Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In vitro-allestedsnærværende og Deubiquitinationassays af Nukleosomale histoner

Published: July 25, 2019 doi: 10.3791/59385
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System
* These authors contributed equally

Summary

Allestedsnærværende er en post-translationel modifikation, der spiller en vigtig rolle i cellulære processer og er tæt koordineret af deubiquitination. Defekter i begge reaktioner ligger til grund for humane patologier. Vi leverer protokoller til gennemførelse af allestedsnærværende og deubiquitination reaktion in vitro ved hjælp af rensede komponenter.

Abstract

Allestedsnærværende er en post-translationel modifikation, der spiller en vigtig rolle i forskellige signalering veje og er især involveret i koordineringen af kromatin funktion og DNA-associerede processer. Denne ændring indebærer en sekventiel handling af flere enzymer, herunder E1 ubiquitin-aktivering, E2 ubiquitin-konjugering og E3 ubiquitin-Ligase og er vendt af deubiquitinaser (DUBs). Allestedsnærværende inducerer nedbrydning af proteiner eller ændring af protein funktion, herunder graduering af enzymatisk aktivitet, protein-protein interaktion og subcellulær lokalisering. Et kritisk skridt i at påvise protein allestedsnærværende eller deubiquitination er at udføre in vitro-reaktioner med rensede komponenter. Effektive allestedsnærværende og deallesteds nærværende reaktioner kunne i høj grad påvirkes af de forskellige anvendte komponenter, enzym Co-faktorer, buffer betingelser og arten af substratet.  Her giver vi trin-for-trin protokoller for at gennemføre allestedsnærværende og deubiquitination reaktioner. Vi illustrerer disse reaktioner ved hjælp af minimale komponenter af musen polycomb repressive kompleks 1 (PRC1), BMI1, og RING1B, en E3 ubiquitin ubiquitinligase, at monoubiquitinates Histon H2A på lysin 119. Deubiquitination af nukleosomal H2A udføres ved hjælp af et minimalt Polycomb repressive Deubiquitinase (PR-DUB) kompleks dannet af den humane deubiquitinase BAP1 og DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domæne af dets co-faktor ASXL2. Disse allestedsnærværende/deubiquitination assays kan udføres i forbindelse med enten rekombinante nukleosomer rekonstitueret med bakterier-oprenset proteiner eller indfødte nukleosomer renset fra pattedyrceller. Vi fremhæver de snørklede, der kan have en betydelig indvirkning på disse reaktioner, og vi foreslår, at de generelle principper i disse protokoller hurtigt kan tilpasses andre E3 ubiquitin ligaser og deubiquitinaser.

Introduction

Allestedsnærværende er en af de mest bevaret post-translationelle modifikationer og er afgørende for en bred vifte af organismer, herunder gær, planter og hvirveldyr. Allestedsnærværende består af den kovalente fastgørelse af ubiquitin, et stærkt bevaret 76 aminosyre polypeptid, til at målrette proteiner og forekommer i tre sekventielle trin, der involverer tre enzymer, nemlig E1-aktivering, E2-konjugering og E3 ubiquitinligase1, 2,3. Denne post-translationelle modifikation spiller centrale roller i et bredt spektrum af biologiske processer. Faktisk, de E3 ligaser, som giver specificiteten af reaktionen, udgør en stor super familie af enzymer og er de mest rigelige enzymer i ubiquitin system4,5,6. De efterfølgende virkninger af protein allestedsnærværende afhænger af ændringens art: monoubiquitination, multi-monoubiquitination og lineær eller forgrenet polyubiquitination. Monoubiquitination er sjældent forbundet med proteasomal nedbrydning, men i stedet denne modifikation er involveret i mætning forskellige signalering begivenheder. Polyubiquitination involverer N-terminalen eller lysinrester i ubiquitin-molekylet, og skæbnen for et polyubiquiteret protein afhænger af, hvilke rester der er involveret i ubiquitin-kæde udvidelsen. Det har længe været kendt, at polyurethan, der er medieret af lysin 48 af ubiquitin, inducerer proteasomal nedbrydning. Tværtimod, polyubiquitination via lysin 63 af ubiquitin er ofte forbundet med protein aktivering7,8,9. Ligesom andre vigtige post-translationelle modifikationer er allestedsnærværende, reversibel og ubiquitin fjernelse fra proteiner er sikret ved specifikke proteaser betegnet deubiquitinaser (DUBs), som er dukket op som vigtige regulatorer af cellulære processer 2 , 10. vigtigere, mange Dubs er højt specialiserede, og regulere, gennem deubiquitination, specifikke substrater, hvilket indikerer, at en fin balance mellem allestedsnærværende og deubiquitination er afgørende for protein funktion. E3s og DUBs udgør sammen med proteasomet nedbrydnings maskiner og tilbehørs faktorer det Ubiquitin Proteasomet system (UPS, med > 1200 gener), som regulerer større signalveje, hvoraf flere er forbundet med cellevækst og-spredning. celle skæbne beslutsomhed, differentiering, celle migration, og celledød. Vigtigere, deregulering af flere signalering kaskader involverer allestedsnærværende fremmer tumor og neurodegeneration sygdomme5,11,12,13, 14.

Allestedsnærværende roller spiller en Pervasive rolle i kromatin biologi og DNA-afhængige processer15,16,17. For eksempel er monoubiquitination af Histon H2A på lysin 119 (herefter H2A K119ub) en kritisk post-translationel modifikation, der er involveret i transkriptional undertrykkelse og DNA-reparation18,19,20, 21,22. H2A K119ub katalyseres af Polycomb repressive Complex 1 (PRC1), som spiller en central rolle i vedligeholdelsen af epigenetiske oplysninger og er stærkt bevaret fra Drosophila til menneske. Canonical PRC1 består især af RING1B og BMI1, som er det centrale E3 ubiquitin ubiquitinligase-kompleks, der er ansvarlig for ovennævnte allestedsnærværende arrangement22,23. I Drosophila, H2A monoubiquitination (H2A K118ub som svarer til H2A K119ub i pattedyr) er vendt af dub Calypso, som interagerer med ekstra sexkam (ASX) danner polycomb-repressive Dub (pr-Dub) kompleks24. Den pattedyr ortholog af Calypso, BAP1, er en tumor suppressor slettet eller inaktiveret i forskellige humane maligniteter25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 regulerer DNA-afhængige processer i kernen og calcium-Signaling-medieret apoptose ved endoplasmatiske reticulum33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 samler multi-subunit protein komplekser, der indeholder transkriptionsregulatorer, især ASXL1, ASXL2 og ASXL3 (asxls), tre orthologues af ASX38,43. Asxls brug deubiquitinase adapter (deubad) domæne, også kaldet asxm domæne, at stimulere BAP1 dub aktivitet35,36,44. Derfor, ASXLs spille vigtige roller i koordineringen BAP1 DUB aktivitet på kromatin og mere generelt sin tumor suppressor funktion.

Der findes flere metoder til at studere allestedsnærværende og deubiquitination processer. Især biokemiske assays, som anvender proteiner, som er renset for bakterier, er fortsat meget kraftige i demonstrationen af direkte allestedsnærværende eller fjernelse af ubiquitin fra specifikke substrater. Disse eksperimenter kan udføres for at undersøge en række parametre såsom fastsættelsen af kravet om minimal komplekser, bestemmelse af reaktioner kinetik, definere struktur/funktion relationer, og forstå virkningen af patologiske genmutationer. Her tilbyder vi protokoller til at udføre allestedsnærværende og deubiquitination reaktioner på kromatin substrater med rensede komponenter. Som model system præsenteres in vitro -allestedsnærværende og deubiquitination af nukleosomal H2A protein. Bakterier-rensede proteiner samlet i minimale komplekser af RING1B/BMI1 og BAP1/DEUBAD anvendes til allestedsnærværende eller deubiquitination af henholdsvis nukleosomal H2A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. GSH-agopstået affinitet rensning af GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 Ubiquitin Ligase Complex

  1. Brug pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa)-bakterie udtryks konstruktionen til at omdanne BL21 (DE3) bakterier (Se tabel over materialer)23. Denne konstruktion tillader ekspression af murine RING1B Domain 1-159 smeltet til BMI1 domæne 1-109 med GST-tag i pGEX-6P-2 backbone.
  2. Udfør en overnatning starterkultur ved inokulerende RIL-bakterier udtrykker GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109 AA) i 20 mL af LB bouillon medium i tilstedeværelse af 100 μg/mL ampicillin og 50 μg/mL chloramphenicol. Inkuber ved at ryste ved 37 °C natten over. På den næste dag tilsættes start kulturen til en 1 L kolbe indeholdende 500 mL frisk LB bouillon medium (1/26 fortynding) med ampicillin og Inkuber kulturen i rysteapparatet ved 37 °C i 2 til 4 timer.
  3. I inkubationstiden måles OD ved 600 nm med et spektrofotometer. Når bakterie kulturen når 0,6 OD-enheder ved 600 nm, tages en 1 mL alikvot i et 1,5 mL rør som den ikke-inducerede prøve. Tilsæt 400 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til 1 L-kulturen for at inducere protein ekspression. Inkuber bakterier ved 25 °C i 6 timer til overnatning.
    1. 1 mL-aliquoterne centrifugeres ved 14.000 x g i 30 s, kassér supernatanten, resuspension af pellet i 200 ΜL Laemmli-prøve buffer, og hold for SDS-side og Coomassie blå analyse af protein induktion.
  4. Overfør den inducerede bakteriekultur fra kolben til en ren Centrifugerings flaske, og drej ned ved 3.500 x g i 15 minutter ved 4 °c. Supernatanten kasseres og resuspenderes pellet med 40 mL kold PBS og centrifugerer ved 3.500 x g i 15 minutter ved 4 °c.
  5. Kassér supernatanten og fryse pellet ved-80 °C eller Fortsæt til næste trin. Hvis proteinerne induceres ved den forventede molekylvægt, fortsættes til næste trin.
  6. Resuspension af bakterie pellet i 25 mL iskold lyse buffer A (50 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% NP40, 1 mm pmsf, 0,5 mm dtt og 1/100 anti proteasecocktail indeholdende AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin og Pepstatin A). Sørg for, at alle bakterie pellet er ophængt. PMSF og anti-protease cocktail skal tilsættes frisk til lyse bufferen, kun på tidspunktet for bakterie lyse.
    Forsigtig: Opbevar altid prøven på is.
    Bemærk: Lysozym på 100 μg/mL kan tilsættes for at øge bakterie lyse.
  7. Inkubér bakterie lyatet på is i 15 min. Brug en Probe sonicator og sonikér ved 70% output amplitude for 30 s (4 – 5x), og centrifuger derefter ved 21.000 x g i 20 minutter ved 4 °c.
    Forsigtig: Under sonikering, holde altid prøverne på is.
  8. I løbet af Centrifugerings tidspunktet tages 500 μL pakkede GSH-agaded perler (50% gylle) i et 15 mL rør og tilsættes 10 mL buffer a uden pmsf og anti-proteaser. Bland kort og spin ved 2.500 g i 3 minutter ved 4 °C, Gentag dette vaske trin to gange mere og hold perlerne på is.
  9. Efter bakterie-lysat centrifugering opsamles supernatanten og overføres den til et 50 mL konisk rør. Tag en alikvot på 100 μL som et samlet lyssæt, og tilsæt 100 μL 2x Laemmli-prøve buffer til SDS-side og Coomassie Blue-analyse.
  10. Filter lysatet gennem 0,45 μm pore sprøjte filter og bland det med GSH perler. Inkuber ved 4 °C med omrystning i 5 timer. Drej perlerne ned ved 2.500 x g i 3 min., Fjern, og Gem supernatanten som strømmen igennem. Vask proteinerne-GSH bundne perler 6 gange (5 mL hver) med buffer A indeholdende anti-proteasecocktail og pmsf.
  11. Efter den sidste vask, overføre perlerne sammen med 10 mL buffer i en tom kromatografikolonne, tilsæt 1,5 mL buffer A indeholdende 25 mm glutathion, og indsamle eluering af tyngdekraften i 1,5 ml mikrorør. Gentag elueringsproceduren 4 gange.
    Bemærk: Glutathion stamopløsning er fremstillet ved 200 mM koncentration i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5
  12. Tag en alikvot på 10 μL fra hver af de 4 elutioner, og tilsæt 10 μL 2x Laemmli-prøve buffer. Disse prøver vil blive anvendt til SDS-side og Coomassie blå analyse for at bestemme tilstedeværelsen og renheden af de rensede proteiner.
    Bemærk: Efter den sidste eluering, opbevares perlerne i buffer ved 4 °C til genbrug og fremtidig brug.
  13. Vælg de eluede fraktioner, der viser rimelige mængder af rensede proteiner til yderligere analyse. Lav små aliquoter af præparatet. De oprensede proteiner opbevares i-80 °C. Normalt vil proteinkoncentrationen variere fra 0,5 μg til 2 μg pr. μL, og prøverne kan lagres i denne tilstand.
  14. Valgfrit: Koncentrer prøve eller Skift buffer ved hjælp af en 10K centrifugal filterenhed

2. rensning af BAP1/DEUBAD (ASXL2) Deubiquitinase-komplekset

  1. Brug pET30a +-His-BAP138 og PDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 bakterielle udtryks KONSTRUKTIONER til at omdanne BL21 (DE3) RIL bakterier til produktion af henholdsvis hans-BAP1 og MBP-deubad.
  2. Udfør to separate start kulturer med overnatning ved at inkube hans-BAP1 og MBP-DEUBAD (ASXL2), der udtrykker bakterier i 20 ml lb-bouillon af ampicillin medium indeholdende 50 μg/ml chloramphenicol og det tilsvarende antibiotikum for hvert plasmid, 100 μg/ mL af henholdsvis kanamycin eller 100 μg/mL ampicillin. Placer på shaker ved 37 °C.
  3. Udfør trin 1.3 – 1.6.
  4. Resuspension af bakterierne pellets i 25 mL iskold lyse buffer B (50 mM Tris pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM β-mercaptoethanol, 0,2% Triton X-100, 1 mM PMSF og 1/100 anti-protease cocktail). Bland lige store mængder af hans-BAP1 med MBP-deubad lysater og Inkuber på is i 15 min. sonikér og centrifuger derefter lysatet som angivet i protokol 1 (trin 9).
    1. Under centrifugeringen forberedes 500 μL pakkede ni-NTA agaded perler (50% gylle) ved at vaske dem tre gange med buffer B uden pmsf og anti-protease cocktail.
  5. Efter bakterie-lysat centrifugering opsamles supernatanten og overføres den til et 50 mL konisk rør. Tag en alikvot på 100 μL som et samlet lyssæt, og tilsæt 100 μL 2x Laemmli-prøve buffer til SDS-side og Coomassie Blue-analyse.
  6. Filter lysatet gennem 0,45 μm pore sprøjte filter og bland det med ni-NTA perler. Inkuber ved 4 °C med omrystning i 5 timer. Drej perlerne ned ved 2.500 x g i 3 min., Fjern, og Gem supernatanten som strømmen igennem.
    1. Vask perlerne 6 gange (5 mL hver) med buffer B indeholdende 20 mm 1, 3-Diaza-2,4-cyclopentadien (imidazol).
      Bemærk: lav en stamopløsning på 2 M imidazol ved pH 7,3.
  7. Efter den sidste vask, Overfør perlerne med 10 mL buffer til en tom kromatografikolonne, tilsæt 1 mL buffer B indeholdende 200 mm imidazol og saml Elueringen med tyngdekraften i 1,5 ml mikrorør, der indeholder 10 ΜL dtt (500 mm) og 2 ΜL edta (500 mm , pH: 8). Gentag elueringsproceduren 4 gange. Tag 10 μL af hver elueringsfraktion, og tilsæt 10 μL 2x Laemmli-prøve buffer til SDS-PAGE-og Coomassie Blue-analyse. Samle de ønskede elueret fraktioner.
    Bemærk: Opbevar perlerne i buffer ved 4 °C til genbrug og fremtidig brug.
  8. Det elueret kompleks fortyndes 3 gange med buffer C (50 mM Tris pH 7,3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, og 1/100 proteasehæmmer cocktail) før inkubation med amyloseholdig-agmet perler.
    1. Forbered amyloseholdig agopstået perler (500 μL pakket) ved at vaske dem 2 gange med buffer C uden at tilføje pmsf og anti-protease cocktail. Tilsæt perlerne til den fortyndede elueringsvæske, og Inkuber natten over ved 4 °C.
  9. Centrifuge ved 2.500 x g i 3 min. og holdstrømmen igennem. Vask proteiner-bounds perler med 5 mL buffer C (5 – 6x).
  10. Opbevar det rensede hans-BAP1/MBP-DEUBAD Complex på amyloseholdig aghas perler i buffer D (50 mm Hepes pH 8,0, 50 mm NaCl, 10% glycerol og 1 mm DTT) og opbevares ved-80 °c. Tag 20 μL af perlerne fraktion (50% perler opløsning) og tilsæt 20 μL 2x Laemmli prøve buffer til SDS-side og Coomassie blå analyse.

3. rensning af Nukleosomerne fra HEK293T celler

  1. Kultur HEK293T celler i komplet Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 5% nyfødte kalv serum (NBS), 2 mM L-glutamin og 1% penicillin/streptomycin.
  2. Plade omkring 12 x 106 HEK293T celler i 20 ml komplette medier pr 15 cm kultur skål en dag før transfektering (10 retter blev brugt). Før transfection ændres cellens medium til 12 ml serumfrit medium og transficere cellerne med 21 μg pcdna-flag-H2A med 63 μl polyethylenimin (PEI) ved 1 mg/ml36. Skift til komplet medium 12 h senere.
  3. Tre dage efter transfection vaskes cellerne med 15 mL iskold PBS (to gange) og høster dem i 3 mL iskold PBS ved hjælp af en celle skraber. Centrifugeres ved 2.100 x g i 8 minutter ved 4 °c. Kassér PBS og Fortsæt til lyse trinnet eller frysecelle pellet ved-80 °C.
  4. Resuspension celle pellet i ca 10 volumener af buffer E (50 mm Tris-HCl pH 7,3, 420 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm mgcl2, 1 mm pmsf, 1/100 proteasehæmmer cocktail, og 20 mm N-methylmaleimide (nem)) og inkubere på is i 20 min. tilsætning af N-methylmaleimide (NEM) er afgørende for at hæmme DUBs, der co-rense med nukleosomer.
  5. Efter centrifugering ved 3.000 x g i 5 min., kassér supernatanten og resuspender kromatin pellet i 10 volumen buffer E. Bland ved inversion og centrifuge ved 3.000 x g i 5 min.
    1. Gentag vaske trinnet en anden gang ved hjælp af buffer E og to gange ved hjælp af buffer F "mnase buffer" (20 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm KCl, 2 mm mgcl2, 1 mm CaCl2, 0,3 M saccharose, 0,1% NP-40, 1 mm pmsf og 1/100 proteasehæmmer cocktail).
      Forsigtig: pellet vil flyde under skylningen og centrifugering.
  6. Gensuspendér kromatin i 5 mL buffer F og Behandl pellet med Mikrococcal Nuclease (mnase) (3 e/ml i 10 minutter ved stuetemperatur).
    Bemærk: Reaktionen kan hjælpes ved at blande ved hjælp af en Dounce Homogenisator.
  7. Efter inkubation tages en 40 μL alikvot af blandingen til analyse af nukleosomale DNA-fragmenter. Denne alikvot blandes med 40 μL phenol/chloroform og 20 μL 6x DNA-læsse buffer, vortex, spin ved 18.000 x g i 2 min., og Ilægning af DNA på en 2% agopstået gel.
    1. Når DNA'ET overvejende er et 147 BP-fragment, der svarer til mononukleosomer, stoppes reaktionen ved at tilsætte 5 mM EDTA ved den endelige koncentration.
  8. Efter centrifugering ved 21.000 x g i 20 minutter ved 4 °c, inkubatér den opløselige kromatin fraktion med anti-flag harpiks natten over ved 4 °c. Vask perlerne med 6x buffer G (50 mm Tris-HCl, pH 7,3, 5 mm edta, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm pmsf, 1 mm dtt, 1/100 proteasehæmmere cocktail).
  9. Perlerne med 5 mL buffer G overføres til en tom kromatografi søjle. Elute perlerne-bundne nukleosomer med 200 μg/ml af flag eluering peptid. Brug en elueringsbuffer bestående af buffer G , der indeholder 200 μg/ml-flag elueringspeptider (Se tabel over materialer) og 1/5 (vol: vol) 1 M Tris, pH 8,0. Elute nukleosomer 3x med 260 μl flag eluering buffer (2 h hver eluering).
  10. Test de 3 elutioner ved at tage en alikvot for phenol-chloroform ekstraktion og indlæse DNA i en 2% agopstået gel. Tag 10 μL af hver elueringsfraktion, og tilsæt 10 μL Laemmli-prøve buffer 2x til SDS-PAGE-og Coomassie Blue-analyse, og Indlæs hver eluering for Western blot-påvisning af allestedsnærværende H2A. Elueringsopløsningen opbevares ved-80 °C. Generelt, rensning fra humane celler giver mindre mængde af proteiner end fra bakterier, med koncentrationer spænder fra 0,1 til 0,5 μg/μL.

4. nukleosom allestedsnærværende analyse ved hjælp af BMI1/RING1B E3 Ubiquitin Ligase Complex

  1. Der centrifugeres nukleosomer gennem 10K pore 0,5 mL centrifugal filtre for at ændre substratet fra elueringsbufferen til reaktions bufferen H (25 mm Tris, pH 7,5; 10 mm mgcl2og 5 mm ATP). Alternativt kan kommercielt tilgængelige nukleosomer anvendes til analysen.
    Bemærk: Ændring af substrat affjedrings opløsning til reaktionsbuffer sikrer reproducerbarhed og forebygger potentiel E3-ligasehæmning ved forbindelser, som findes i flag elueringsblandingen.
  2. Der inkubaterer 1 μg nukleosomer i 40 μL total volumen af buffer H. Tilføj UB-aktiverings enzym (UBE1) (250 ng), UB (50 ng/μL) og E2 UB-konjugerende enzymer (672 ng) og 1 μg BMI1/RING1B E3 ubiquitin ubiquitinligase-kompleks. Reaktionen inkubates i 3 timer ved 37 °C med lejlighedsvis omrystning.
    Bemærk: Flere kontroller kan udføres parallelt, herunder udeladelse, E1, E2, E3, ATP og ubiquitin. Dette sikrer specificiteten for den allestedsnærværende reaktion.
  3. Stop reaktionen ved at tilføje 40 μl 2x laemmli prøve buffer og analysere Histon H2A K119 allestedsnærværende ved SDS-Page og Western blotting, i henhold til standardprocedurer. Brug enten anti-H2A eller anti-H2A K119ub antistoffer (Se tabel over materialer).

5. in vitro Nucleosomal H2A DUB assay ved hjælp af BAP1/DEUBAD

  1. Brug de rensede nukleosomer til in vitro-deubiquitination-analysen. Resuspension 100 – 500 ng af nukleosomer i 40 μL buffer i (50 mm Tris-HCl, pH 7,3, 1 mm mgcl2, 50 mm NACL og 1 mm DTT). Tilsæt 1 μg BAP1 bakterier-renset hans-BAP1 og MBP-DEUBAD. Udfør en deubiquitination-reaktion i 3 timer ved 37 °C med lejlighedsvis omrystning.
  2. Stop in vitro-reaktionen ved at tilføje 40 μL 2x Laemmli-buffer og analysér ved immunoblotting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GST-BMI1 og RING1B proteiner er godt produceret i bakterier og kan let udvindes i den opløselige fraktion. Figur 1a viser en Coomassie blå farvning for en typisk rensning af GST-BMI1-RING1B komplekset. GST-BMI1 og RING1B-båndet migrerer med den forventede molekylvægt, ~ 45 kDa og ~ 13 kDa hhv. Især E3 ubiquitinligase-komplekset er meget homisk med meget lave niveauer af bakterie proteiner forurenende stoffer og/eller nedbrydningsprodukter. Desuden, den støkiometri af det rensede kompleks er optimal, som med en molær ratio på 1:1, den bånd intensitet GST-RING1B protein forventes at være to til tre gange stærkere end BMI1. På samme måde resulterede rensningen af hans-BAP1/MBP-DEUBAD-komplekset også i relativt meget homogene præparater med bands på henholdsvis ~ 90 kDa og ~ 55 kDa (figur 1b). Den tandem affinitet oprensning af BAP1 og DEUBAD, gennem nikkel-agopstået og amylose-agopstod henholdsvis sikrer og tilstrækkelig støkiometri og fjernelse af fri BAP1 fra det rensede kompleks. På den anden side består den rensede nukleosomale fraktion i det væsentlige af 147bp-båndet, som indikerer tilstedeværelsen af højberiget mononukleosomal fraktion (figur 1c). Coomassie blå farvning af disse rensede nukleosomer viser et typisk bånd mønster af de fire Histon under enheder med støkiometriske mængder (figur 1d). Kommercielt tilgængelige rekombinante mononukleosomer viser også lignende protein-og DNA-mønstre, når de migreres på henholdsvis SDS-PAGE og agrose gels. Af note, kan monoubiquiterede former for H2A og flag-H2A let skelnes på HEK293T-rensede nukleosomer. Vi brugte rekombinante nukleosomer sammen med E1/E2/Ubiquitin/ATP og bemærkede, at allestedsnærværende Histon H2A med BMI1-RING1B-komplekset viser en tidsafhængig stigning i den allestedsnærværende form af proteinet, mens niveauerne i den ikke-modificerede form er samtidig nedsat. Den allestedsnærværende reaktion er total, da stort set alle H2A proteiner omdannes til H2A K119ub (figur 1E). På den anden side, deubiquitination analyse blev udført på indfødte nukleosomer. Efter inkubation af disse nukleosomer med BAP1/DEUBAD observerede vi en tidsafhængig-reduktion af H2A K119ub signal (figur 1f). Bemærk, at to bånd af allestedsnærværende H2A observeret med anti-H2A K119ub svarer til transficeret flag-H2A og endogene H2A migrerende på ~ 30 kDa og ~ 25 kDa bands hhv.

Figure 1
Figur 1: rensning, allestedsnærværende, og deubiquitination. A) rensning af GST-RING1B-BMI1 proteiner og analyse ved anvendelse af Coomassie blå farvning. GST-RING1B-BMI1 blev produceret i bakterier og renset ved hjælp af GST-affinitets perler. For at bekræfte rense renhed og proteiner størrelse, blev elutioner indlæst på 15% SDS-side gel og plettet med Coomassie blå. Forskellige mængder af BSA bruges til at bestemme proteinmængde. Den farvede gel blev scannet for at generere figuren. B) rensning af MBP-deubad/His-BAP1 Complex. MBP-DEUBAD og hans-BAP1 blev produceret separat i bakterier. Efter lysis blev MBP-DEUBAD og hans-BAP1 blandet og renset med nikkel og maltose perler. Det rensede kompleks blev lastet på 8% SDS-SIDERS gel og plettet med Coomassie Blue. C) oprensning af mononukleosom efter behandling med mnase. Chromatin fra HEK293T, der udtrykker pcDNA. 3 flag-H2A blev ekstraheret og behandlet med MNase til at generere og rense mononukleosomer. For at bekræfte genereringen af mononucleosome blev der taget en brøkdel af kromatin for phenol chloroform ekstraktion og detektion under UV-lys. Lastning på 2% agopstået gel afslører en typisk 147 base-pair DNA fragment, der indikerer mononucleosome. D) der blev anvendt rensede mononukleosomer til blåfarvning af Coomassie. E) in vitro-allestedsnærværende nukleosomer. Rekombinante nukleosomer blev inkuberet ved 37 °C med den bakterielle rensede E3 ubiquitin ubiquitinligase dimer, GST-RING1B/BMI1 og E1/E2/ATP/Ubiquitin, for de angivne tidspunkter. H2A monoubiquitination (H2A K119ub) blev analyseret af Western blotting. F) deubiquitination af H2A K119ub ved hjælp af BAP1/deubad deubiquitinase-komplekset. In vitro-deallesteds nærværende assays blev udført ved hjælp af bakterier renset hans-BAP1/MBP-DEUBAD og pattedyr rensede nukleosomer. Reaktionerne blev gjort for de anklagede gange og analyseret af Western blotting. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: kontrol og oversigt over protokollen. A) renset pattedyr BAP1 eller dets katalytisk døde mutant (C91S) samt bakterier-renset rekombinant BAP1 blev anvendt til H2A deubiquitination på nukleosomer. Nukleosomer inkuberet med buffer alene eller med elutioner opnået fra mock rensning blev også inkluderet som kontrol. (B) BAP1 ikke deubiquitinate H2A K13/K15, hvis allestedsnærværende er medieret af RNF168 E3 Ligase. HEK293T celler blev samtransficeret med enten H2A K13R/K15R eller H2A K118R/K119R sammen med RNF168 for at sikre allestedsnærværende på K13/K15 rester. De rensede nukleosomer blev brugt til deubiquitination af BAP1 komplekser. Reaktionen blev stoppet på forskellige tidspunkter og udsat for immunoblotting. C) rensning af ikke-allestedsnærværende og monoubiquitinerede deubad i kompleks med BAP1 fra pattedyrceller. Det rensede kompleks blev anvendt til deubiquitination af nukleosomal H2A K119ub. Reaktioner blev gjort for de angivne tidspunkter og analyseret af vestlige blotting. D) BAP1 deubiquitinerer H2A K119ub in vivo. HEK293T celler blev samtransficeret med H2A eller H2A mutanter (H2A K118R, K119R, K118R/K119R eller K13R/K15R) sammen med BAP1 og ASXL2 konstruktioner. To dage efter transfection blev cellerne høstet til blot ved hjælp af de indikerede antistoffer. E) skematisk gengivelse af forsøgs arbejdsgangen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er flere fordele ved at etablere robuste in vitro allestedsnærværende og deubiquitination assays for proteiner af interesse. Disse assays kan bruges til at: (i) etablere optimale betingelser og definere minimal krav til disse reaktioner, (II) bestemme enzymatiske kinetiske og biokemiske konstanter, (III) definere rollerne af cofaktorer eller hæmmere, der kan påvirke disse reaktioner, (IV) Identificer interaktions grænseflader, (v) test virkningen af kunstige eller sygdoms associerede mutationer og (vi) fastlægge analysebetingelser, der kan anvendes yderligere til at udvikle kemiske Screenings analyser med høj gennemløb. Her eksemplificerer vi disse assays ved at beskrive, hvordan vi udfører BMI1/RING1B-medieret H2A allestedsnærværende og BAP1/ASXL-medieret H2A deubiquitination på nukleosomale substrater.

Den allestedsnærværende af Histon H2A kan gentages in vitro ved hjælp af minimale komponenter, da næsten fuldstændig allestedsnærværende H2A kan observeres ved hjælp af BMI1-RING1B kompleks. Bemærk, denne reaktion udføres på rekombinante nukleosomer. Disse har den fordel, at de er fri for andre histoner post-translationelle modifikationer, der forekommer i pattedyrsceller. Ikke desto mindre kan den allestedsnærværende reaktion også effektivt udføres på indfødte nukleosomer. Hvis den allestedsnærværende reaktion er svag, kan forholdet mellem enzymer versus substrater øges for at observere optimal ubiquitinligation. Bemærk, at hvis der skal udføres deubiquitinationsreaktioner eller interaktions analyser efter substratet ubiquitination, kan allestedsnærværende udføres direkte på perler-bundne substrater. Det allestedsnærværende substrat kan genvindes ved pull-down, og supernatanten, der indeholder komponenterne i den allestedsnærværende reaktion, kan kasseres. Men når enzymatiske egenskaber skal fastlægges, skal enzymer eluppes og støkiometri af komponenter evalueret af størrelses ekskluderings kromatografi.

Reaktionen fra deubiquitination kræver færre komponenter end den allestedsnærværende reaktion. Men rensning af DEUBAD alene fører generelt til protein udfældning. Vigtigere, når DEUBAD er renset med BAP1, dette i høj grad øger sin opløselighed. Bemærk, vi foreslår at udføre deubiquitination assays med forskellige mængder af substrat og enzymkompleks. Den deubiquitination reaktion kan hæmmes af overskydende mængder af kromatin, som sandsynligvis kan forklares ved øgede koncentrationer af hæmmere forbundet med nukleosomer. Vi observerede også deubiquitination med overskydende gratis BAP1. Således skal der inkluderes flere kontroller såsom inkube dannelse af nukleosomer med BAP1 alene (figur 2a). Det er også vigtigt at bemærke, at nogle Dubs kan Co-rense med kromatin, og selv om vi behandler kromatin med nem, kan Dubs være delvist genaktiveret efter tilsætning af DTT, som reducerer den katalytiske cystein. Desuden, metalloproteinase DUBs kan også være til stede, og disse enzymer er ufølsom over for NEM og er derfor ikke hæmmet. Derfor bør yderligere Kontroller medtages udelukkende bestående af nukleosomer uden tilsætning af enzymer og DUB katalytisk døde mutant (figur 2a). Bemærk, specificiteten af BAP1 DUB aktivitet mod H2A K119ub er veldokumenteret og blev valideret i vores analysebetingelser. Vi renset fra HEK293T celler nukleosomer udtrykker enten H2A K118/K119R eller H2A K13/K15R. Udtryk for RNF168 fører til en vigtig allestedsnærværende på K13/K15. BAP1 DUB aktivitet observeres kun på nukleosome, der indeholder H2A K13/K15R svarende til H2A K119ub (figur 2b). En anden overvejelse er, at post-translationelle modifikationer, der kan være kritiske for enzymatisk aktivitet, sandsynligvis ikke vil være til stede i bakterielle proteiner. Således kan in vitro -reaktioner ved hjælp af komponenter, der er renset fra pattedyrsceller, også betragtes som35. F. eks. fremmer monoubiquitination af DEUBAD, en proces observeret i højere eukaryoter, i høj grad deubiquitinaseaktiviteten på BAP135 (figur 2c). Således kunne rensning af komponenter fra pattedyrsceller også overvejes. Ud over in vitro-reaktioner er det muligt at overvåge BAP1 DUB aktivitet direkte i cellerne efter transfection. For eksempel kan transfektering af HEK293T celler med H2A konstruere give et klart signal om H2A K119ub på grund af dets overflod i celler. Under disse betingelser, de fleste af de allestedsnærværende sker på K118/K119 rester, som mutation af disse steder til arginin føre til fuldstændig fravær af H2A allestedsnærværende (figur 2D). Co-udtrykker BAP1 og ASXL2 sammen med H2A giver mulighed for at konk gøre på BAP1 DUB aktivitet i celler. Men flere punkter skal betragtes som over ekspression kan føre til fejlagtige resultater. Disse eksperimenter skal derfor optimeres og styres godt.

Sammenfattende er de protokoller, der er beskrevet her, og som gentages i figur 2E, ligetil, kræver ikke en specialiseret infrastruktur eller eksperimentel opsætning og kan opskaleres til at producere betydelige mængder modificerede nukleosomer til flere anvendelser i nedstrøms, herunder enzymatiske analyser, massespektrometri og protein-protein interaktions assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Diana Adjaoud for teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) og Genome Canada (2016-2019) til E.B.A. E.B.A. er en ledende forsker i fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L. M og N.S.K. har et ph. d.-stipendium fra FRQ-S. H. B havde et ph. d.-stipendium fra ministeriet for videregående uddannelse og fra videnskabelig forskning i Tunesien og Cole Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylose agarose beads New England Biolabs #E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K Sigma-Aldrich #UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub) Cell Signaling Technology #8240
Anti-Flag-agarose beads Sigma-Aldrich #A4596
Anti-protease cocktail Sigma-Aldrich #P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria Agilent technologies #230240
DMEM Wisent #319-005-CL
Empty chromatography column Biorad #731-1550
Flag peptide Sigma-Aldrich #F3290
GSH-agarose beads Sigma-Aldrich #G4510
HEK293T ATCC #CRL-3216
Imidazole Sigma-Aldrich #I5513
Micrococcal nuclease (MNase) Sigma-Aldrich #N3755
Ni-NTA agarose beads ThermoFisher Scientific #88221
N-methylmaleimide (NEM) Bioshop #ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm Sarstedt #83.1826
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc #23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) Addgene #63139
Ub Activating Enzyme (UBE1) Boston Biochem #E-305
UBCH5C (UBE2D3) Boston Biochem #E2-627

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
  2. Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
  3. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
  4. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
  5. Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
  6. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  7. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
  8. Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
  9. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
  10. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
  11. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  12. Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
  13. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
  14. Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
  15. Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
  16. Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
  17. Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
  18. Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
  19. Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
  20. Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
  21. Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
  22. Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
  23. Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
  24. Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
  25. Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
  26. Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
  27. Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
  28. Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
  29. Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
  30. Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
  31. Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
  32. Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
  33. Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
  34. Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
  35. Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
  36. Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
  37. Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
  38. Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
  39. Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
  40. Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
  41. Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
  42. Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
  43. Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
  44. Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).

Tags

Biokemi allestedsnærværende deubiquitination E3 ubiquitin Ligase PRC1 deubiquitinase PR-DUB Chromatin BAP1 ASXL BMI1 RING1B H2A
In vitro-allestedsnærværende og Deubiquitinationassays af Nukleosomale histoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Masclef, L., Maxime, U., Ahmed, O.,… More

Masclef, L., Maxime, U., Ahmed, O., Sen Nkwe, N., Barbour, H., Iannantuono, N. V. G., Boubekeur, A., Daou, S., Affar, E. B. In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones. J. Vis. Exp. (149), e59385, doi:10.3791/59385 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter