्रभावी पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में सेवा (पीसीए) । शरीर रचना विज्ञान और माउस प्रोस्टेट के प्रोटोकॉल को समझना कुशल उपयोग और ऐसे पशु मॉडलों के उचित लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण है । माउस प्रोस्टेट पालियों के चार अलग जोड़े, अपनी विशेषताओं के साथ प्रत्येक है । यह लेख विच्छेदन और रोग विश्लेषण के लिए माउस प्रोस्टेट पालियों की पहचान की उचित विधि को दर्शाता है । पोस्ट-विच्छेदन, प्रोस्टेट कोशिकाओं को आगे यंत्रवत समझने के लिए इन विट्रो में कल्चरित किया जा सकता है । के बाद से माउस प्रोस्टेट प्राथमिक कोशिकाओं को अपने सामांय विशेषताओं जब इन विट्रो मेंसंस्कृति खो देते हैं, हम यहां कोशिकाओं को अलग करने और उंहें 3 डी अंडाकार आकृति संस्कृतियों, जो शारीरिक संरक्षण के लिए प्रभावी है के रूप में बढ़ के लिए एक विधि रूपरेखा कोशिकाओं के लक्षण । इन 3 डी संस्कृतियों कक्ष आकृति विज्ञान और निकट शारीरिक स्थितियों में व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बदल स्तर और प्रमुख प्रोटीन और एक रोग के विकास और प्रगति में शामिल रास्ते के स्थानीयकरण की जांच, और देख दवा उपचार के लिए प्रतिक्रियाएं ।

Introduction

वैज्ञानिक समुदाय के लिए दशकों से मानव कैंसर विकास के जटिल तंत्र को स्पष्ट का प्रयास किया गया है. संभावित प्रमुख खिलाड़ियों और दवा ठिकानों की पहचान जबकि रोगी कोशिकाओं और ऊतक अध्ययन के साथ शुरू होता है, इस तरह के निष्कर्षों के शोधों आवेदन अक्सर पूर्व नैदानिक पशु मॉडल के उपयोग की आवश्यकता है. आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों मॉडल (GEMMs) का उपयोग मॉडल मानव कैंसर के लिए तेजी से मानव कैंसर कंसोर्टियम (NCI-MMHCC), एक समिति है जो वर्णन और एकजुट माउस कैंसर की विशेषताओं की मांग की माउस मॉडल की स्थापना के बाद से बढ़ी है वैज्ञानिकों के लिए दुनिया भर में1,2मॉडल । माउस मॉडल पूर्व में यंत्रवत अध्ययन के लिए की जरूरत को पूरा कैंसर के अधिकांश प्रकार के नैदानिक अध्ययन, विकास को समझने के लिए, प्रगति, उपचार के लिए प्रतिक्रिया, और3प्रतिरोध प्राप्त की ।

प्रोस्टेट कैंसर पुरुषों में सबसे अधिक होने वाली कैंसर है, १६०,००० पुरुषों पर हर साल4प्रभावित । रोग के आक्रामक रूपों हर साल जीवन के हजारों के दसियों का दावा है । हालांकि, बीमारी बढ़ने की व्यवस्था अभी भी खराब समझ में आ रही है । उंनत और मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर के लिए प्रभावी उपचार के विकल्प की एक गंभीर कमी में यह परिणाम, के रूप में उंनत प्रोस्टेट कैंसर रोगियों में उच्च मृत्यु दर का सबूत4। इसलिए, प्रोस्टेट कैंसर का अध्ययन करने के लिए पूर्व नैदानिक मॉडलों के लिए एक बढ़ती जरूरत है । हालांकि, माउस और मानव प्रोस्टेट के बीच अंतर्निहित मतभेदों के कारण, GEMMs में प्रोस्टेट कैंसर की मॉडलिंग जब तक बार हार्बर वर्गीकरण प्रणाली २००४, जो माउस में histopathological परिवर्तन रेखांकित में पेश किया गया था लोकप्रियता हासिल नहीं किया आनुवंशिक हेरफेर पर प्रोस्टेट, नवोत्पादित परिवर्तन की पहचान, और5मनुष्यों में कैंसर की प्रगति के चरणों के लिए उनके संबंध । एक महत्वपूर्ण विशेषता माउस प्रोस्टेट है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए, जबकि किसी भी प्रोस्टेट GEMM मॉडल का अध्ययन पालियों के चार अलग जोड़े की उपस्थिति है: पूर्वकाल, पार्श्व, ventral और पृष्ठीय । पालियों histopathology और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न6में महत्वपूर्ण अंतर उपस्थित । बेसिन प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न युवा के बाद यौवन चूहों7, जो Cre आधारित GEMM मॉडल के बाद से विचार किया जाना चाहिए में पालियों के बीच भिंन हो सकते है ज्यादातर एक बेसिन आधारित मोटर पीबी बुलाया-Cre47का उपयोग कर डिजाइन किए हैं । परिणामस्वरूप स्थानिक और लौकिक मतभेद Cre अभिव्यक्ति में अक्सर ट्यूमर दीक्षा और प्रगति समयरेखा में मतभेद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पालियों के बीच नवोत्पादित परिवर्तन में अंतर करने के लिए नेतृत्व । इसलिए, प्रोस्टेट GEMMs में ट्यूमर के विकास का अध्ययन करते समय इस तरह के मतभेदों के लिए खाते के लिए महत्वपूर्ण है, और व्यक्तिगत पालियों reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए अलग से मूल्यांकन किया जा करने की आवश्यकता हो सकती है. इस लेख के पहले भाग के लिए एक माउस प्रोस्टेट काटना उचित तरीकों का वर्णन, पहचान और प्रत्येक पालि अलग, और पालियों के बीच ऊतकवैज्ञानिक मतभेदों को पहचाना ।

जबकि ट्यूमर के विकास और histopathology के विश्लेषण ट्यूमर के विकास में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, वे आणविक तंत्र के बारे में ज्यादा जानकारी प्रदान नहीं करते । ट्यूमर के विकास और प्रगति के तंत्र का अध्ययन करने के लिए, यह अक्सर इन विट्रो मेंट्यूमर कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है । कई तरीकों का सुझाव दिया गया है कि पिछले कुछ वर्षों में इन कोशिकाओं की संस्कृतियों शामिल, निलंबन संस्कृतियों, 3 डी संस्कृतियों8 और हाल ही में, नियमित रूप से 2d संस्कृतियों9। जबकि इन तरीकों में से सबसे अच्छा सेल अस्तित्व और प्रसार दर में परिणाम, 3 डी संस्कृतियों एक वातावरण है कि शारीरिक स्थितियों के करीब है प्रदान करते हैं । 3 डी या अंडाकार आकृति एक तहखाने झिल्ली extracellular मैट्रिक्स (ECM) में उगाया संस्कृतियों में, पूरी तरह से विभेदित चमकदार कोशिकाओं को आम तौर पर बहुत कम जीवित रहने की दर है; हालांकि, बेसल और मध्यवर्ती कोशिकाओं (ज्यादातर स्टेम सेल) के लिए प्रचार और सेल spheroids10बुलाया समूहों का उत्पादन कर रहे हैं । यह एक कैंसर के अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाता है के बाद से उपकला कैंसर स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न करने के लिए माना जाता है (लोकप्रिय कैंसर स्टेम सेल के रूप में जाना)11. इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग में 3 डी संस्कृतियों में माउस प्रोस्टेट कोशिकाओं संवर्धन के लिए एक विधि का वर्णन । परिणामस्वरूप क्षेत्रों के बहाव का विश्लेषण के कई प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लाइव सेल इमेजिंग द्वारा organoid आकृति विज्ञान और व्यवहार के अध्ययन सहित, अलग प्रोटीन के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, और कीमोथेरेपी के लिए प्रतिक्रियाओं का अध्ययन उपचार.

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है प्रोस्टेट कैंसर में माउस मॉडल का उपयोग करने के लिए इष्टतम तरीकों की रूपरेखा को शरीर रचना विज्ञान और माउस प्रोस्टेट के विच्छेदन तकनीकों और अंडाकार आकृति संस्कृतियों और इन विट्रो विश्लेषण के लिए ऊतक के प्रसंस्करण का वर्णन .

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Protocol

सभी माउस प्रयोगों यहां वर्णित संस्थागत IACUC-अनुमोदित प्रोटोकॉल में SUNY राज्य चिकित्सा विश्वविद्यालय में उल्लिखित दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. मूत्रजननांगी प्रणाली (UGS) विच्छेदन

नोट: योजनाबद्ध 1 चित्रामें प्रस्तुत किया है ।

  1. Euthanize एक 3 महीने पुराने पुरुष C57BL/2 सह सांस लेना इच्छामृत्यु विधि या किसी अंय तकनीक को मंजूरी दे दी माउस का उपयोग कर ।
    नोट: 3 और 12 महीने की उंर के बीच चूहों प्रयोग के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है । पुराने चूहों (> 6 महीने) सबसे अधिक संभावना UGS के आसपास अधिक वसा होगा, जो की आवश्यकता होगी मंजूरी दे दी है । पहचान और पालियों की जुदाई अक्सर 3 महीने से छोटी चूहों में मुश्किल है । अंय उपभेदों प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से ।
  2. माउस को अपनी पीठ पर रखें और पिन का उपयोग करके पैरों को सुरक्षित करें ताकि जानवर के ventral पक्ष सामने आ जाए ।
  3. माउस के पेट पर ७०% इथेनॉल स्प्रे और यह साफ पोंछ ।
    नोट: विच्छेदन से पहले पेट के बाल शेविंग की आवश्यकता नहीं है.
  4. पेट से त्वचा लिफ्ट, मांसपेशी परत के साथ, मध्यम कुंद संदंश की एक जोड़ी के साथ और कैंची का उपयोग कर पेट पर एक औंधा Y के आकार का चीरा बनाते हैं ।
    1. सबसे पहले, बस उरोस्थि (चित्रा 2a) को लिंग के ऊपर से तेज कैंची की एक जोड़ी के साथ एक सीधा चीरा बनाओ ।
    2. प्रत्येक पैर की अंगुली की ओर चीरा के आधार से कट, जांघों तक (चित्रा बी b). सभी उदर क्षेत्र (चित्रा 2cई) को देखने के लिए नीचे और नीचे दोनों पक्षों पर त्वचा मोड़ो ।
      नोट: कट आकार बदलता है माउस उंर और आकार पर निर्भर करते हैं । प्रारंभिक सीधे चीरा के आकार १.५ से 4 सेमी, माउस के आकार पर निर्भर करता है की सीमा हो सकती है ।
  5. UGS को बेनकाब करने के लिए अन्य अंगों पर ले जाएँ. लिफ्ट और भूरे रंग की पीली आंत (चित्रा 2f) ले जाएं । पेट वसा पैड उठाओ (अपारदर्शी सफेद चिमड़ा ऊतक) संदंश के साथ और उन्हें पक्षों के लिए कदम (चित्रा 2g).
    नोट: UGS लाभदायक बुलबुले के शामिल हैं, मूत्रमार्ग, प्रोस्टेट, डक्टस deferens (वॉज deferens), और मूत्राशय । यह अपारदर्शी सफेद semicircular मेहराब की विशेषता जोड़ी द्वारा पहचाना जा सकता है (जो लाभदायक बुलबुले हैं), तरल पदार्थ से भरा मूत्राशय के आधार से जुड़ी थैली के साथ । सही लाभदायक बुलबुले के तहत स्थित पारदर्शी ऊतक प्रोस्टेट है ।
  6. UGS का पता लगाएँ, दृढ़ता से कुंद संदंश के साथ मूत्राशय पकड़, और माउस पेट से पूरे UGS ऊपर उठा ।
    नोट: यदि मूत्राशय भरा हुआ है, यह एक छोटी सी सिरिंज के साथ पहले नाली संदंश के साथ एक बेहतर पकड़ प्रदान करने के लिए और मूत्राशय rupturing के जोखिम को कम ।
  7. जारी रखने के लिए मूत्राशय पर खींच, मूत्राशय और प्रोस्टेट रीढ़ के लिए सभी तरह के नीचे कैंची की एक जोड़ी स्लाइड, और एक कटौती करते हैं । उदर गुहा (चित्रा 2h और 2i) के लिए किसी भी शेष कनेक्शन के माध्यम से कटौती । किसी भी प्रोस्टेट ऊतक के माध्यम से आकस्मिक काटने से बचने के लिए भी UGS के करीब कटौती करने के लिए नहीं सावधान रहें ।
    नोट: जबकि UGS के तहत कटौती कर, कैंची माउस के पीछे करने के लिए सभी तरह से डाला जाना चाहिए, ताकि कटौती कशेरुका कॉलम के रूप में अच्छी तरह से तस्वीरें । इस विधि में UGS और उदर गुहा के बीच कनेक्शन के लगभग सभी विच्छेद में परिणाम एक टुकड़ा, माउस से ऊतक निकालने के लिए आवश्यक समय को कम करने.
  8. UGS निकालें और यह 2-6 मिलीलीटर में जगह (पर्याप्त ऊतक कवर करने के लिए) फास्फेट (पंजाबियों) या Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM, उच्च ग्लूकोज) में एक 6 सेमी पेट्री डिश (चित्रा 2j और 2k) और यह एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के लिए कदम (10x आवर्धन) ।
    नोट: शेष चरणों में आवश्यकतानुसार विदारक मीडिया बदलें ।

2. प्रोस्टेट विदारक

  1. ठीक संदंश और microdissection कैंची (चित्रा 3ए) की एक जोड़ी के साथ दोनों पृष्ठीय और ventral पक्षों से सभी वसा स्पष्ट करें । विच्छेदन प्रोटोकॉल के बाकी के लिए इसी तरह के सर्जिकल उपकरणों का प्रयोग करें ।
    नोट: वसा अक्सर UGS के साथ बारीकी से जुड़ है (इसकी सफेद चिमड़ा रूप से पहचाना जा सकता है); इसलिए, इस कदम सावधानी से किया जाना चाहिए किसी भी प्रोस्टेट ऊतक से गलती से snipping से बचने के लिए । यह सभी वसा को साफ करने के लिए 10-15 मिनट तक का समय ले सकते हैं ।
  2. पकड़ो और संदंश के साथ मूत्राशय खींच और कैंची (चित्र बी) के साथ आधार पर यह गोली चलाना ।
  3. शेष ऊतक ventral ओर रखें । संदंश के साथ एक डक्टस deferens पकड़ो, यह कैंची के साथ आधार करने के लिए ट्रेस, और यह कटाव (चित्रा 3सी), तो दूसरी तरफ दोहराने । डक्टस deferens निकालें, अब प्रोस्टेट के पीछे छोड़ (पारदर्शी और कीड़े), लाभदायक बुलबुले (अपारदर्शी और सफेद, semicircular), और मूत्रमार्ग (गुलाबी लाल और अपारदर्शी ट्यूब) (चित्रा 3 डी और 3e).
  4. संदंश में डालें आंतरिक मेहराब के बीच और प्रोस्टेट ऊतक पूर्वकाल पालियों । के अलावा लाभदायक बुलबुले और प्रोस्टेट और कटाव किसी भी संयोजी ऊतक की जरूरत के रूप में (चित्रा 3f) खोदकर । मूत्रमार्ग पर उनके आधार के लिए लाभदायक बुलबुले का पता लगाने और उन्हें हटाने (चित्रा 3 जी और 3h). उन्हें पंक्चर न करने के लिए सावधान रहें ।
  5. व्यक्तिगत प्रोस्टेट पालियों बाहर काटना करने के लिए आगे बढ़ें ।

3. प्रोस्टेट और व्यक्तिगत पालि Microdissection के सकल एनाटॉमी (आंकड़े 3i-n, 4 चित्रा)

  1. कुंद संदंश की एक जोड़ी के साथ ऊतक फ्लिप इतना है कि पृष्ठीय पक्ष ऊपर चेहरे, पृष्ठीय पालियों, जो एक तितली के पंखों जैसा होगा दिखा ।
  2. संदंश और snipping के साथ कैंची (चित्रा 3j) के साथ आधार पर पालि धारण करके पृष्ठीय पालियों लीजिए.
  3. ventral पक्ष को शेष ऊतक पर फ्लिप ।
  4. पार्श्व पालियों, जो छोटे होते है और आम तौर पर मूत्रमार्ग की ओर है, जो पूर्वकाल, ventral, और पृष्ठीय पालियों (चित्रा 3k) के बीच अंकित कर रहे है लपेट लीजिए ।
  5. इसके बाद, ventral पालियों को एकत्र करें, जो पार्श्व पालियों से बड़े हैं और मूत्रमार्ग ventrally (फिगर 3l) पर लेट जाते हैं.
  6. पिछले, पूर्वकाल पालियों, चार में से सबसे बड़ा फसल काटने और मूत्रमार्ग (चित्रा 3m) को खारिज करके ।
  7. प्रायोगिक जरूरतों के अनुसार ऊतक के टुकड़ों को प्रोसेस करें । प्रोटोकॉल के लिए धारा 4 के लिए आगे बढ़ें, या अंडाकार आकृति संस्कृति के लिए धारा 5 ।

4. पालि पहचान और Hematoxylin और Eosin-सना हुआ स्लाइड से आकृति विज्ञान

  1. प्रोस्टेट ऊतक ठीक है और यह तेल में एंबेड । hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ स्लाइड धुंधला देखने के लिए और प्रोटोकॉल के आधार पर प्रोस्टेट पालियों में मतभेदों की पहचान, Oliveira एट अलद्वारा उल्लिखित विशेषताओं का उपयोग कर के साथ आगे बढ़ें । 12 (चित्रा 5).

5.3 डी संस्कृति के लिए ऊतक प्रसंस्करण10

नोट: यह चित्र 6में उल्लिखित है ।

  1. प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार पूरे प्रोस्टेट या व्यक्तिगत पालियों संवर्धन के साथ आगे बढ़ें । एक 10 सेमी DMEM के 2-3 मिलीलीटर युक्त पकवान के लिए प्रोस्टेट ऊतक हस्तांतरण । एक स्केलपेल के साथ, विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे के रूप में पतले और समान रूप से संभव के रूप में प्रोस्टेट नलिकाओं कीमा ।
  2. एक ऊतक संस्कृति हूड के तहत शेष चरणों के साथ जारी रखें, बाँझ शर्तों के तहत.
  3. DMEM के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए ऊतक के टुकड़े हस्तांतरण और DMEM के साथ 9 मिलीलीटर के लिए मात्रा में वृद्धि । मिश्रण करने के लिए DMEM ऊतक मिश्रण और भंवर के लिए 10x collagenase स्टॉक समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: Collagenase स्टॉक समाधान रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) मध्यम में 10 मिलीग्राम/एमएल है, और 15 मिलीलीटर ट्यूब में अंतिम एकाग्रता है 1 मिलीग्राम/
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए एक gyratory शेखर या ट्यूब रोटेटर पर ट्यूब प्लेस, extracellular मैट्रिक्स नीचा करने के लिए collagenase के लिए ।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
  6. supernatant त्यागें और गर्म ०.०५% trypsin-EDTA सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स आसंजन से सट करने के लिए 2 मिलीलीटर में resuspend । 5 मिनट के लिए ३७ ° c के लिए ट्यूब स्थानांतरण ।
    नोट: यदि ऊतक हिस्सा भी अच्छी तरह से मिश्रण बड़ा कर रहे हैं, एक उस्तरा ब्लेड के साथ पिपेट टिप में कटौती करने के लिए एक व्यापक बोर करना ।
  7. एक P1000 पिपेट के साथ pipetting द्वारा किसी भी ऊतक के झुरमुट को तोड़ने 8-10 बार, तो एक P200 पिपेट के साथ दोहरा ।
  8. पूरी DMEM के 3 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर । जोड़ें ५०० यू के DNAase मैं और मिश्रण अच्छी तरह से ।
  9. एक के माध्यम से गुजारें 5 एमएल सिरिंज एक 18 जी सुई के साथ 5-10 बार. फिर एक 20 जी सुई के साथ 5 बार से गुजरती हैं ।
  10. चरण 4-8 एक बार फिर दोहराएं यदि समाधान अभी भी बड़ा ऊतक खंड शामिल हैं ।
  11. एक ५० एमएल ट्यूब पर रखा ४० माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर । 15 मिलीलीटर ट्यूब DMEM के 5 मिलीलीटर के साथ कुल्ला और एक ही फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं । कुल्ला दोहराएं ।
  12. फ़िल्टर छोड़ें और प्रवाह से युक्त ट्यूब केंद्रापसारक के माध्यम से ४०० x g पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ।

6. चढ़ाना और संवर्धन कोशिकाओं

  1. पूरा प्रोस्टेट उपकला कोशिका विकास मध्यम (PrEGM) के ०.५ मिलीलीटर में गोली resuspend । सेल घनत्व का उपयोग कर एक सेल काउंटर या hemocytometer और कोशिकाओं को पतला करने के लिए गणना 5 x 105 कोशिकाओं को पूरा PrEGM में/
    नोट: एक 3 से उपज महीने पुराने माउस पूरे प्रोस्टेट से रेंज कर सकते है 3 x 105-106 कोशिकाओं । इसलिए, यह शुरू में PrEGM के ०.५ मिलीलीटर से अधिक नहीं में गोली स्थगित महत्वपूर्ण है (जैसा कि ऊपर उल्लेख किया) ताकि वांछित कोशिका घनत्व प्राप्त किया जा सकता है, यहां तक कि कम उपज के साथ ।
  2. एक 2:3 मात्रा अनुपात (६०% तहखाने झिल्ली ECM और ४०% सेल निलंबन) और प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुसार एक बहु अच्छी तरह से प्लेट या चैंबर स्लाइड में थाली में तहखाने झिल्ली ECM के साथ कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा में मिश्रण ।
    नोट: immunostaining के लिए, ग्लास-नीचे प्लेट या चैंबर स्लाइड पर प्लेट, पूरी तरह से अच्छी तरह से या मध्य को कवर । के रिम के आसपास प्लेट अच्छी तरह से अगर परिणामस्वरूप organoids, या प्लेट सभी अच्छी तरह से अगर उच्च मात्रा चढ़ाना पर कई बूंदों के रूप में गिनती । यह बहुत मोटी या बहुत पतली नहीं फैलाने के प्रति सजग रहें । थाली से कम १०० µ एल मैट्रिक्स-चढ़ाना क्षेत्र के 1 cm2 प्रति सेल मिश्रण; उदाहरण के लिए, एक 2 सेमी2-well सतह क्षेत्र के साथ एक कक्ष स्लाइड में, मैट्रिक्स के २०० µ l-सेल 5 x 104 कोशिकाओं युक्त मिश्रण चढ़ाया जाना चाहिए.
  3. तहखाने झिल्ली ECM जमना के लिए 30 मिनट के लिए 5% CO2 के साथ एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए प्लेट/ फिर, अच्छी तरह से कवर करने के लिए पूर्व गर्म पूरा PrEGM जोड़ें, ध्यान रखने के तहखाने झिल्ली ECM प्लग परेशान करने के लिए नहीं.
  4. मीडिया के आधे निकालें और ताजा मीडिया हर 2-3 दिन जोड़ें । 5-10 दिनों के लिए spheroids बढे ।
  5. संचयन के साथ आगे बढ़ें (चरण 7), immunostaining (चरण 8), और/या बहाव अनुप्रयोगों के लिए इमेजिंग ।

7. क्षेत्रों की कटाई

  1. क्षेत्रों फसल के लिए, महाप्राण तहखाने झिल्ली ECM जेल प्लग परेशान बिना ध्यान से मीडिया और 1 मिलीलीटर की 1 मिलीग्राम/एमएल dispase समाधान में PrEGM प्रति १०० µ एल के तहखाने झिल्ली ECM ।
    नोट: यह spheroids फसल के लिए आसान है अगर वे अच्छी तरह से या रिम के बीच में चढ़ाया जाता है (के बजाय पूरी तरह से कवर के), यह सुनिश्चित करें कि dispase समाधान की एक पर्याप्त राशि के लिए अच्छी तरह से जोड़ा जा सकता है ।
  2. dispase-PrEGM समाधान में तहखाने झिल्ली ECM जेल से लिफ्ट करने के लिए एक सेल खुरचनी के साथ थाली के नीचे परिमार्जन ।
  3. पिपेट पूरे समाधान ऊपर और नीचे एक बार एक विस्तृत बोर १००० µ l पिपेट टिप या 5 मिलीलीटर पिपेट के साथ छोटे टुकड़ों में जेल प्लग को तोड़ने के लिए ।
    नोट: एक उस्तरा ब्लेड के साथ एक १००० µ l पिपेट टिप के टिप में कटौती करने के लिए एक व्यापक बोर टिप बनाते हैं ।
  4. तहखाने झिल्ली ECM पूरी तरह से भंग कर दिया है जब तक 1-2 एच के लिए 5% सह2 के साथ एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में मशीन ।
    नोट: यह अच्छी तरह से नीचे के दृश्य निरीक्षण द्वारा सुनिश्चित किया जा सकता है, जबकि प्लेट झुकने की पुष्टि करने के लिए कि जेल का कोई और हिस्सा रहते हैं ।
  5. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए ।
  6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर क्षेत्रों केंद्रापसारक और बहाव अनुप्रयोगों के साथ जारी है ।

8. Immunostaining क्षेत्रों के13

नोट: के बाद spheroids समय की वांछित राशि के लिए बड़े हो गए हैं, तहखाने झिल्ली ECM भंग किया जा सकता है और क्षेत्रों दाग के रूप में Colicino एट अल में वर्णित किया जा सकता है । 13.

  1. संक्षेप में, पंजाबियों के साथ संस्कृतियों कुल्ला और 4% paraformaldehyde (पीएफए) सीधे तहखाने झिल्ली ECM जेल प्लग करने के लिए जोड़ें । धीमी झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 30-90 मिनट के लिए मशीन, तहखाने झिल्ली ECM पूरी तरह से भंग हो जाता है जब तक, ताजा पीएफए हर 30 मिनट की जगह ।
    नोट: पीएफए जेल प्लग भंग और इस प्रक्रिया के दौरान spheroids तय करेगा ।
  2. अगले, 3 बार पंजाबियों के साथ धो और 10 मिनट के लिए ५० mM अमोनियम क्लोराइड जोड़ने के लिए पीएफए से किसी भी autofluorescence बुझाने । पंजाबियों के साथ 3 बहाकर के लिए दोहराएं ।
  3. Permeabilize के साथ ०.१% गैर ईओण डिटर्जेंट के लिए 5 मिनट और PBSAT के साथ ब्लॉक (पंजाबियों, 1% BSA, ०.५% ट्राइटन एक्स-१००) 30 मिनट के लिए ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर PBSAT में एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन, PBSAT और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए PBSAT में एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 3 बहाकर द्वारा पीछा किया ।
  5. PBSAT के साथ धोया और DAPI के साथ दाग को दोहराने निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, यदि वांछित । पंजाबियों के साथ 3 या अधिक बार धोएं ।
  6. २०० mM 1, 4-diazabicyclo [ -8] ऑक् टेन (DABCO) antifade रिएजेंट के साथ पंजाबियों जोड़ें और इमेजिंग करने के लिए आगे बढ़ें ।

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Representative Results

माउस प्रोस्टेट पालियों की पहचान की जा सकता है और लाभदायक बुलबुले और मूत्रमार्ग के संबंध में अपने स्थानों का उपयोग कर विच्छेदित । माउस प्रोस्टेट पालियों के 4 जोड़े से बना है और ventrally के लिए लाभदायक बुलबुले और मूत्रमार्ग के लिए स्थित है । चित्रा 4a और 4b (ऊपर) बरकरार प्रोस्टेट के पृष्ठीय और ventral विचारों को दिखाने के लिए, साथ लाभदायक बुलबुले और मूत्रमार्ग के साथ । नीचे पैनलों (आंकड़ा 4c और 4d) अलग पहचान के लिए रेखांकित पालियों दिखाओ । पालियों के रूप में 3 महीने के रूप में युवा चूहों से अलग किया जा सकता है ।

विभिंन प्रोस्टेट पालियों प्रोटोकॉल में काफी अलग (चित्रा 5) । सभी माउस प्रोस्टेट पालियों एक स्रावी उपकला कोशिकाओं से घिरा लुमेन से बना एकाधिक ग्रंथि प्रोफाइल से बना रहे हैं; हालांकि, पालियों के आकार, कोशिकाओं के संगठन, और स्राव की प्रकृति पालि से पालि में बदलती हैं । एच और ई से पहचान विशेषताओं-दाग माउस की स्थिति है कुशलतापूर्वक Oliveira एट अल द्वारा रेखांकित किया गया है । 12, संक्षेप में यहां उल्लिखित । पूर्वकाल पालियों लगातार प्राकट्य और दृढ़ता से इओसिनोफिलिक स्राव के साथ उदारवादी-से-बड़े acini है । पृष्ठीय पालियों इओसिनोफिलिक स्राव के साथ पूर्वकाल की तरह दिखाई देते हैं, लेकिन बहुत छोटे acini और कम खुलासा किया है । पार्श्व पालियों बड़े acini के लिए छोटे है, विशेषता फ्लैट चमकदार सीमाओं और इओसिनोफिलिक स्राव के साथ । Ventral पालियों भी सपाट चमकदार सीमाओं के साथ, पार्श्व पालियों की तरह संरचनात्मक हैं, लेकिन एक अद्वितीय पीला गैर इओसिनोफिलिक चमकदार स्राव है ।

माउस प्रोस्टेट कोशिकाओं तहखाने झिल्ली ECM और प्रदर्शन उपकला की तरह विशेषताओं में spheroids के रूप में प्रसंस्कृत किया जा सकता है । यह चित्र 6में एक योजनाबद्ध के रूप में उल्लिखित है । कोशिकाओं को माउस प्रोस्टेट से पृथक किया गया जैसा कि ऊपर वर्णित है और तहखाने झिल्ली ECM में संस्कृति । कोशिकाओं में organoids में बढ़ती शुरू के रूप में संस्कृति के 4 दिनों के रूप में जल्दी । चित्र 7 (ऊपर) 8 से प्रतिनिधि क्षेत्रों से पता चलता है दिन पुरानी संस्कृतियों तहखाने झिल्ली ECM में organoids दिखा । उपर्युक्त संस्कृति की स्थिति के तहत, कोशिकाओं के अधिकांश ठोस क्षेत्रों में वृद्धि, एक आंशिक या पूर्ण लुमेन अंदर होने अंश के साथ । इन organoids आम तौर पर एक भी गोलाकार आकृति विज्ञान है । Organoids और immunostained के रूप में Colicino एट अल में वर्णित काटा गया । 13. चित्रा 7 (नीचे पैनल) एक लुमेन के बिना एक organoid से पता चलता है (बाएं) और एक लुमेन के साथ (सही), phalloidin के साथ दाग (एफ actin मार्कर, हरे) और DAPI (नाभिक, नीला). β-catenin एक सेल-कोशिका आसंजन मार्कर है जो उपकला कोशिकाओं में सेल-सेल इंटरफेस पर दृढ़ता से व्यक्त किया जाता है । चित्रा 8 spheroids में सेल सेल जंक्शनों पर मजबूत β-catenin धुंधला (ग्रीन) प्रदर्शित करता है कि सह-actin (लाल) के साथ स्थानीयकरण. spheroids भी cytokeratin एक्सप्रेस 5, cytokeratin 8, p63, और एण्ड्रोजन रिसेप्टर प्रोटीन, जो सबूत है कि spheroids वास्तव में प्रोस्टेट10में उद्भव कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं प्रदान करते हैं.

Figure 1
1 चित्रा: योजनाबद्ध फ़्लोचार्ट प्रदर्शन माउस मूत्रजननांगी प्रणाली और प्रोस्टेट के अलगाव के विच्छेदन । खंड 1-2 में वर्णित प्रोटोकॉल चरणों के लिए चार्ट प्रवाह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: माउस UGS का विच्छेदन । एक 3 महीने पुराने माउस से UGS के विच्छेदन से कदम दर कदम छवियों: (a और b) चीरा बनाना, (सी-ई) पेट के क्षेत्र को बेनकाब करने के लिए त्वचा वापस खींच, (च) आंतों स्थानांतरण, (जी) पेट वसा पैड चलती, (एच और मैं) से UGS निकालने उदर गुहा, (जे) निकाली UGS, (कश्मीर) विभिन्न अंगों और ऊतकों के साथ निकाले UGS इस प्रकार के रूप में चिह्नित: एसवी (पीला) = लाभदायक बुलबुले; P (red) = प्रोस्टेट; च (बैंगनी) = fat; वी (हल्का नीला) = वॉज deferens; और ब (हरा) = मूत्राशय । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: माउस प्रोस्टेट के विच्छेदन । UGS से माउस प्रोस्टेट के विच्छेदन के लिए कदम दर कदम छवियों: (क) वसा को निकालना, (ख) मूत्राशय को हटाना, (ग) वॉज deferens को हटाना, (घ) मूत्रमार्ग के साथ प्रोस्टेट का ventral दृश्य, (ङ) मूत्रमार्ग के साथ प्रोस्टेट का पृष्ठीय दृश्य, (एफ एच) लाभदायक बुलबुले को हटाने, (i) प्रोस्टेट के ventral दृश्य, (जंमू) एक पृष्ठीय पालि विदारक, (के) एक पार्श्व पालि विदारक, (एल) एक ventral पालि विदारक, (एम) एक पूर्वकाल पालि विदारक, और (n) विच्छेदित प्रोस्टेट पालियों: पूर्वकाल = एपी, पृष्ठीय = डीपी, पार्श्व = एल. पी. और ventral = उपाध्यक्ष । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: माउस प्रोस्टेट पालियों के एनाटॉमी । 3 से प्रतिनिधि छवियां-महीने पुरानी माउस UGS वसा, मूत्राशय, और वॉज deferens को हटाने के बाद । छवियां लाभदायक बुलबुले और मूत्रमार्ग के साथ प्रोस्टेट पालियों दिखाने के लिए, पृष्ठीय (ए और सी) और ventral (बी और डी) विचारों के साथ । शीर्ष पैनलों (a और b) अछूता छवियां दिखाएं, जबकि नीचे पैनल (सी और डी) नीले (पृष्ठीय), लाल (पूर्वकाल), पीला (ventral), और हरे (पार्श्व) में उल्लिखित पालियों को दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: विभिंन प्रोस्टेट पालियों प्रोटोकॉल में काफी भिंनता है । यहां एक एच और ई दाग पूरे प्रोस्टेट लाभदायक बुलबुले, मूत्रमार्ग दिखा छवि है, और चार प्रोस्टेट पालियों । पालि नारंगी (पूर्वकाल), नीला (पृष्ठीय), हरे (पार्श्व), और काले (ventral) में उल्लिखित हैं । इनसेट: प्रत्येक पालि से प्रतिनिधि छवियां, एक 10x उद्देश्य के तहत लिया । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: योजनाबद्ध फ़्लोचार्ट और बाद में अंडाकार आकृति संस्कृतियों के पाचन का प्रदर्शन । खंड 5 और 6 में वर्णित प्रोटोकॉल चरणों के लिए प्रवाह चार्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: प्रोस्टेट कोशिकाओं के साथ या एक लुमेन के बिना भी गोलाकार spheroids में वृद्धि । प्रोस्टेट ऊतक एक जंगली प्रकार से काटा 3 महीने पुराने माउस प्रोटोकॉल के अनुसार संस्कृति थी । संस्कृतियों एक 4x उद्देश्य के तहत imager एक थाली पर imaged थे, 8 दिनों के बाद संस्कृति, spheroids के गठन (ऊपर) दिखा । spheroids काटा और एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में दाग थे-एफ के लिए संयुग्मित phalloidin-actin (ग्रीन) और DAPI के लिए नाभिक (नीला), तो एक 40X पानी उद्देश्य के तहत एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप पर imaged (नीचे) । सही पर अंडाकार आकृति एक लुमेन के सबूत से पता चलता है । स्केल बार्स ५० माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: माउस प्रोस्टेट organoids β-catenin के जंक्शनीय स्थानीयकरण दिखाओ । Spheroids 6 से काटा-दिन पुराने 3 डी संस्कृतियों सना हुआ, β-catenin और एक फ्लोरोसेंट डाई-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे थे, और एक 40X पानी उद्देश्य के तहत एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप पर imaged । प्रतिनिधि छवियाँ β-catenin के लिए immunostaining दिखाएँ (हरा, बाएँ), F-actin (लाल, मध्य), और DAPI (नीला). सही पैनल सभी 3 चैनल विलय दिखाती है । स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह कागज माउस प्रोस्टेट और व्यक्तिगत पालियों की पहचान के विच्छेदन के लिए तरीकों की रूपरेखा । यह भी वर्णित के लिए एक 3 डी संस्कृति में संवर्धन माउस प्रोस्टेट कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल है इन विट्रो विश्लेषण ।

विच्छेदन प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है (1) पूरे UGS बाहर की कटाई माउस और एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे व्यक्तिगत अंगों को अलग । प्रोस्टेट ऊतक बहुत छोटा है और UGS के आराम से घिरा हुआ है; इस प्रकार, यह व्यावहारिक रूप से शरीर गुहा से सीधे फसल के लिए असंभव है, जबकि पालियों के सभी चार जोड़े को बरकरार रखने की खरीद । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए माउस से पूरे UGS फसल और फिर प्रोस्टेट निकालने के लिए आगे बढ़ना । यह इस प्रोटोकॉल में भी महत्वपूर्ण है (2) एक समय पर फैशन में कदम प्रदर्शन लेकिन सावधानीपूर्वक रहते हैं । समय विच्छेदन के दौरान सार के क्रम में ऊतक गिरावट को कम करने के लिए है । विशिष्ट तकनीक माउस से UGS निकालने के लिए यहां वर्णित तेजी से विकल्प की तुलना में है और अत्यधिक की सिफारिश की है । पूरे विच्छेदन और पालि अलगाव प्रक्रिया आमतौर पर 35-40 मिनट लगते हैं, जो अधिक अभ्यास के साथ 25 मिनट के लिए कम किया जा सकता है । विच्छेदन का सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा UGS, जो कुल विच्छेदन समय का एक बड़ा अंश लेता आसपास के वसा की सफाई है । वसा सावधानी से कोई भी यह सुनिश्चित करने के लिए हटा दिया जाना चाहिए प्रोस्टेट के साथ रहता है, लेकिन यह गलती से इस प्रक्रिया में किसी भी प्रोस्टेट ऊतक खो नहीं करने के लिए बेहद सावधान रहना महत्वपूर्ण है । एक और महत्वपूर्ण कदम है (3) प्रोस्टेट पालियों के पृथक्करण से पहले मूत्रमार्ग को दूर नहीं । मूत्रमार्ग मूलतः आधार है जिस पर प्रोस्टेट पालियों के सभी चार जोड़े की व्यवस्था कर रहे है रूपों । यदि वे अभी भी मूत्रमार्ग, मूत्रमार्ग के संबंध में उनके स्थानिक वितरण के आधार पर संलग्न कर रहे हैं, तो पालियों की पहचान करने के लिए सबसे आसान है ।

अंडाकार आकृति संस्कृति प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है (1) नख़रेबाज़ ऊतक अच्छी तरह से । एक स्केलपेल के साथ प्रोस्टेट ऊतक नख़रेबाज़ एक थकाऊ कदम है, खासकर के बाद से प्रोस्टेट ऊतक एक चिपचिपा स्वभाव है । हालांकि, नख़रेबाज़ के रूप में संभव के रूप में छोटे ऊतक अधिकतम उपज प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । एक अंय आवश्यक कदम है (2) pipetting के बाद trypsinization और आकार के सिरिंज के माध्यम से पारित निर्दिष्ट पोस्ट-बेअसर । इन दोनों चरणों को सही ढंग से प्रदर्शन किया जाना चाहिए और दोहराया, यदि आवश्यक हो, इष्टतम सेल उपज को प्राप्त करने के लिए । अंत में, यह महत्वपूर्ण है (3) तहखाने झिल्ली ECM भी मोटी या बहुत पतली थाली नहीं है । यदि तहखाने झिल्ली ECM भी पतली (यानी, कम से १०० µ l/सेमी2), कोशिकाओं को अच्छी तरह से के बीच में उचित organoids में विकसित नहीं होगा, जहां जेल पतली हो जाएगा चढ़ाया जाता है । यह बहुत मोटी चढ़ाना (यानी, अधिक से अधिक २५० µ एल/cm2) तहखाने झिल्ली ठीक से जमना नहीं ECM और मीडिया में परिवर्तन के दौरान फिसलने में परिणाम होगा । अच्छी तरह के बीच में चढ़ाना सबसे भी जेल मोटाई को प्राप्त करने में मदद मिलेगी ।

वर्णित प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुसार थोड़ा संशोधित किया जा सकता है । उदर गुहा से UGS की निकासी के लिए तकनीक संदंश के साथ मूत्राशय पर एक फर्म पकड़ की आवश्यकता है । मूत्राशय भी भरा हुआ है मामले में, यह एक 1 मिलीलीटर सिरिंज और पतली (26G या समान) सुई, ऊतक निकालने के लिए शुरू करने से पहले एक उचित पकड़ सुनिश्चित करने के साथ मूत्राशय नाली महत्वपूर्ण है । ऊतक विच्छेदन प्रक्रिया भर में पंजाबियों या DMEM के साथ नम रखा जाना चाहिए । DMEM का उपयोग करना पसंद किया जाता है अगर ऊतक अंडाकार आकृति संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है । Lukacs एट अलद्वारा वर्णित के रूप में, चढ़ाना पहले कोशिकाओं की उप आबादी को अलग करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा काटा सेल निलंबन हल किया जा सकता है । 10.

विभिंन प्रोस्टेट पालियों के ऊतकवैज्ञानिक विशेषताओं इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित किया गया है, और एक के लिए इन दिशानिर्देशों का पालन करके स्वस्थ प्रोस्टेट ऊतक में पालियों की पहचान करने में सक्षम होना चाहिए । हालांकि, इस प्रक्रिया की कुछ सीमाएं हैं । हाइपरप्लासिया या आक्रामक ट्यूमर के मामलों में, उपकला आकृति विज्ञान बाधित है, जो यह काफी कठिन H & E धुंधला के आधार पर पालियों के बीच भेद करने के लिए कर सकते हैं । ऐसे उदाहरणों में, पालियों के पृथक्करण (के रूप में इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित) एंबेडिंग और धुंधलाना से पहले यदि पालि विशेष जानकारी की जरूरत है आवश्यक है । यहां तक कि स्वस्थ ऊतकों में, यह अक्सर पालियों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है क्योंकि वे शरीर रचना विज्ञान और प्रोटोकॉल में व्यापक परिवर्तनशीलता मौजूद है और अंतर अभिव्यक्ति हस्ताक्षर6। हालांकि, माउस प्रोस्टेट में पालियों को अलग करने की शोधों की प्रासंगिकता पर बहस हो सकती है, क्योंकि मानव प्रोस्टेट को पालियों में विभाजित नहीं किया जाता है । इसके बावजूद, माउस vivo मेंपीसीए का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा मॉडल रहता है, और कई माउस मॉडल14,15विकसित किया गया है । 3 डी संस्कृति विधि विशेष रूप से एक महत्वपूर्ण तकनीक है कि रोग के तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, अंडाकार आकृति संस्कृति विधि का एक चेतावनी बेसिन, जो आमतौर पर प्रोस्टेट कैंसर माउस मॉडल में Cre recombinase के लिए इस्तेमाल किया प्रमोटर है की अंतर अभिव्यक्ति पैटर्न से उठता है । बेसिन प्रमोटर मुख्य रूप से चमकदार और मध्यवर्ती कोशिकाओं में सक्रिय है, लेकिन बेसल कोशिकाओं7में नहीं । संस्कृति की स्थिति यहां वर्णित अंडाकार आकृति गठन को बढ़ावा देने के मुख्य रूप से बेसल और मध्यवर्ती कोशिकाओं से है, लेकिन नहीं चमकदार कोशिकाओं से10। इसलिए, परिणामस्वरूप संस्कृतियों वास्तव में Cre-व्यक्त और गैर Cre-व्यक्त spheroids का एक मिश्रण का उत्पादन (यानी, नियंत्रण और नॉक आउट spheroids का मिश्रण) । नतीजतन, विश्लेषण के दौरान, यह ब्याज की प्रोटीन के लिए immunostain के लिए महत्वपूर्ण है के लिए नॉक आउट organoids की पहचान और जीन दस्तक-बहिष्कार के आधार पर organoid व्यवहार पर निष्कर्ष आकर्षित ।

इन तरीकों का महत्व प्रोस्टेट कैंसर के अध्ययन में GEMMs का उपयोग कर के बहुआयामी अनुप्रयोगों में निहित है । विच्छेदन विधि वर्णित विस्तृत कदम है जो शोधकर्ताओं के लिए तेजी से और अधिक प्रभावी ढंग से राज्य निकालने के लिए सक्षम हो जाएगा है । विच्छेदन प्रक्रिया का अनुक्रम यह सुनिश्चित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है कि व्यक्तिगत पालियों को पहचाना और निकाला जा सकता है, यहां तक कि प्रोस्टेट विच्छेदों में न्यूनतम अनुभव के साथ उन लोगों द्वारा । संस्कृति को रेखांकित करने के लिए आगे प्रोस्टेट कैंसर के GEMM मॉडल का विश्लेषण किया जा सकता है । संस्कृति की स्थिति में वृद्धि और दोनों नियंत्रण और ट्यूमर कोशिकाओं के अस्तित्व के लिए अनुमति चाहिए । हमारे अनुभव में, हम सफलतापूर्वक GEMM है कि16एमपिन प्रदर्शन की स्थिति का इस्तेमाल किया है । उच्च ग्रेड ट्यूमर के साथ माउस राज्य भी अंडाकार आकृति संस्कृति विश्लेषण17के लिए इस्तेमाल किया गया है । नियंत्रण माउस spheroids एक भी गोलाकार आकृति विज्ञान का प्रदर्शन; हालांकि, spheroids प्रोस्टेट ट्यूमर कोशिकाओं से व्युत्पंन आकृति विज्ञान और उनके नवोत्पादित क्षमता के कारण व्यवहार में मतभेद प्रदर्शित कर सकते हैं । इसलिए, इन विट्रो में organoid व्यवहार का अध्ययन इन कोशिकाओं की विशेषताओं में एक विस्तारित देखो प्रदान करेगा, और संभवतः लाइव सेल इमेजिंग के माध्यम से वास्तविक समय में अंडाकार आकृति व्यवहार की टिप्पणियों.

अंत में, प्रोस्टेट विच्छेदन और संस्कृति इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों GEMMs शामिल अध्ययन के विभिंन प्रकार में शामिल किया जा सकता है सभी अनुप्रवाह अनुप्रयोगों में प्रोस्टेट कैंसर के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने के जारी है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, R01CA161018 से लालकृष्ण से अनुदान का समर्थन किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) World Precision Instruments MOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI medium Thermofisher Scientific 11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS) Thermofisher Scientific 11965-084
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 10438018
PBS (Phosphate buffered saline) Thermofisher Scientific 10010031
Collagenase Thermofisher Scientific 17018029 Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermofisher Scientific 25300054
DNase I Sigma-Aldrich 10104159001 ROCHE
Syringes and Needles Fisher Scientific
Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm Fisher Scientific 22-363-547
PrEGM BulletKit  Lonza CC-3166 Add all componenets, aliquot and store at -20 °C.
Matrigel membrane matrix Thermofisher Scientific CB-40234
Dispase II powder Thermofisher Scientific 17105041 Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३९ माउस प्रोस्टेट पालियों प्रोस्टेट विच्छेदन प्रोस्टेट प्रोटोकॉल प्राथमिक संस्कृति 3 डी संस्कृति माउस प्रोस्टेट spheroids
पहचान, ऊतकवैज्ञानिक लक्षण वर्णन, और के लिए माउस प्रोस्टेट पालियों के विच्छेदन इन विट्रो 3d अंडाकार आकृति संस्कृति मॉडल
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Nath, D., White, J. R., Bratslavsky, … More

Nath, D., White, J. R., Bratslavsky, G., Kotula, L. Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models. J. Vis. Exp. (139), e58397, doi:10.3791/58397 (2018).

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