Identifiering, histologiska karakteriseringen och dissektion av mus prostata lober för i Vitro 3D sfäroid kultur modeller

Summary

Genetiskt modifierade möss är användbara modeller för att undersöka mekanismer för prostatacancer. Här presenterar vi ett protokoll för att identifiera och dissekera prostata lober från en mus urogenitala systemet, skilja dem baserat på histologi, och isolera och kultur den primära prostata celler in vitro- som spheroids för nedströms analyser.

Abstract

Genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) fungera som effektiva prekliniska modeller för att undersöka de flesta typer av mänskliga cancerformer, inklusive prostatacancer (PCa). Förståelse för anatomi och histologi av mus prostata är viktigt för effektiv användning och korrekt karakterisering av sådana djurmodeller. Mus prostata har fyra distinkta par lober, alla med sina egna egenskaper. Denna artikel visar den korrekta metoden av dissektion och identifiering av mus prostata lober för sjukdom analys. Efter dissektion, prostata celler kan vara ytterligare odlade i vitro för mekanistisk förståelse. Sedan musen prostata primära celler tenderar att förlora sin normala egenskaper när odlade i vitro, vi redogöra här en metod för att isolera cellerna och växande dem som 3D sfäroid kulturer, som är effektiv för att bevara den fysiologiska egenskaperna hos cellerna. Dessa 3D kulturer kan användas för att analysera cellmorfologi och beteende i nära-fysiologiska förhållanden, utreda förändrade nivåer och lokaliseringar av viktiga proteiner och inblandade i utvecklingen och utvecklingen av en sjukdom, och tittar på Svaren till läkemedelsbehandlingar.

Introduction

Det vetenskapliga samfundet har försökt att belysa den komplex mekanismen för mänskliga cancerutveckling i årtionden. Identifiering av potentiella nyckelaktörer och målmolekyler börjar med patientens celler och vävnad studier, kräver translationell tillämpningen av sådana slutsatser ofta användning av prekliniska djurmodeller. Användning av genetiskt modifierade möss modeller (GEMMs) till modell mänskliga cancerformer har stadigt ökat sedan etableringen av mus-modeller av mänskliga cancerformer konsortiet (NCI-MMHCC), en kommitté som syftade till att beskriva och förena egenskaperna hos mus cancer modeller för forskare i hela världen^1,2. Musmodeller uppfylla behovet mekanistiska studier i prekliniska studier av de flesta typer av cancer, för att förstå utveckling, progression, svar till behandlingar, och förvärvade resistance³.

Prostatacancer är den vanligaste cancerformen hos män, som påverkar över 160 000 män varje år⁴. Aggressiva former av sjukdomen hävdar tiotusentals liv varje år. Men är mekanismen av progression av sjukdomen fortfarande bristfällig. Detta resulterar i en allvarlig brist på effektiva behandlingsalternativ för avancerad och metastaserad prostatacancer, vilket framgår av den höga dödligheten i avancerad prostatacancer patienter⁴. Därför finns det ett växande behov av prekliniska modeller för att studera prostatacancer. Dock på grund av de inneboende skillnaderna mellan mus och mänsklig prostatacancer, modellering av prostatacancer i GEMMs inte vinna popularitet tills det Bar Harbor klassificeringssystemet infördes 2004, vilket beskrivs histopatologiska förändringar i mus prostata vid genetisk manipulation, identifiering av neoplastiska förändringar och deras relation till stadier av cancer progression i människor⁵. Ett viktigt kännetecken av mus prostata som måste beaktas när de studerar någon prostata GEMM modell är förekomsten av fyra distinkta par lober: främre, laterala, ventrala och dorsala. Loberna presenterar betydande skillnader i histopatologi och gen uttryck mönster⁶. Probasin protein uttryck mönster kan variera mellan loberna i unga efter puberteten möss⁷, som måste beaktas eftersom Cre-baserade GEMM modeller är oftast utformade med hjälp av en probasin-baserade promotor kallas Pb-Cre4⁷. De resulterande rumsliga och tidsmässiga skillnaderna i Cre uttryck ofta leda till skillnader i tumör initiering och progression tidslinjer samt skillnader i neoplastiska förändringar mellan loberna. Därför är det viktigt att ta hänsyn till sådana skillnader medan de studerar tumörutveckling i prostata GEMMs och enskilda loberna behöva värderas separat för att få reproducerbara resultat. Den första delen av denna artikel beskriver de rätta metoderna för att dissekera en mus prostata, identifiera och avgränsa varje lob och erkänna histologiska skillnaderna mellan loberna.

Även analysen av tumörtillväxt och histopatologi kan ge värdefulla insikter i tumörutveckling, ger de inte mycket information om molekylära mekanismer. För att studera mekanismen för tumörutveckling och progression, är det ofta användbart att analysera tumör celler in vitro. Flera metoder har föreslagits under de åren som involverar kulturer av dessa celler, inklusive suspension kulturer, 3D kulturer⁸ och nyligen, regelbundna 2D kulturer⁹. Medan de flesta av dessa metoder leder till bra cell överlevnad och spridning priser, erbjuder 3D kulturer en miljö som är närmast fysiologiska förhållanden. I 3D eller sfäroid kulturer odlas i en basalmembranet extracellulär matrix (ECM), har fullt differentierade luminala cellerna oftast mycket låg överlevnad; basal och mellanliggande celler (mestadels stamceller) är dock kunna propagera och producera cell kluster kallas spheroids¹⁰. Detta gör den lämplig för en cancer studien eftersom epitelial cancer tros härröra från stamceller (populärt kallad cancerstamceller)¹¹. Den andra delen av detta protokoll beskriver en metod för att odla de mus prostata cellerna i 3D kulturer. De resulterande sfärerna kan användas för flera typer av nedströms analyser, inklusive studier av organoid morfologi och beteende av levande cell imaging, immunofluorescens färgning för olika proteiner, och studiet av Svaren till kemoterapeutiska behandlingar.

Övergripande, målet med detta protokoll är att beskriva optimala metoder för att använda musmodeller i prostatacancer genom att beskriva den anatomi och dissektion tekniker mus prostatacancer och behandling av vävnaden för sfäroid kulturer och in vitro- analys .

Protocol

Alla musen experiment beskrivs här utfördes enligt riktlinjerna i de institutionella IACUC-godkända protokollen vid SUNY Upstate Medical University.

1. urogenitala systemet (UGS) dissektion

Observera: Schematiskt presenteras i figur 1.

1. Avliva en 3-månad-gammal manlig C57BL/6 mus med hjälp av metoden CO₂ inhalational dödshjälp eller en annan godkänd teknik.
   Obs: Möss i åldrarna 3-12 månader kan användas framgångsrikt för experimentet. Äldre möss (> 6 månader) kommer troligen har mer fett runt den UGS, som kommer att rensas. Identifiering och separation av loberna är ofta svårt i möss som är yngre än 3 månader. Andra stammar kan användas för experimentet, liksom.
2. Placera musen på ryggen och säkra benen med pinnarna så att den ventrala sidan av djuret utsätts.
3. Spreja 70% etanol på musens buken och torka den ren.
   Obs: Rakning buken håret innan dissektion inte krävs.
4. Lyft huden från buken, tillsammans med muskellagrar, med ett par medium trubbig pincett och göra en inverterad Y-formade snitt på buken med sax.
   1. Först göra ett rakt snitt med en vass sax från strax ovanför penis till bröstbenet (figur 2a).
   2. Klipp från basen av snittet mot varje tå, upp till låren (figur 2b). Vik tillbaka huden på båda sidorna och i botten för att visa hela buken (figur 2 c-e).
      Obs: Den avskurna storleken varierar beroende av musen ålder och storlek. Storleken på det ursprungliga raka snittet varierar från 1,5 till 4 cm, beroende på storleken på musen.
5. Flytta över de andra organen att exponera UGS. Lyfta och flytta brun-gul tarmarna (figur 2f). Plocka upp de buk fett kuddar (den ogenomskinliga vit svampliknande vävnaden) med pincett och flytta dem till sidorna (figur 2 g).
   Obs: UGS består av sädesblåsor, urinrör, prostata, ductus deferens (sädesledaren), och urinblåsan. Det kan identifieras genom den karakteristiska par ogenomskinlig vit halvcirkelformade bågar (som är sädesblåsorna), med vätskefylld blåsa sac fäst till basen. Den genomskinliga vävnaden som ligger direkt under sädesblåsorna är prostatan.
6. Hitta UGS, stadigt hålla urinblåsan med trubbig pincett och lyfta det hela UGS uppåt från mus buken.
   Obs: Om blåsan är full Töm den först med en liten spruta att ge bättre grepp med tången och minska risken för spricker blåsan.
7. Fortsätter att dra upp på urinblåsan, skjut ett par sax under urinblåsan och prostata ända till ryggraden, och göra ett snitt. Skär igenom alla resterande anslutningar till bukhålan (figur 2 h och 2i). Var noga med att inte klippa för nära till UGS att undvika oavsiktlig kapning genom någon prostatavävnad.
   Obs: Samtidigt snittet under UGS, saxen ska sättas in hela vägen till baksidan av musen, så att snittet snaps kotpelaren samt. Denna metod resulterar i severing nästan alla anslutningar mellan UGS och bukhålan i ett klipp, minskar den tid som behövs för att extrahera vävnaden från musen.
8. Ta bort UGS och placera den i 2-6 mL (tillräckligt för att täcka vävnaden) av fosfat buffrad saltlösning (PBS) eller Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM, hög glukos) i en 6 cm petriskål (figur 2j och 2 k) och flytta den till dissektion Mikroskop (10 X förstoringen).
   Obs: Ändra dissekera media som behövs i de återstående stegen.

2. dissekera prostata

1. Avmarkera alla fett från både rygg- och ventrala sidorna med ett par fina pincett och lokalt sax (figur 3a). Använd liknande kirurgiska instrument för resten av protokollet dissektion.
   Obs: Fettet är ofta nära sammanflätade med de UGS (kan identifieras genom sin vita svampliknande utseende); Detta steg måste därför utföras noggrant för att undvika oavsiktligt snipping av någon prostatavävnad. Det kan ta upp till 10-15 min att rensa allt fettet.
2. Håll och dra blåsan med tången och knipsa det vid basen med saxen (figur 3b).
3. Placera den återstående vävnad ventrala Sidan upp. Håll en ductus deferens med pincett, spåra det till basen med sax, och klipp det (figur 3 c), sedan upprepa på andra sidan. Ta bort den ductus deferens, nu lämnar bakom prostatacancer (genomskinlig och NEDLUSAD), sädesblåsorna (ogenomskinlig och vit, semicircular) och urinröret (rosa-röd och ogenomskinlig tube) (figur 3d och 3e).
4. Sätt tången mellan inre bågen av sädesblåsor och prostata vävnad främre lober. Bänd isär sädesblåsorna och prostata och snip någon bindväv som behövs (figur 3f). Spåra sädesblåsorna till sin bas på urinröret och ta bort dem (figur 3 g och 3 h). Var noga med att inte punktera dem.
5. Fortsätt att dissekera ut enskilda prostata loberna.

3. Gross Anatomy av den prostata och enskilda LOB lokalt (siffror 3i-n, figur 4)

1. Vänd vävnaden med ett par trubbig pincett så att den dorsala sidan vänd uppåt, visar de dorsala lober, som kommer att likna en fjärils vingar.
2. Samla den dorsala loberna genom att hålla LOB med pincett och snipping vid basen med sax (figur 3j).
3. Vänd den återstående vävnaden ventrala sida.
4. Samla de laterala lober, som är små och oftast Linda urinröret på sida, som är inklämd mellan främre, ventrala och dorsala loberna (figur 3 k).
5. Nästa, samla de ventrala lober, som är större än den laterala loberna och ligga på urinröret ventralt (figur 3 l).
6. Sista, skörda de främre loberna, den största av fyrana, genom att skära och kasta urinröret (figur 3 m).
7. Bearbeta vävnaden bitarna enligt experimentella behov. Fortsätt till avsnitt 4 för histologi, eller avsnitt 5 för sfäroid kulturen.

4. LOB identifiering och morfologi från Hematoxylin och Eosin-färgade bilder

1. Fixa prostatavävnad och bädda in den i paraffin. Fortsätt med färgning bilderna med hematoxylin och eosin (H & E) för att visa och identifiera skillnader i prostata lober baserat på histologi, med de egenskaper som beskrivs av Oliveira et al. ¹² (figur 5).

5. bearbetning vävnaden för 3D kultur¹⁰

Obs: Detta beskrivs i figur 6.

1. Fortsätt med odling hela prostata eller enskilda loberna enligt de experimentella behov. Överföra prostatavävnad till en 10 cm maträtt innehållande 2-3 mL DMEM. Med en skalpell, finhacka de prostata tubuli som fint och jämnt som möjligt under mikroskopet dissektion.
2. Fortsätt med de återstående stegen under en vävnadskultur huv, under sterila förhållanden.
3. Överföra vävnad bitarna tillsammans med DMEM till en 15 mL tub och öka volymen till 9 mL med DMEM. Tillsätt 1 mL 10 x kollagenas stamlösning till DMEM-vävnad blandningen och vortex att blanda.
   Obs: Kollagenas stamlösning är 10 mg/mL i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, och den slutliga koncentrationen i 15 mL röret är 1 mg/mL.
4. Placera röret på en spindelkross skakapparat eller tube rotator för 2 h vid 37 ° C, för den kollagenas att försämra extracellulära matrisen.
5. Centrifugera röret vid 400 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
6. Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 2 mL varm 0,05% trypsin-EDTA klyva de cell-cell och cell-matrix sammanväxningar. Överföra röret till 37 ° C i 5 min.
   Obs: Om vävnad bitarna är för stor för att blanda väl, skär pipettspetsen med ett rakblad att göra en bredare bore.
7. Bryta upp någon vävnad klumpar genom pipettering med P1000 pipett 8 - 10 gånger och sedan upprepa med P200 pipett.
8. Neutralisera trypsin med 3 mL komplett DMEM. Lägga till 500 U av DNAase jag och blanda väl.
9. Passera genom en 5 mL spruta 5 - 10 gånger med en 18 G nål. Sedan passera genom 5 gånger med en 20 G nål.
10. Upprepa steg 4-8 en gång till om lösningen innehåller fortfarande stora vävnad bitar.
11. Filtrera cellsuspensionen genom 40 μm filter placeras på en 50 mL tub. Skölj 15 mL röret med 5 mL DMEM och passera genom samma filter. Upprepa sköljningen.
12. Kassera filtret och centrifugera röret som innehåller genomströmmande vid 400 x g under 5 minuter i rumstemperatur.

6. plätering och odla cellerna

1. Återsuspendera pelleten i 0,5 mL av komplett prostata epitelial Cell odlingsmedium (PrEGM). Räkna cell densiteten med hjälp av en cell counter eller hemocytometer och späd cellerna till 5 x 10⁵ celler/mL i fullständig PrEGM.
   Obs: Avkastningen från en 3-månad-gammal mus hela prostatan kan variera från 3 x 10⁵-10⁶ celler. Därför är det viktigt att initialt återsuspendera pelleten i högst 0,5 mL av PrEGM (som nämns ovan) så att önskad cell densiteten kan uppnås, även med låg avkastning.
2. Blanda volymen som krävs av celler med basalmembranet ECM i en 2:3 volymförhållandet (60% basalmembranet ECM och 40% cellsuspension) och plattan i en flera tallrik eller kammare bild enligt de experimentella behov.
   Obs: För immunfärgning, platta på glas-bottenplåtar eller kammare diabilder, som omfattar hela väl eller mitten av brunnen. Plåt runt kanten av brunnen om räknar den resulterande organoids eller platta som flera droppar över hela brunnen om plätering högre volymer. Var medveten om att inte sprida den för tjock eller för tunn. Plåt minst 100 µL av matriscellen blandningen per 1 cm² av plätering område. till exempel i en kammare bild med en 2 cm²-väl yta, 200 µL matriscellen blandning som innehåller 5 x 10⁴ celler bör vara klädd.
3. Överföra den platta bilden till en 37 ° C inkubator med 5% CO₂ för 30 min för basalmembranet ECM att stelna. Lägg sedan till pre värmde komplett PrEGM för att täcka brunnen, noga med att inte störa i basalmembranet ECM-kontakten.
4. Ta bort hälften av media och lägga till färska media varje 2-3 dagar. Odla spheroids 5-10 dagar.
5. Fortsätt med skörd (steg 7), immunfärgning (steg 8) och/eller imaging för nedströms tillämpningar.

7. skörd sfärernas

1. För att skörda sfärer, aspirera media noggrant utan att störa basalmembranet ECM gel kontakten och tillsätt 1 mL av 1 mg/mL dispase lösning i PrEGM per 100 µL av basalmembranet ECM.
   Obs: Det är lättare att skörda spheroids om de är klädd i mitten av brunnen eller kanten (i stället för som täcker hela brunnen), att säkerställa att en tillräcklig mängd dispase lösningen kan läggas till brunnen.
2. Skrapa botten av plattan med en cell skrapa att lyfta av basalmembranet ECM gelen i dispase-PrEGM lösningen.
3. Pipett hela lösningen uppåt och nedåt en gång med ett brett bore 1000 µL pipettspetsen eller 5 mL pipett att bryta upp gel kontakten i mindre bitar.
   Obs: Skär spetsen av en 1000 µL pipettspetsen med ett rakblad att göra ett stort genomlopp tips.
4. Inkubera i en 37 ° C inkubator med 5% CO₂ för 1-2 h tills basalmembranet ECM är helt upplöst.
   Obs: Detta kan säkerställas genom okulärbesiktning av väl botten medan luta plattan för att bekräfta att inga fler textsegment gel kvar.
5. Samla cellsuspensionen i en 15 mL koniska rör.
6. Centrifugera sfärer vid 250 x g i 5 min i rumstemperatur och fortsätta med efterföljande program.

8. immunfärgning av sfärer¹³

Obs: När spheroids har vuxit för önskad mängd tid, basalmembranet ECM kan upplösas och sfärer kan färgas enligt beskrivningen i Colicino et al. ¹³.

1. Kortfattat, skölj kulturerna med PBS och lägga till 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) direkt på basalmembranet ECM gel kontakten. Inkubera i 30-90 min i rumstemperatur med långsam skakning, tills basalmembranet ECM är helt upplöst, ersätta färsk PFA varje 30 min.
   Obs: PFA kommer lös gel kontakten och fixa spheroids under denna process.
2. Nästa, tvätta med PBS 3 gånger och Lägg ammoniumklorid 50 mM för 10 min att släcka någon autofluorescens från PFA. Upprepa för 3 tvättar med PBS.
3. Permeabilize med 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel för 5 min och block med PBSAT (PBS, 1% BSA, 0,5% Triton x-100) för 30 min.
4. Inkubera med en primär antikropp i PBSAT över natten vid 4 ° C, följt av 3 tvättar med PBSAT och en sekundär antikropp i PBSAT för 2 h i rumstemperatur.
5. Upprepa tvättarna med PBSAT och fläcken med DAPI enligt tillverkarens protokollet, om så önskas. Tvätta 3 eller fler gånger med PBS.
6. Lägg till PBS med 200 mM 1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktan (DABCO) antifade reagens och vidare till imaging.

Representative Results

Mus prostata loberna kan identifieras och dissekerade använder sina platser med avseende på sädesblåsorna och urinröret. Mus prostatan består av 4 par lober beläget dorsalt och ventralt till sädesblåsorna och urinröret. Figur 4a och 4b (överst) visar vyerna dorsala och ventrala intakt prostatacancer, tillsammans med sädesblåsorna och urinröret. Nedre panelerna (figur 4 c och 4 d) visar olika loberna beskrivs för identifiering. Lober kan separeras från möss så unga som 3 månader.

De olika prostata loberna skiljer sig avsevärt i histologi (figur 5). Alla mus prostata loberna består av flera körtel profiler består av en lumen omgiven av sekretoriska epitelceller; form av loberna, organisation av cellerna, och naturen av secretionen varierar dock från LOB till LOB. Identifierande egenskaper från H & E-färgade mus prostata har beskrivits effektivt av Oliveira et al. ¹², beskrivs kortfattat här. Främre loberna har måttliga till stora acini med täta infoldings och starkt eosinofil sekretion. Dorsala lober visas som främre med eosinofil sekretion men har mycket mindre acini och mindre infoldings. Laterala loberna har små till stora acini, med karaktäristiska platta luminala gränser och eosinofil sekretion. Ventrala lober är strukturellt som laterala lober, också med platt luminala gränser, men har en unik blek icke-eosinofil luminala utsöndring.

Mus prostata celler kan vara odlade som spheroids i basalmembranet ECM och uppvisar epitelial-liknande egenskaper. Detta beskrivs som en schematisk Figur6. Cellerna var isolerade från mus prostatan som beskrivs ovan och odlade i basalmembranet ECM. Cellerna börjar växa in i organoids i så tidigt som 4 dagar av kultur. Figur 7 (överst) visar representativa fält från 8 dagar gamla kulturer visar organoids i basalmembranet ECM. De ovan nämnda kultur villkor växa de flesta av cellerna till solid sfärer, med en bråkdel har en partiell eller fullständig lumen inuti. Dessa organoids har oftast en även sfäriska morfologi. Organoids skördades och immunostained som beskrivs i Colicino et al. ¹³. figur 7 (nedre panelen) visar en organoid utan en lumen (vänster) och med en lumen (höger), färgade med phalloidin (F-aktin markör, grön) och DAPI (nucleus, blå). Β-catenin är en cell cell adhesion markör starkt uttryckt på cell-cell gränssnitt i epitelceller. Figur 8 visar stark β-catenin färgning (grön) cell-cell knytpunkter i spheroids som samtidig lokaliserar med F-aktin (röd). Spheroids också uttrycka cytokeratin 5, cytokeratin 8, p63 och androgen receptor proteiner, som styrker att spheroids faktiskt härrör från celler med ursprung i prostata¹⁰.

Figur 1: Schematisk flödesschema visar dissekering av mus urogenitala systemet och isolering av prostatan. Flödesschema avsnitten för protokollstegen beskrivs i 1-2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: dissekering av musen UGS. Steg för steg bilder från dissektion av UGS från en 3-månad-gammal mus: (en och b) att göra snitt, (c-e) dra tillbaka huden för att exponera buken, (f) skifta i tarmarna, (g) flyttar de buk fett kuddar, (h och jag) extrahera UGS från den bukhålan, (j) den extraherade UGS, (k) den extraherade UGS med olika organ och vävnader märkas enligt följande: SV (gul) = sädesblåsorna; P (röd) = prostata; F (lila) = fett; V (ljusblå) = sädesledaren; och B (grön) = urinblåsan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: dissektion av mus prostata. Steg för steg bilder för dissektion av mus prostata från UGS: (a) ta bort fett, (b) ta bort urinblåsan, (c) ta bort den sädesledaren, d ventral vy av prostata med urinröret, (e) dorsala uppfattning av prostata med urinröret, (f-h) ta bort sädesblåsorna, (i) ventral vy av de prostata, (j) dissekera en dorsal LOB, (k) dissekera en laterala loben, (l) dissekera en ventrala LOB, (m) dissekera en främre loben och (n) dissekerade prostata lober: främre = AP, dorsala = DP, laterala = LP och ventrala = VP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: anatomi av mus prostata loberna. Representativa bilder från 3-månad-gammal mus UGS efter avlägsnande av fett, urinblåsan och sädesledaren. Bilderna visar prostata lober med sädesblåsorna och urinröret, med dorsala (a och c) och ventrala (b och d) utsikt. Topp paneler (en och b) visar orörd bilder, och bottenpaneler (c och d) visar loberna beskrivs i blå (dorsala), röd (främre), gul (ventrala) och grön (sido). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: olika prostata loberna varierar avsevärt i histologi. Här är ett H & E-färgat hela prostata bild visar sädesblåsorna, urinröret och prostata fyra loberna. Lober beskrivs i orange (främre), blå (dorsala), grön (sido) och svart (ventrala). Infällt: representativa bilder från varje lob, tagna under en 10 x mål. Skalstapeln representerar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 6: Schematisk flödesschema visar matsmältningen av prostata och efterföljande sfäroid kulturer. Flödesschema för protokollstegen beskrivs i avsnitt 5 och 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: prostata celler växer till även sfäriska spheroids med eller utan en lumen. Prostatavävnad skördas från en vild typ 3-månad-gammal mus var odlade enligt protokollet. Kulturer var avbildad på en platta imager under ett 4 X-objektiv, på 8 dagar efter kultur, visar bildandet av spheroids (överst). Spheroids var skördas och målat som beskrivs i protokollet med ett fluorescerande färgämne-konjugerad phalloidin för F-aktin (grön) och DAPI för kärnor (blå), sedan avbildas på en snurrande bricka confocal Mikroskop under en 40 X vatten mål (nederst). Sfäroid till höger visar tecken på en lumen. Skala staplarna representerar 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8: de mus prostata organoids Visa Junktional lokalisering av β-catenin. Spheroids skördas från 6 dagar gamla 3D kulturer var fläckig, använder en primär antikropp mot β-catenin och ett fluorescerande färgämne-konjugerad sekundär antikropp och avbildas på en snurrande bricka confocal Mikroskop under en 40 X vatten mål. Representativa bilder visar immunfärgning för β-catenin (grön, vänster), F-aktin (röd, mellersta) och DAPI (blå). Den högra panelen visar alla 3 kanaler samman. Skalstapeln representerar 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta dokument beskriver metoder för dissekering av mus prostatan och identifiering av enskilda lober. Beskrev också är protokollet för odling mus prostata celler i en 3D kultur för in vitro- analys.

Ett avgörande steg i protokollet dissektion är (1) skörd den hela UGS ur musen och separera de enskilda organen i dissektion Mikroskop. Prostatavävnad är mycket liten och omgiven av resten av UGS; Därför är det praktiskt taget omöjligt att skörda organ direkt från kroppshålan medan koppleri alla fyra par lober intakt. Därför är det viktigt att skörda den hela UGS från musen och sedan fortsätta att extrahera prostatan. Det är också viktigt i detta protokoll till (2) utför steg i tid men förbli minutiös. Tiden är knapp under dissektion för att minimera vävnad nedbrytning. Den specifika teknik som beskrivs här för att extrahera UGS från musen är snabbare jämfört med alternativen och rekommenderas varmt. Hela förfarandet vid dissektion och LOB isolering tar vanligtvis 35-40 min, vilket kan sänkas till 25 min med mer övning. Den mest utmanande delen av dissektion är rengöring fett kring de UGS, som tar upp en stor del av fullständig dissekering tid. Fettet avlägsnas noggrant för att se till att inget av det kvar med prostatan, men det är viktigt att vara extremt noga med att inte av misstag förlorar någon prostatavävnad i processen. Ett annat viktigt steg är (3) ta inte bort urinröret innan separationen av prostata loberna. Urinröret i huvudsak utgör basen på vilken alla fyra par prostata lober är ordnade. Det är lättast att identifiera loberna om de fortfarande är knutna till urinröret, baserat på deras rumsliga fördelning med avseende på urinröret.

Ett avgörande steg i protokollet sfäroid kultur är (1) skräder vävnaden väl. Malning prostata vävnaden med en skalpell är en långtråkig steg, särskilt eftersom prostatavävnad har en klibbig natur. Men är malning vävnaden så små som möjligt avgörande för att få maximal avkastning. Ett annat viktigt steg är (2) pipettering efter trypsinization och passerar genom sprutor med storlekarna som anges post-neutralization. Båda dessa steg måste utföras korrekt och upprepas vid behov, att uppnå optimal cell avkastning. Det är slutligen viktigt (3) inte att plattan basalmembranet ECM för tjock eller för tunn. Om basalmembranet ECM är pläterade alltför tunn (dvs., mindre än 100 µL/cm²), cellerna växer inte in i rätt organoids i mitten av brunnen, där gelen kommer att vara den tunnaste. Plätering det för tjock (dvs., mer än 250 µL/cm²) kommer att resultera i basalmembranet ECM inte stelnar ordentligt och glida av under byte av media. Plätering i mitten av brunnen kommer att bidra till att uppnå de mest även gel tjocklek.

Protokollet beskrivs kan ändras något enligt experimentella behov. Tekniken för utvinning av UGS från bukhålan kräver ett fast grepp på urinblåsan med pincett. Om blåsan är för full, det är viktigt att tömma blåsan med en 1 mL spruta och tunn (26G eller liknande) nål, att säkerställa en korrekt grepp innan du börjar att extrahera vävnaden. Vävnaden ska hållas fuktig med PBS eller DMEM genom dissektion processen. Det är rekommenderad att använda DMEM om vävnaden kommer att användas för sfäroid kulturer. Skördade cellsuspensionen kan sorteras av flödescytometri att isolera delpopulationer av celler före plätering, om så önskas, som beskrivs av Lukacs et al. ¹⁰.

Histologiska egenskaper hos olika prostata loberna har beskrivits i detta protokoll, och man bör kunna identifiera loberna i frisk prostatavävnad genom att följa dessa riktlinjer. Det finns dock vissa begränsningar av processen. I fall av hyperplasi eller aggressiva tumörer, är epitelial morfologi störd, vilket kan göra det betydligt svårare att skilja mellan loberna baserat på H & E färgningen. I sådana fall, separation av lober (som beskrivs i detta protokoll) innan inbäddning och färgning är nödvändigt om LOB-specifik information behövs. Även i frisk vävnad är det ofta nödvändigt att analysera lober separat eftersom de presentera brett variationer i anatomi och histologi och har differential uttryck signaturer⁶. Dock kan translationell relevansen av att avskilja lober i mus prostata diskuteras, eftersom mänskliga prostatan inte delas in i lober. Trots detta musen är fortfarande den bästa modellen att studera PCa i vivo, och flera musmodeller har varit utvecklade^14,15. Metoden 3D kultur är särskilt en viktig teknik som kan användas för att undersöka mekanismer av sjukdomen. En varning för metoden sfäroid kultur uppstår emellertid från differentiell uttrycksmönstret av probasin, vilket är vanligt förekommande arrangören för Cre recombinase i prostatacancer musmodeller. Probasin arrangören aktiveras huvudsakligen i luminala och mellanliggande celler men inte i basala celler⁷. De kultur-villkor som beskrivs här främja sfäroid bildas huvudsakligen från basal och mellanliggande celler, men inte från luminala celler¹⁰. Därför, de resulterande kulturerna faktiskt producera en blandning av Cre-uttryckande och icke-Cre-uttryckande spheroids (dvs., en blandning av kontroll och knock-out spheroids). Som ett resultat under analys är det viktigt att immunostain för proteinet av intresse att identifiera knock-out organoids och dra slutsatser om organoid beteende baserat på genen knock-outs.

Betydelsen av dessa metoder ligger i de mångfacetterade program att använda GEMMs i prostatacancer studier. Dissektion metoden beskrivs har detaljerade steg som kommer att göra det möjligt för forskare att extrahera prostata snabbare och mer effektivt. Sekvensen av dissektion processen är utformad för att säkerställa att enskilda lober kan identifieras och utdraget, även av dem med minimal erfarenhet i prostata dissektioner. Metoden kultur som beskrivs kan användas för att ytterligare analysera GEMM modeller av prostatacancer. Kultur villkoren bör möjliggöra tillväxt och överlevnad av både kontroll och tumör celler. Vår erfarenhet har vi framgångsrikt använt GEMM prostata som uppvisar mPIN¹⁶. Mus prostata med högre grad tumörer har också använts för sfäroid kultur analys¹⁷. Kontroll mus spheroids uppvisar en ännu sfäriska morfologi; spheroids härrör från prostata tumörceller visar dock kan skillnader i morfologi och beteende på grund av sin neoplastiska potential. Därför studerar organoid beteende in vitro- kommer att ge en förlängd undersöka egenskaperna hos dessa celler, och möjligen observationer av sfäroid beteende i realtid via live-cell imaging.

Sammanfattningsvis, kan den prostata dissektion och kultur metoder som beskrivs i detta protokoll införlivas i olika typer av studier på GEMMs för att fortsätta att tillhandahålla information om prostatacancer i alla efterföljande program.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI medium	Thermofisher Scientific	11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS)	Thermofisher Scientific	11965-084
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	10438018
PBS (Phosphate buffered saline)	Thermofisher Scientific	10010031
Collagenase	Thermofisher Scientific	17018029	Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
Syringes and Needles	Fisher Scientific
Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	Add all componenets, aliquot and store at -20 °C.
Matrigel membrane matrix	Thermofisher Scientific	CB-40234
Dispase II powder	Thermofisher Scientific	17105041	Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C