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Biology

Femtosecond लेजर द्वारा फोटोउत्तेजना अतिरिक्त सेल्यूलर-संकेत विनियमित Kinase (ERK) संकेतया लक्ष्य कोशिकाओं में Mitochondrial घटनाक्रम सक्रिय करता है

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59661
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 3
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai Sixth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 2Ultrafast Laser Laboratory, College of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering, Tianjin University, 3School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University

Summary

कसकर केंद्रित femtosecond लेजर वास्तविक समय अवलोकन और photostimulation को सक्षम करने के लिए एक confocal माइक्रोस्कोपी में युग्मित किया जा रहा द्वारा कोशिकाओं के लिए सटीक उत्तेजना वितरित कर सकते हैं. photostimulation ERK संकेतन मार्ग और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के mitochondrial चमक सहित सेल आणविक घटनाओं को सक्रिय कर सकते हैं.

Abstract

सेलुलर परिभाषित आणविक घटनाओं का प्रत्यक्ष नियंत्रण जीवन विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है. हाल ही में, अध्ययनों से पता चला है कि femtosecond लेजर उत्तेजना एक साथ कई सेलुलर आणविक संकेतन रास्ते सक्रिय कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में, हम बताते हैं कि एक confocal माइक्रोस्कोप में युग्मन femtosecond लेजर के माध्यम से, कोशिकाओं को कसकर केंद्रित लेजर द्वारा ठीक प्रेरित किया जा सकता है. कुछ आण्विक प्रक्रम जिन्हें एक साथ देखा जा सकता है, बाद में सक्रिय हो जाते हैं। हम hela कोशिकाओं में extracellular संकेत विनियमित kinase (ERK) संकेतन मार्ग को सक्रिय करने के लिए photostimulation के विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के Mitochondrial चमक (आरओएस) और अन्य mitochondrial घटनाओं भी प्रेरित किया जा सकता है अगर एक निश्चित mitochondrial ट्यूबलर संरचना पर femtosecond लेजर नाड़ी ध्यान केंद्रित. इस प्रोटोकॉल photostimulation से पहले कोशिकाओं pretreating भी शामिल है, लक्ष्य पर एक femtosecond लेजर फ्लैश द्वारा photostimulation देने, और देख / इस प्रोटोकॉल संबंधित जैविक शोध के लिए एक सभी ऑप्टिकल उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.

Introduction

सेलुलर संकेतन अणुओं को नियंत्रित करने की तकनीक जीवन विज्ञान के विकास का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है. परंपरागत रूप से, सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधिदवाओं या जैविक सामग्री 1 ,2,3द्वारा जैव रासायनिक उपचार है। पिछले दशक में, optogenetics के आविष्कार सेलुलर आणविक संकेत मॉडुलन के लिए एक नए युग को खोलता है. जीन इंजीनियरिंग द्वारा प्रकाश संवेदनशील प्रोटीन के साथ संक्रमण प्रकाश लक्ष्य सेल में विभिन्न प्रोटीन गतिविधियों को मॉड्युलेट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन जाता है। इस प्रौद्योगिकी ने उत्तेजना और तंत्रिका संकेत के निषेध, जीन अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने, सेलुलर संकेत पैटर्न मेंहेरफेर, विभिन्न सेल भाग्य और पैथोलॉजिकल जांच 4, 5 के रूप में उत्साहजनक प्रगति की है 6,7,8,9. हालांकि, प्रकाश केवल optogenetic प्रोटीन के साथ कोशिकाओं transfecting द्वारा काम कर सकते हैं. वर्तमान अवस्था में, वहाँ दुर्लभ तरीके है कि प्रकाश optogenetics के अलावा सीधे सेलुलर अणुओं को नियंत्रित करने के लिए सक्षम मौजूद हैं.

Femtosecond लेजर कुशल multiphoton उत्तेजना प्रदान करते हुए अच्छा जैविक सुरक्षा बनाए रखने के द्वारा उन्नत जैविक शोध किया है. विविध फोटो प्रसंस्करण रणनीतियों की तैनाती करके, यह इस तरह के multiphoton माइक्रोस्कोपी, microsurgeries और multiphoton optogenetic अनुप्रयोगों10,11,12,13 के रूप में कई उपलब्धियों का एहसास हुआ है ,14,15,16. हाल की जांच से पता चलता है कि femtosecond लेजर उत्तेजना एक अत्यधिक कुशल ऑप्टिकल विधि के रूप में प्रदर्शन किया गया है सीधे आणविक संकेतन घटनाओं प्रेरित. यह पाया गया है कि एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) पर कसकर केंद्रित फेमटोसेकंड लेजर विकिरण ईआर में कैल्शियम को कम करनेऔर कोशिकाओं में कैल्शियम संकेतों के रूप में कैल्शियम रिलीज-सक्रिय कैल्शियम (सीआरएसी) चैनलों को सक्रिय करने में सक्षम है। यह फोटो सक्रिय कैल्शियम संकेत कोशिकाओं के कई प्रकार के बीच फैल सकता है18,19,20. इसके अलावा, यह भी सक्रिय टी कोशिकाओं के परमाणु कारक के रूप में सेल संकेतन रास्ते को सक्रिय करने की क्षमता है (NFAT) और ERK संकेतन मार्ग21,22. तीव्रता और कोशिकाओं में femtosecond लेजर जोखिम के स्थानीयकरण का समायोजन करके, उदाहरण के लिए, mitochondria पर लेजर ध्यान केंद्रित, यह mitochondrial आकारिकी और आणविक घटनाओं को प्रभावित कर सकते हैं23,24, 25.विशेष रूप से, mitochondrial ROS पीढ़ी के फटने photostimulation द्वारा उत्साहित किया जा सकता है, जो mitochondria (mitoflashes) में फ्लोरोसेंट चमक के रूप में टिप्पणी की है.

इसलिए, photostimulation प्रौद्योगिकी अच्छी क्षमता के लिए व्यापक रूप से संबंधित जैविक अनुसंधान में लागू किया जा सकता है. यह भी सेलुलर संकेत अणुओं और माइक्रोस्कोपी के अलावा कार्यों को नियंत्रित करने में femtosecond लेजर अनुप्रयोगों का विस्तार करने के लिए एक अच्छा मौका है. यहाँ, हम photostimulation के तकनीकी विवरण प्रदान करते हैं. photostimulation एक कम flashphotostimulation के साथ एकल लक्ष्य सेल प्रदान करने के लिए एक confocal माइक्रोस्कोप के लिए एक femtosecond लेजर युग्मन द्वारा हासिल की है. यह सेल में कुशल और नियंत्रणीय ERK सक्रियण आरंभ कर सकते हैं. यदि photostimulation mitochondrial ट्यूबलर संरचना पर स्थित है, mitochondrial झिल्ली क्षमता, आकृति विज्ञान, ROS, और पारगम्यता संक्रमण pores, सभी photostimulation द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. इस photostimulation योजना के आधार पर, हम ERK संकेतन मार्ग को सक्रिय करने और हेला कोशिकाओं में कई mitochondrial घटनाओं को प्रभावित करने की एक विस्तृत विधि प्रदान करते हैं. इस प्रोटोकॉल लक्ष्य कोशिकाओं में femtosecond लेजर उत्तेजना देने की प्रक्रिया elucidates.

photostimulation प्रणाली एक साथ उत्तेजना और निरंतर माइक्रोस्कोपी के लिए यह में एक femtosecond लेजर युग्मन के साथ एक confocal माइक्रोस्कोप पर स्थापित किया गया है. femtosecond लेजर (तरंग लंबाई: 1,040 एनएम, पुनरावृत्ति दर: 50 मेगाहर्ट्ज, पल्स चौड़ाई: 120 fs, अधिकतम उत्पादन औसत शक्ति: 1 डब्ल्यू) युग्मन से पहले दो बीम में विभाजित है. एक लेंस की एक जोड़ी से मिलकर एक रिले दूरबीन के माध्यम से निर्देशित है. यह तो सीधे एक विवर्तन सीमा फोकस (Stim-A) बनाने के लिए एक उद्देश्य (60x, N.A. $ 1.2, पानी विसर्जन) के पीछे एपर्चर में परिलक्षित होता है। अन्य एक दो-फोटोन स्कैनिंग मोड (Stim-B) के रूप में काम करने के लिए confocal माइक्रोस्कोप की स्कैनिंग ऑप्टिकल पथ को परिलक्षित होता है। Stim-A दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में एक निश्चित फोकस बिंदु प्रस्तुत करता है (FOV). Stim-B FOV में एक पूर्व डिजाइन आंशिक confocal स्कैनिंग क्षेत्र है. Stim-A और Stim-B चित्र 1Aमें दिखाए गए हैं। dichroic दर्पण (डीएम) के तहत एक सीसीडी कैमरा femtosecond लेजर के ध्यान की निगरानी के लिए उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग प्रदान करता है.

निम्नलिखित प्रयोगों के लिए कुछ महत्वपूर्ण अनिवार्य हैं। इस प्रोटोकॉल में, एक femtosecond फाइबर लेजर स्रोत (1040 एनएम, 50 मेगाहर्ट्ज, 120 fs) एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है. व्यवहार में, अधिकांश वाणिज्यिक फेमोसेकंड oscillators के रूप में लंबे समय के रूप में पल्स चौड़ाई 200 fs से कम है और चोटी शक्ति घनत्व 1011 के स्तर से ऊपर होना चाहिए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता 1012 W/cm2. उदाहरण के लिए, एक ती: नीलम लेजर आमतौर पर multiphoton माइक्रोस्कोपी के लिए प्रयोग किया जाता है femtosecond लेजर चित्र 1Bमें दिखाया की जगह करने में सक्षम है. लेजर शक्ति और कुछ अन्य photostimulation मापदंडों क्योंकि ऑप्टिकल मापदंडों (पल्स चौड़ाई, तरंगदैर्ध्य, और पुनरावृत्ति दर) विभिन्न femtosecond लेज़रों में एक बहुत भिन्न है कि इस प्रकार विभिन्न multiphoton उत्तेजना क्षमता प्रेरित tuned होने की जरूरत है.

femtosecond लेजर उत्तेजना के साथ, confocal माइक्रोस्कोपी दोनों Stim-A और Stim-B मोड में वास्तविक समय में आणविक गतिशीलता पर नजर रखने के लिए निरंतर सेल इमेजिंग प्रदान करता है। दोनों photostimulation योजनाओं (Stim-A और Stim-B) millisecond संकल्प के साथ एक यांत्रिक शटर द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं (चित्र 1).

Stim-एक मोड में, लेजर फोकस की स्थिति FOV के केंद्र में तय हो गई है. एक रिले दूरबीन femtosecond लेजर का ध्यान सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है confocal इमेजिंग विमान पर ऊर्ध्वाधर दिशा में दो लेंस के बीच की दूरी ट्यूनिंग द्वारा स्थित हो (लेजर प्रचार दिशा, confocal इमेजिंग विमान के लिए ऊर्ध्वाधर, के रूप में में दिखाया गया है चित्र 1) . सीसीडी कैमरे के उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग द्वारा, लेजर फोकस का व्यास मापा जा सकता है ($2 $m, चित्रा 2B). उत्तेजना durations और जोखिम बार confocal इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान एक शटर द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं.

Stim-B मोड में, उत्तेजना क्षेत्र को शंखाकार इमेजिंग नियंत्रण सॉफ्टवेयर में लाइन, बहुभुज, या वृत्त जैसे किसी भी रूप में मैन्युअल रूप से पूर्व-असाइन किया जा सकता है. शटर confocal स्कैनिंग प्रक्रिया के साथ सिंक्रनाइज़ है. यह पूर्व डिजाइन समय जो confocal इमेजिंग नियंत्रण सॉफ्टवेयर के माध्यम से सेट किया जाता है पर खुलता है. फिर, उत्तेजना क्षेत्र confocal माइक्रोस्कोपी के रूप में femtosecond लेजर द्वारा स्कैन किया जाता है. इस प्रकार, नमूना केवल femtosecond लेजर द्वारा प्रेरित है जब confocal स्कैनिंग प्रक्रिया एक दिया इमेजिंग फ्रेम में प्रवेश करती है.

प्रयोग विषयों के अनुसार उल्टे और ईमानदार धातुकर्मीय सूक्ष्मदर्शी दोनों पर प्रकाशउद्रूपक प्रणाली स्थापित की जा सकती है। इन विट्रो कोशिकाओं में पेट्री व्यंजन में सुसंस्कृत उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ काम करने के लिए बेहतर कर रहे हैं। पशु, विशेष रूप से जीवित जानवरों के दिमाग, ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ अधिक उपयुक्त हैं। इस अध्ययन में हम उल्टे सूक्ष्मदर्शी को एक उदाहरण के रूप में लेते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पेट्री डिश का कवर पूरे प्रयोगों के दौरान नहीं खोला जाता है।

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Protocol

चेतावनी: नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल NIR femtosecond लेजर और विषाक्त रसायनों का उपयोग शामिल है. प्रयोग प्रक्रियाओं द्वारा प्रेरित सभी संभावित क्षतियों पर ध्यान दें। उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक रसायनों या अन्य सामग्रियों की सुरक्षा डेटा शीट पढ़ें। लेजर सुविधाओं की सुरक्षा निर्देशों का पालन करें या लेजर स्रोत संचालित करने से पहले मार्गदर्शन के लिए पेशेवरों से परामर्श करें।

1. प्रायोगिक तैयारी

  1. फोटोस्टिमुलेशन सिस्टम की स्थापना
    नोट: प्रणाली एक femtosecond लेजर और एक लेजर के होते हैं (प्रवाह उत्तेजना के लिए दृश्य रेंज पर) स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप. चित्रा 1में, एक फाइबर femtosecond लेजर (1,040 एनएम, 50 मेगाहर्ट्ज, 120 fs, 1 W) युग्मन के लिए प्रयोग किया जाता है. पैरामीटर ठीक या आवश्यक नहीं हैं। यह एक तिवारी द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है: नीलम लेजर या NIR रेंज में अन्य वाणिज्यिक femtosecond oscillators.
    1. femtosecond लेजर और confocal माइक्रोस्कोप पर धुन.
      नोट: ऑप्टिकल पथ को समायोजित करने की प्रक्रिया में एक निम्न स्तर ($ 50 mW) पर femtosecond लेजर शक्ति सेट करें।
    2. एक यांत्रिक शटर के माध्यम से femtosecond लेजर बीम प्रत्यक्ष करने के लिए चिंतनशील दर्पण (RM1 और RM2 चित्र 1Bमें दिखाया) का प्रयोग करें। शटर खोलें.
    3. एक 50/50 बीम विभाजक सेट (बीएस, चित्रा 1B) दो अलग बीम (संचरण बीम और प्रतिबिंब बीम) में femtosecond लेजर बीम विभाजित करने के लिए। STEER RM2 और बी एस femtosecond लेजर बीम बनाने के लिए स्कैनिंग लेजर बीम के साथ मेल खाते हैं।
      नोट: (1) लंबे समय से गुजरने वाले डाइक्रोइक दर्पण (डीएम, 700 एनएम कट-ऑन तरंगदैर्ध्य, चित्र 1ख) के पीछे एक संदर्भ आईरिस (आईरिस 1, चित्रा 1ख) का उपयोग स्कैनिंग लेजर पथ को स्थितिबद्ध करने के लिए किया जाता है। (2) सिस्टम केवल Stim-A या Stim-B मोड पर क्रमशः काम कर सकते हैं। Stim-A मोड के लिए, BS निकाला जा सकता है। Stim-B के लिए, बी एस एक RM द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    4. संचरण बीम चौड़ाई का विस्तार करने के लिए लेंस की एक जोड़ी से मिलकर एक रिले दूरबीन सेट, जो उद्देश्य के पीछे एपर्चर के साथ मिलकर बनता है.
      नोट: (1) संदर्भ आईरिस 2 और 3 (चित्र 1ख) फेमोसेकंड लेजर बीम को एकत्रित करने के लिए तैयार हैं (चित्र 1ख) (2) रिले दूरबीन के आवर्धन femtosecond लेजर बीम के मूल व्यास और उद्देश्य के पीछे एपर्चर के व्यास पर निर्भर करता है.
    5. विस्तारित बीम को सूक्ष्मदर्शी में संरेखित करने के लिए आर एम (आरएम 3-5, चित्र 1ख)को चलाने के लिए। STER RM 4 और RM 5 FOV के केंद्र के लिए femtosecond लेजर का ध्यान धुन करने के लिए.
    6. femtosecond लेजर के उद्देश्य के संचरण दक्षता को मापने.
      नोट: उन दो मोड में लेजर के विभिन्न प्रवेश रास्तों के कारण क्रमशः Stim-A और Stim-B पर लेजर शक्ति को मापने के लिए कृपया। यह नीचे संबंधित प्रयोग प्रक्रियाओं को समझाने के लिए नमूना पर शक्ति का उपयोग करेगा.
    7. शटर बंद धुन, femtosecond लेजर और confocal माइक्रोस्कोप जब तक प्रयोगों शुरू करते हैं.
      नोट: निम्नलिखित प्रयोगों में, Stim-A और Stim-B एक साथ काम नहीं करते। यदि Stim-A का उपयोग कर, Stim-B के femtosecond लेजर बीम अवरुद्ध करने की जरूरत है. दूसरी ओर, Stim-A की बीम अवरुद्ध किया जाना चाहिए अगर प्रणाली Stim-B मोड में काम करता है.
  2. संस्कृति माध्यम तैयार करें: Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ उच्च ग्लूकोज.
  3. ERK2-GFP डीएनए प्लाज्मिड तैयार करें, Mito-GFP डीएनए प्लाज्मिड और माइटोकोंड्रिल मैट्रिक्स-लक्ष्यीकरण परिपत्र रूप से permuted पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एमटी-cpYFP) डीएनए प्लाज्मिड. उपयोग होने तक प्लाज्मिड को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. टेट्रामेथिलहोडामाइन (टीएमआरएम, 100 डिग्री सेल्सियस), और पॉलीएथिलिनेनिमाइन (पीई 1 मिलीग्राम/ उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग जब तक रखें।
  5. तैयार 5% paraformaldehyde, 0.5% Triton X-100, विरोधी eIF4E (यूकैरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक 4E), एंटीबॉडी (फॉस्फोर S209, 1 mg/mL), एंटी-बेक्स एंटीबॉडी (1 mg/mL), एंटी-साइटोक्रोम सी एंटीबॉडी (1 mg/mL), माध्यमिक एंटीबॉडी (एंटी-एबिटआईजीएच एंड एल, एल. Alexa Fluor 488, 1 mg/mL), और 0.1% Tween20 के साथ 1% बीएसए. इन अभिकर्मकों को उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  6. बाँझ सामग्री तैयार करें: सेल संस्कृति की बोतलें, कांच स्लाइड नीचे के साथ पेट्री व्यंजन (चित्र ा)ा,कांच के नीचे के साथ व्यंजन, एक अंकित 500 डिग्री मीटर सेल स्थान ग्रिड (चित्र 3बी,photostimulated कोशिकाओं को स्थानीयकृत करने के लिए), 1.5 एमएल और 10 एमएल ट्यूब, और 1 एमएल, 100 जेडएल और 10 जेडएल पिपेट और टिप्स।
  7. मानक सेल संस्कृति प्रयोगशाला उपकरण तैयार करें: एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस, और एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट पर सेट।

2. सेल संस्कृति और संक्रमण

नोट: Hela सेल (हैनरिएटा अभाव से 8 फरवरी 1951 को लिया गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं से व्युत्पन्न सेल लाइन)26 इस प्रोटोकॉल में एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है.

  1. सेल मार्ग
    1. पर्याप्त कोशिकाओं वाले सेल संस्कृति बोतल से संस्कृति माध्यम निकालें.
    2. बोतल को 2 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) से धोलें। PBS निकालें।
    3. 1 एमएल trypsin धीरे धीरे जोड़ें और बोतल थोड़ा नल. बोतल को इनक्यूबेटर में वापस रखो और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट की कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    4. ट्रिप्सिन निकालें. संस्कृति माध्यम के 2-3 एमएल जोड़ें. कोशिकाओं को अलग करने में मदद करने के लिए माध्यम को कई बार पिपेट करें। एक 10 एमएल ट्यूब के लिए कोशिकाओं के साथ माध्यम स्थानांतरण.
    5. सेल गिनती के लिए ट्यूब से नमूने के 10 डिग्री एल ले लो.
    6. एक पेट्री डिश में बीज 25,000 कोशिकाओं (चित्र 3ए) और 1 एमएल तक संस्कृति माध्यम जोड़ें।
    7. पकवान निहित कोशिकाओं को वापस इनक्यूबेटर में रखो। ट्रांसफेक्शन से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को 24 एच इनक्यूबेट करें।
  2. सेल ट्रांसफेक्शन
    1. डिश प्रति transfection के लिए डीएनए प्लाज्मिड (ERK2-GFP, Mito-GFP या mt-cpYFP) के 0.5 डिग्री ग्राम का उपयोग करें। एक 1.5 एमएल ट्यूब में DMEM के 50 डिग्री एल में प्लाज्मिड के 0.5 डिग्री ग्राम और PEI के 2.5 डिग्री ग्राम जोड़ें। कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट मिश्रित मीडिया 10 मिनट।
    2. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं के साथ पकवान ले लो. संस्कृति माध्यम को 1 एमएल DMEM से बदलें।
    3. ड्रॉप द्वारा ड्रॉप कोशिकाओं में डीएनए / पीआई मिश्रित मीडिया जोड़ें। कोशिकाओं को वापस इनक्यूबेटर में रखो।
    4. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और DMEM डीएनए/PEI मिश्रित मीडिया को संस्कृति माध्यम के 1 एमएल के साथ बदलें।
    5. फोटोस्टिमुलेशन प्रयोगों से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच इनक्यूबेट ट्रांसफेक्टेड कोशिकाएं।

3. Femtosecond लेजर के Photostimulation द्वारा ERK2 के सक्रियण

  1. femtosecond लेजर चालू करें और शटर बंद कर दिया है सुनिश्चित करें.
  2. लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप चालू करें और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें। 488 एनएम पर उत्तेजना लेजर सेट करें। 0.1 mW पर 488 एनएम लेजर की शक्ति स्तर निर्धारित करें। इमेजिंग आकार को 512 x 512 पिक्सेल के रूप में सेट करें. प्रत्येक पिक्सेल का अंतराल समय 2.4$s के रूप में सेट करें. कोशिकाओं के लिए photobleaching और photodamage को कम करने के लिए 6 s पर दो फ्रेम के बीच अंतराल समय निर्धारित करें। एक व्यक्तिगत प्रयोग में $ 30 मिनट सतत माइक्रोस्कोपी प्रदान करने के लिए लगभग 300 फ्रेम पर कुल इमेजिंग फ्रेम सेट करें।
    नोट: दो आसन्न फ्रेम, कुल इमेजिंग फ्रेम और सतत माइक्रोस्कोपी के इमेजिंग समय के अंतराल प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। यदि कोई व्यक्ति प्रयोग 2 ज से अधिक रहता है, तो कृपया सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए 5% ब्व्2 और 37 डिग्री सेल्सियस का वातावरण प्रदान करने के लिए चरण 3ण्3 में उपस्थित सूक्ष्मदर्शी के लिए ब् व् 2 ऊष्मायन प्रणाली (चित्र 4में दर्शाया गया) सेट करें। यदि कोई व्यक्ति प्रयोग 2 ज के भीतर सीमित है, तो सीओ2 ऊष्मायन प्रणाली आवश्यक नहीं है।
  3. सीओ2 ऊष्मायन प्रणाली को चालू करें, सभी हीटर चालू करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर काम कर रहे तापमान को सेट करें। रुको जब तक तापमान तक चला जाता है 37 डिग्री सेल्सियस और सीओ2 की एकाग्रता अप करने के लिए 5%. इनक्यूबेटर अवस्था को सूक्ष्मदर्शी अवस्था पर रखें जैसा कि चित्र 4कमें दर्शाया गया है।
  4. चरण 2 में वर्णित के रूप में ERK2-GFP के साथ transfected Hela कोशिकाओं को तैयार करें।
    नोट: एक व्यक्तिगत प्रयोग में, योजना Stim-A या Stim-B कोशिकाओं के लिए photostimulation देने के लिए लागू किया जाता है. चरण 3.5 और 3.6 क्रमशः स्टिम-ए और स्टिम-बी के अंतर्गत विस्तृत चरण प्रस्तुत करते हैं।
  5. Stim-A मोड का उपयोग कर लक्ष्य कोशिकाओं में femtosecond लेजर उत्तेजना उद्धार
    नोट: photostimulation प्रक्रिया से पहले, कृपया सुनिश्चित करें कि ध्यान का व्यास के आसपास है 2 डिग्री. इस प्रक्रिया चरण 3.5.1 और 3.5.2 में वर्णन किया गया है।
    1. इनक्यूबेटर से ERK2-GFP के साथ transfected कोशिकाओं युक्त पकवान ले लो और माइक्रोस्कोप चरण पर पकवान डाल दिया।
    2. माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से तेजी से स्कैनिंग मोड शुरू करो। कोशिकाओं के स्पष्ट फ्लोरोसेंट छवियों को प्राप्त करने के उद्देश्य को ट्यून करें। तेजी से स्कैनिंग बंद करो. सीसीडी कैमरा द्वारा उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग मोड में स्विच करें (चित्र 2A)। शटर खोलें और रिले दूरबीन के दो लेंस के बीच की दूरी को समायोजित करने के लिए femtosecond लेजर फोकस का व्यास सुनिश्चित करने के लिए हो सकता है $ 2 डिग्री (चित्र2B) . समायोजन पूर्ण करने के लिए शटर बंद करें.
      नोट: लेजर फोकस को इंगित करने के लिए एक संदर्भ तीर को लेबल किया जा सकता है (चित्र 2)। इस बीच, एक संदर्भ तीर भी फ्लोरोसेंट इमेजिंग खिड़की के केंद्र में सेट करने के लिए femtosecond लेजर के ध्यान की स्थिति का संकेत कर सकते हैं.
    3. नमूने में 15-40 mW (810 एनएम, 65 एफ एस, 80 मेगाहर्ट्ज), या 20-60 mW (1040 एनएम, 120 एफ एस, 50 मेगाहर्ट्ज) पर femtosecond लेजर की शक्ति सेट करें। 0.05-0.2 s पर शटर के उद्घाटन समय सेट करें.
    4. एक लक्ष्य सेल अच्छी तरह से व्यक्त ERK2-GFP का चयन करने के लिए तेजी से स्कैनिंग मोड का उपयोग करें.
    5. सीसीडी कैमरा के उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के तहत FOV के केंद्र में चयनित लक्ष्य सेल के cytosol क्षेत्र स्थानीयकरण करने के लिए मंच ले जाएँ (चित्र 2A) .
    6. निरंतर माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रगति प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ नीचे क्लिक करें.
    7. लक्ष्य सेल में चरण 3.5.3 में डिजाइन femtosecond लेजर उत्तेजना देने के लिए किसी भी पूर्व निर्धारित समय स्लॉट पर शटर खोलें.
      नोट: (1) प्रकाश उत्तेजना शटर द्वारा नियंत्रित confocal माइक्रोस्कोपी अनुक्रम में किसी भी समय प्रदर्शन किया जा सकता है. (2) photostimulation confocal माइक्रोस्कोपी अनुक्रम के दौरान एक ही स्थिति में कई बार के लिए दिया जा सकता है.
    8. इमेजिंग प्रक्रिया के पूरा होने तक प्रतीक्षा करें. आगे डेटा विश्लेषण के लिए इमेजिंग डेटा सहेजें.
  6. Stim-B मोड का उपयोग कर लक्ष्य कोशिकाओं में femtosecond लेजर उत्तेजना उद्धार
    1. नमूने में 15-40 मीटर (810 एनएम), 20-60 मीटर (1040 एनएम) पर femtosecond लेजर की शक्ति सेट करें।
    2. इनक्यूबेटर से ERK2-GFP के साथ transfected कोशिकाओं युक्त पकवान ले लो और यह माइक्रोस्कोप चरण पर डाल दिया।
    3. एक लक्ष्य सेल अच्छी तरह से व्यक्त ERK2-GFP का चयन करने के लिए तेजी से स्कैनिंग मोड का उपयोग करें.
    4. confocal इमेजिंग प्रक्रिया चरण 3.2 के रूप में सेट करें। इमेजिंग प्रक्रिया में उत्तेजना फ्रेम के रूप में एक विशेष स्कैनिंग फ्रेम परिभाषित करें. सिमुलेशन फ़्रेम के पैरामीटर को परिभाषित करें.
      1. लक्ष्य कक्ष में नाभिक के निकट साइटोसोल क्षेत्र में स्कैनिंग क्षेत्र (2 x 2-3 x 3 डिग्री 2 ) सेट करें।
      2. 0.1-0.2 s. पर कुल स्कैनिंग समय सेट पूर्वनिर्धारित photostimulation क्षेत्र है, जो केवल खुला है जब लेजर स्कैनिंग उत्तेजना फ्रेम में बूँदें और बंद तुरंत जब यह के अनुसार confocal स्कैनिंग के साथ femtosecond लेजर के शटर सिंक्रनाइज़ बाहर चला जाता है.
        नोट: (1) photostimulaion क्षेत्र किसी भी आकार के लिए सेट किया जा सकता है. (2) photostimulation confocal माइक्रोस्कोपी अनुक्रम में किसी भी पूर्वनिर्धारित समय स्लॉट पर किया जा सकता है. (3) photostimulation कि confocal माइक्रोस्कोपी अनुक्रम में FOV में एक ही या विभिन्न पूर्व निर्धारित क्षेत्रों पर कई बार के लिए किया जा सकता है.
    5. निरंतर माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रगति प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ नीचे क्लिक करें.
    6. इमेजिंग प्रक्रिया के पूरा होने तक प्रतीक्षा करें. आगे डेटा विश्लेषण के लिए इमेजिंग डेटा सहेजें.
  7. प्रयोग के बाद femtosecond लेजर और confocal माइक्रोस्कोप बंद करें.

4. Femtosecond लेजर सिमुलेशन द्वारा eIF4E (ईआरके के सबस्ट्रेट) के सक्रियण

  1. हेला सेल तैयारी
    1. 2.1.1-2.1.5 चरणों का पालन करें।
    2. सेल स्थान ग्रिड के साथ एक पेट्री डिश में बीज $ 20,000 कोशिकाओं (चित्र 3 बी) photostimulated कोशिकाओं को स्थानीयकृत करने के लिए। संस्कृति माध्यम को 1 एमएल तक जोड़ें।
    3. कोशिकाओं के साथ पकवान वापस इनक्यूबेटर में रखो. femtosecond लेजर उपचार से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं 24 एच इनक्यूबेट करें।
  2. femtosecond लेजर चालू करें और सुनिश्चित करें कि शटर बंद है.
  3. लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप चालू करें और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें।
  4. चरण 3-3 में कथन के रूप में CO2 ऊष्मायन प्रणाली तैयार करें.
  5. Stim-A मोड का उपयोग कर लक्ष्य कोशिकाओं में femtosecond लेजर उत्तेजना उद्धार
    1. नमूने में 15-40 मीटर (810 एनएम), 20-60 मीटर (1,040 एनएम) पर femtosecond लेजर की शक्ति सेट करें। 0.05-0.2 s पर शटर के उद्घाटन समय सेट करें.
    2. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं के साथ पकवान ले लो और माइक्रोस्कोप के मंच पर सीओ2 इनक्यूबेटर में माउंट।
    3. सीसीडी कैमरे के उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के तहत इमेजिंग विमान का पता लगाने के लिए ऊर्ध्वाधर दिशा में उद्देश्य ले जाएँ. नमूना चरण को क्षैतिज दिशा में ले जाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि FOV के केंद्र में कोई सेल पता नहीं लगाता है। शटर खोलें और रिले दूरबीन के दो लेंस के बीच की दूरी को समायोजित करने के लिए $ 2 m पर femtosecond लेजर फोकस का व्यास सुनिश्चित करें. समायोजन पूर्ण करने के लिए शटर बंद करें.
    4. बेतरतीब ढंग से 5 "10 ग्रिड का चयन करने के लिए माइक्रोस्कोप चरण ले जाएँ। यह संकेत दिया जा सकता है और सीसीडी कैमरे के उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के तहत पेट्री व्यंजन के तल में ग्रिड द्वारा स्थानीयकृत. डिश में चयनित ग्रिडों के निर्देशांकों को चिह्नित/रिकॉर्ड करें।
    5. सीसीडी कैमरे के उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के तहत मैन्युअल रूप से एक के बाद एक चयनित ग्रिड में स्थित सभी कोशिकाओं को उत्तेजित करें।
  6. डिश को इनक्यूबेटर में वापस रखो। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को 24 एच इनक्यूबेट करें। photostimualation प्रक्रिया के बाद femtosecond लेजर और confocal माइक्रोस्कोप बंद करें.
  7. ईआरके सक्रियण की पुष्टि के लिए फोटोस्टिमुलेशन के साथ कोशिकाओं में फॉस्फोरिलेटईड ईआईएफ4ई की इम्यूनोफ्लोरेसिस माइक्रोस्कोपी
    1. इनक्यूबेटर से बाहर चरण 4.5 में photostimulation उपचार के साथ कोशिकाओं युक्त पकवान ले लो। संस्कृति माध्यम को हटा दें। एक बार पीबीएस से कोशिकाओं को धो लें। PBS निकालें.
    2. पकवान में 5% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (4 डिग्री सेल्सियस) का 1 एमएल जोड़ें। 10 मिनट के लिए 5% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। पैराफॉर्मेल्डिहाइड बफर निकालें। 5 मिनट के लिए दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। PBS निकालें.
    3. पकवान में 0.5% Triton X-100 के 1 एमएल जोड़ें. कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को 15 मिनट इनक्यूबेट करें। Triton X-100 बफ़र निकालें। 5 मिनट के लिए दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। PBS निकालें.
    4. पकवान में 1% बीएसए बफर के 1 एमएल जोड़ें. कमरे के तापमान पर 30 मिनट की कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। बीएसए बफ़र निकालें।
    5. 1% बीएसए के साथ पीबीएस के 1 एमएल में एंटी-ईआईएफ4ई एंटीबॉडी (फॉस्फोर एस 209) को 1 डिग्री ग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता में विरूपित करें। डिश में बफर जोड़ें. कोशिकाओं को 10-12 h के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। बफ़र निकालें।
    6. 5 मिनट के लिए दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। PBS निकालें.
    7. माध्यमिक एंटीबॉडी विरोधी Rabbit आईजीजी एच एंड एल पीबीएस के 1 एमएल में 1% बीएसए के साथ 2 डिग्री / डिश में बफर जोड़ें. कमरे के तापमान पर कोशिकाओं 2 ज को इनक्यूबेट करें। बफ़र निकालें।
    8. पीबीएस से कोशिकाओं को धो लें। PBS निकालें.
    9. पकवान में पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें.
    10. लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप चालू करें। माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें. 488 एनएम पर उत्तेजना लेजर सेट करें। 0.1 mW पर 488 एनएम लेजर की शक्ति स्तर निर्धारित करें। इमेजिंग आकार को 512 x 512 पिक्सेल के रूप में सेट करें. प्रत्येक पिक्सेल का अंतराल समय 2.4$s के रूप में सेट करें.
    11. माइक्रोस्कोप चरण पर इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला कोशिकाओं के साथ पकवान रखो। सीसीडी कैमरे के उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के तहत चयनित बक्से का पता लगाएँ.
    12. एकल फ्रेम confocal स्कैनिंग शुरू करो. photostimulation कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट चित्रों को बचाओ.
    13. कोई femtosecond लेजर उत्तेजना के साथ क्षेत्रों का पता लगाने के लिए बेतरतीब ढंग से मंच ले जाएँ। एकल फ्रेम confocal स्कैनिंग शुरू करो. नियंत्रण डेटा के रूप में कोई उत्तेजना कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट चित्रों को बचाओ.
  8. प्रयोग के बाद कॉनफोकल माइक्रोस्कोप बंद कर ें।

5. फोटोस्टिमुलेशन द्वारा Mitoflashes और अन्य Mitochondrial घटनाक्रम के सक्रियण

नोट: माइटोकोंड्रिल रूपात्मक गतिशीलता का निरीक्षण करने के लिए, हेला कोशिकाओं को मिटो-जीएफपी के साथ चरण 5-1 में फ्लोरोसेंटी इंगित करने के लिए ट्रांसफेक्टेड किया जाता है। mitoflashes निरीक्षण करने के लिए, हेला कोशिकाओं कदम 5.1 में mt-cpYFP के साथ transfected हैं.

  1. तैयार Hela कोशिकाओं Mito-GFP या mt-cpYFP के साथ transfected चरण 2 के बाद.
  2. femtosecond लेजर चालू करें और शटर बंद कर दिया है सुनिश्चित करें.
  3. लेजर-स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप चालू करें। 488 एनएम पर उत्तेजना लेजर सेट करें। 0.1 mW पर 488 एनएम लेजर की शक्ति स्तर निर्धारित करें। इमेजिंग आकार को 512 x 512 पिक्सेल के रूप में सेट करें. प्रत्येक फ्रेम का कुल इमेजिंग समय 2.2 s के रूप में सेट करें. 0 पर दो फ़्रेम्स के बीच अंतराल समय सेट करें, कुल इमेजिंग फ़्रेमको को 200 फ़्रेम्स के रूप में सेट करें ताकि किसी व्यक्तिगत प्रयोग में $440 सतत माइक्रोस्कोपी प्रदान की जा सके।
    नोट: दो आसन्न फ्रेम, कुल इमेजिंग फ्रेम और सतत माइक्रोस्कोपी के इमेजिंग समय के अंतराल प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
  4. यदि आवश्यक हो तो चरण 3-3 में वर्णित के रूप में सीओ2 ऊष्मायन प्रणाली तैयार करें।
  5. Stim-A मोड का उपयोग कर लक्ष्य mitochondrion में femtosecond लेजर उत्तेजना उद्धार
    1. इनक्यूबेटर से Mito-GFP या mt-cpYFP के साथ transfected कोशिकाओं युक्त पकवान ले लो और माइक्रोस्कोप चरण पर पकवान डाल दिया।
    2. चरण 3.5.2 के रूप में femtosecond लेजर की स्थिति की जाँच करें. सुनिश्चित करें कि femtosecond लेजर का ध्यान FOV के केंद्र में स्थित है. फोकस की स्थिति को इंगित करने के लिए फ्लोरोसेंट इमेजिंग विंडो के केंद्र में एक संदर्भ तीर सेट करें।
    3. नमूने में 5-30 मीटर (810 एनएम), 10-40 मीटर (1040 एनएम) पर femtosecond लेजर की शक्ति सेट करें। 0.05-0.1 s पर शटर के उद्घाटन समय सेट करें.
    4. एक लक्ष्य सेल अच्छी तरह से Mito-GFP या mt-cpYFP व्यक्त का चयन करने के लिए तेजी से स्कैनिंग मोड का उपयोग करें.
    5. प्रयोगात्मक विषय के रूप में लक्ष्य सेल में बेतरतीब ढंग से एक mitochondrion का चयन करें। तेजी से स्कैनिंग मोड द्वारा FOV (संदर्भ तीर से संकेत) के केंद्र में लक्ष्य mitochondrial ट्यूबलर संरचना स्थानीयकरण करने के लिए माइक्रोस्कोप चरण ले जाएँ।
    6. निरंतर माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रगति प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ नीचे क्लिक करें.
    7. लक्ष्य mitochondrial ट्यूबलर संरचना में कदम 5.5.3 में डिजाइन femtosecond लेजर उत्तेजना देने के लिए किसी भी पूर्व निर्धारित समय पर शटर खोलें.
      नोट: (1) mitochondrial ट्यूबलर संरचना पर femtosecond लेजर जोखिम confocal माइक्रोस्कोपी के दौरान किसी भी समय शटर द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. (2) एक प्रयोग में केवल एक femtosecond-लेजर जोखिम प्रदर्शन क्योंकि एक femtosecond लेजर उत्तेजना एक लंबी अवधि में mitochondrial स्थिति परेशान हो सकता है.
    8. इमेजिंग प्रक्रिया के पूरा होने तक प्रतीक्षा करें. आगे डेटा विश्लेषण के लिए इमेजिंग डेटा सहेजें.
  6. प्रयोग के बाद femtosecond लेजर और confocal माइक्रोस्कोप बंद करें.

6. Femtosecond लेजर उत्तेजना द्वारा हेला कोशिकाओं में लक्ष्य Mitochondria पर Mitochondrial झिल्ली क्षमता का दोलन

  1. 2.1.1.2.1.6 चरणों का पालन करने के लिए हेला कोशिकाओं को तैयार करें।
  2. प्रयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 ज के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. TMRM धुंधला समाधान तैयार करें: 100 एनएम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10% FBS के साथ DMEM के 1 एमएल में TMRM पतला.
  4. इनक्यूबेटर में से 5.2.1 और 5.2.2 में तैयार कोशिकाओं के साथ पकवान ले लो। संस्कृति माध्यम को हटा दें। डिश में चरण 6.3 में तैयार TMRM धुंधला समाधान जोड़ें। इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए दाग। धुंधला समाधान निकालें. एक बार पीबीएस से कोशिकाओं को धो लें। पकवान में संस्कृति के माध्यम से 1 एमएल जोड़ें.
  5. femtosecond लेजर चालू करें और शटर बंद कर दिया है सुनिश्चित करें.
  6. लेजर-स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप चालू करें। माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें. 532 एनएम पर उत्तेजना लेजर सेट करें। 0.1 mW पर 532 एनएम लेजर की शक्ति स्तर निर्धारित करें। इमेजिंग आकार को 5.2 s पर 512 x 512 पिक्सेल और फ़्रेम जनरेशन समय के रूप में सेट करें. 0 s पर दो फ़्रेम्स के बीच अंतराल समय सेट करें. कुल इमेजिंग फ़्रेमको को 200 फ्रेम ों सेट करें ताकि किसी व्यक्तिगत प्रयोग में $440 एस सतत माइक्रोस्कोपी प्रदान की जा सके.
    नोट: दो आसन्न फ्रेम, कुल इमेजिंग फ्रेम और सतत माइक्रोस्कोपी के इमेजिंग समय के अंतराल प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
  7. यदि आवश्यक हो तो चरण 3.3 में वर्णित CO2 ऊष्मायन प्रणाली तैयार करें।
  8. लक्ष्य mitochondrion में femtosecond लेजर उत्तेजना देने के लिए Stim-एक मोड का प्रयोग करें. प्रयोग पूरा करने के लिए चरणों का पालन करें 5.5.1-5.5.8.
    नोट: चरण 6.8 में, एक mitochondrion जो अच्छी तरह से लक्ष्य mitochondrion के रूप में TMRM के साथ दाग है का चयन करें.
  9. प्रयोग के बाद femtosecond लेजर और confocal माइक्रोस्कोप बंद करें.

7. Femtosecond लेजर उत्तेजना द्वारा हेला कोशिकाओं में लक्ष्य Mitochondria पर Bax और Cytochrome सी के परिवर्तन

नोट: इस प्रयोग में, सेल जो femtosecond लेजर द्वारा इलाज किया जाता है स्थानीयकरण करने के लिए सेल स्थान ग्रिड (चित्र 3 ख) के साथ पेट्री व्यंजन में कोशिकाओं बीज. TMRM के साथ कोशिकाओं को दाग mitochondrion जो femtosecond लेजर द्वारा प्रेरित किया जा करने के लिए चुना जाता है स्थानीयकरण करने के लिए।

  1. पेट्री डिश में हेला कोशिकाओं को सेल स्थान ग्रिड के साथ तैयार करें (चित्र 3ख) जैसा कि चरण 4-1 में वर्णित है।
  2. TMRM के साथ कोशिकाओं को दाग के रूप में कदम 6.3 और 6.4 में वर्णित है.
  3. femtosecond लेजर चालू करें और शटर बंद कर दिया है सुनिश्चित करें.
  4. लेजर-स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप चालू करें। माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें. 532 एनएम पर उत्तेजना लेजर सेट करें। 0.1 mW पर 532 एनएम लेजर की शक्ति स्तर निर्धारित करें। इमेजिंग आकार को 5.2 s पर 512 x 512 पिक्सेल और फ़्रेम जनरेशन समय के रूप में सेट करें. 0 s पर दो फ़्रेम्स के बीच अंतराल समय सेट करें. कुल इमेजिंग फ़्रेम को 50 फ्रेमों के रूप में सेट करें ताकि किसी व्यक्तिगत प्रयोग में $110 s सतत माइक्रोस्कोपी प्रदान की जा सके.
  5. Stim-A मोड का उपयोग कर लक्ष्य mitochondrion में femtosecond लेजर उत्तेजना उद्धार
    1. नमूने में 5-30 मीटर (810 एनएम), 10-40 मीटर (1040 एनएम) पर femtosecond लेजर की शक्ति सेट करें। 0.05-0.1 s पर शटर के उद्घाटन समय सेट करें.
    2. इनक्यूबेटर से दाग वाली कोशिकाओं से युक्त डिश लें और डिश को माइक्रोस्कोप चरण पर रख दें।
    3. टीएमआरएम के साथ अच्छी तरह से दाग है जो लक्ष्य सेल का चयन करने के लिए तेजी से स्कैनिंग मोड का उपयोग करें।
    4. तेजी से स्कैनिंग मोड का उपयोग करके FOV के केंद्र में लक्ष्य mitochondrial ट्यूबलर संरचना स्थानीयकरण करने के क्रम में मंच ले जाएँ. ग्रिड के उस निर्देशांक को चिह्नित करें जिसे चयनित सेल उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के अंतर्गत स्थित है।
    5. निरंतर माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रगति प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ नीचे क्लिक करें.
    6. लक्ष्य mitochondrial ट्यूबलर संरचना में कदम 7.5.1 में डिजाइन femtosecond लेजर उत्तेजना देने के लिए मैन्युअल रूप से माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रगति के किसी भी पूर्व निर्धारित समय पर शटर खोलें।
    7. इमेजिंग प्रक्रिया के पूरा होने तक प्रतीक्षा करें. चयनित माइटोकोन्ड्रिऑन को चिह्नित करें जो फेमोसेकंड लेजर द्वारा नकली है। आगे डेटा विश्लेषण के लिए इमेजिंग डेटा सहेजें.
    8. प्रयोग के बाद femtosecond लेजर और confocal माइक्रोस्कोप बंद करें. प्रयोग कोशिकाओं पर बेक्स या साइटोक्रोम सी की इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी तैयार करें।
  6. Bax या की इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी साइटोक्रोम सी पर फेमोसेकंड लेसर इलाज mitochondrion.
    1. माइक्रोस्कोप चरण से पकवान ले लो.
    2. Bax या साइटोक्रोम सी के पूर्ण इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला चरणों का पालन करें 4.7.1-4.7.9.
      नोट: चरण 7.6.2 में Bax या साइटोक्रोम सी के इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला खत्म करने के लिए चरण 4.7.5 में एंटी-ईआईएफ4E के बजाय एंटी-बेक्स या एंटी-साइटोक्रोम सी का उपयोग करें।
    3. लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप चालू करें और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें। 488 एनएम और 532 एनएम पर उत्तेजना लेजर सेट करें। 0.1 mW पर 488 एनएम और 532 एनएम लेजर की शक्ति स्तर निर्धारित करें। 2.2 s पर 512 x 512 पिक्सल और फ्रेम पीढ़ी समय के रूप में इमेजिंग आकार सेट करें।
    4. माइक्रोस्कोप चरण पर इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला कोशिकाओं के साथ पकवान रखो। सीसीडी कैमरे के उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के तहत चयनित ग्रिड का पता लगाएँ. उस सेल का पता लगाएँ जिसका उपचार फेमोसेकंड लेजर द्वारा किया जाता है।
    5. एकल फ्रेम confocal स्कैनिंग शुरू करो. मिटोकोन्ड्रिऑन का पता लगाएँ जो फेमोसेकंड लेजर द्वारा प्रेरित होता है। आगे डेटा विश्लेषण के लिए photostimulation सेल के फ्लोरोसेंट तस्वीर सहेजें.
  7. प्रयोग के बाद कॉनफोकल माइक्रोस्कोप बंद कर ें।

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Representative Results

फोटोस्टिमुलेशन को सतत कॉन्फोकल स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के साथ एक साथ किया जा सकता है। फोटोस्टिमुलेशन समय-चूक confocal माइक्रोस्कोपी अनुक्रम में किसी भी पूर्व निर्धारित समय स्लॉट पर शुरू कर सकते हैं। confocal माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा सेलुलर अणुओं की निगरानी कर सकते हैं. photostimulation और अन्य गतिशीलता के लिए आणविक प्रतिक्रियाओं इस तरह से पहचाना जा सकता है. सैद्धांतिक रूप से, यदि ईआरके सक्रिय हो जाता है, तो यह कोशिकाद्रव्य से कोशिका नाभिक27तक फॉस्फोरिलेटिड गति होगी। विशिष्ट सेल भाग्य इस ERK संकेत28के कुछ पैटर्न द्वारा विनियमित किया जा सकता है. हाल के अध्ययनों में, ऑप्टोजेनिक्स के आधार पर ऑप्टिकल मॉडुलन अवधि और परिमाण में ERK संकेत के एक उच्च सटीक नियंत्रण प्रदान की है और पता चला है कि परेशान ERK संकेत संचरण गतिशीलता कैंसर कोशिकाओं में अनुचित प्रसार ड्राइव7, 8. यहाँ, हम इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत विधि का उपयोग करके femtosecond लेजर की एक छोटी फ्लैश के साथ सेल के इलाज के बाद नाभिक में ERK2 स्थानांतरण का प्रदर्शन. चित्रा 5Aमें दिखाया गया है के रूप में, ERK2-GFP फ्लोरोसेंट femtosecond लेजर सिमुलेशन के कई मिनट के बाद अधिकतम तक पहुँचता है. ERK2 अणुओं नाभिक में डाउनस्ट्रीम substrates सक्रिय करने के बाद dephosphorylated किया जाएगा, और फिर ERK2 परमाणु GFP फ्लोरोसेंट के कम द्वारा संकेत कोशिका द्रव्य के लिए वापस आता है. ERK2 कई photostimulations द्वारा कई बार के लिए सक्रिय किया जा सकता है (चित्र 5B). इसलिए, यह कई उत्तेजनाओं के बीच अंतराल समय को नियंत्रित करके ठीक ERK2 संकेत पैटर्न में हेरफेर करने में सक्षम है। इसके अलावा, ERK2 प्रेरित सेल के आसपास आसन्न कोशिकाओं में सक्रिय किया जा सकता है कभी कभी (चित्र 5C). यह अवलोकन इंगित करता है कि कुछ diffusible अणुओं कोशिका femtosecond लेजर के साथ इलाज के लिए आसन्न कोशिकाओं में ERK2 सक्रिय द्वारा जारी किया जा सकता है. ERK2 डाउनस्ट्रीम प्रोटीन eIF4E के फॉस्फोरिलेशन की पुष्टि की जा सकती है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है (चित्र 5D) . यह परिणाम इंगित करता है कि femtosecond लेजर उत्तेजना सफलतापूर्वक ERK संकेतन मार्ग को सक्रिय कर सकते हैं. अधिक विस्तृत परिणाम वांग एस, एट अल22में हैं.

Mitochondrial ऑक्सीडेटिव चमक (mitoflashes) mitochondria में ऑक्सीडेटिव फट रहे हैं कि जटिल mitochondrial आणविक गतिशीलता से जड़. पिछले दशक में , mitoflashes एक मौलिक mitochondria संकेतन घटना होने का एहसास कर रहे हैं और multitudinous सेल कार्यों में एक महत्वपूर्ण भाग लेनेके 29,30,31. परंपरागत रूप से, मिटोफ्लैश आमतौर पर संयोग से मनाया जाता है जब रसायनों के साथ कोशिकाओं का इलाज करने के लिए mitochondria29,30को अप्रत्यक्ष तनाव प्रदान करते हैं. इस photostimulation योजना को लागू करने से, हम एक mitochondrial ट्यूबलर स्तर पर mitoflashes उत्तेजित करने के लिए एक नियंत्रणीय और सटीक तरीके से प्राप्त. सफल mitoflash उत्तेजना चित्र 6Aमें दिखाया गया है। दिलचस्प है, इस तरह के पल्स चोटी, चौड़ाई और प्रतिक्रिया अवधि32 के रूप में mitoflashes के गुण बारीकी से femtosecond लेजर शक्ति से संबंधित हैं. femtosecond लेजर उत्तेजना से उत्साहित mitoflashes के अधिक विस्तृत मात्रात्मक विश्लेषण वांग एस में है, एट अल32. माइटोकोंड्रिया के इस फोटोस्टिमुलेशन में माइटोकोंड्रियाल आण्विक गतिशीलता की किस्में भी दिखाई देती हैं, जिनमें विखंडन और माइटोकोंड्रियाल आकारिकी की बहाली (चित्र 6 ख) और माइटोकोंड्रियाल झिल्ली क्षमता का दोलन भी शामिल है ( चित्र 6C). फोटो सक्रिय mitoflashes के लिए इसी तरह, इन mitochondria घटनाओं photostimulation के विभिन्न शक्ति तीव्रता के साथ अलग प्रदर्शन किया है. यह ERK संकेतन मार्ग के सक्रियण से अलग है. femtosecond लेजर का प्रभाव अत्यधिक एक एकल mitochondrial ट्यूब पर प्रतिबंधित है. अधिक विस्तृत परिणाम वांग Y., एट अल में हैं. 24 और शि एफ, एट अल. 25.

Figure 1
चित्र 1: एक confocal माइक्रोस्कोप में एक femtosecond लेजर युग्मन पर स्थापित photostimulation योजना. (ए) के ऑप्टिकल पथ (बी) फोटोस्टिमुलेशन और कॉन्फोकल इमेजिंग सिस्टम। femtosecond लेजर पहले दो बीम में एक 50/50 बीम विभाजन से विभाजित है. संचरण एक रिले दूरबीन द्वारा विस्तार किया है और फिर Stim-A फार्म के उद्देश्य में परिलक्षित. प्रतिबिंब बीम Stim-B बनाने के लिए माइक्रोस्कोप स्कैनिंग प्रणाली के माध्यम से गठबंधन किया है। एक सीसीडी कैमरा कोशिकाओं और Stim-A मोड में femtosecond लेजर के ध्यान की निगरानी करने के लिए एक उज्ज्वल-फेलिड इमेजिंग प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Stim-A - FOV के केंद्र में एक निश्चित ध्यान केंद्रित; Stim-B - पूर्व डिजाइन क्षेत्र में एक विशेष स्कैनिंग फ्रेम. डीएम - dichroic दर्पण, बी एस - बीम विभाजक, RM - चिंतनशील दर्पण. confocal स्कैनिंग लेजर की तरंगदैर्ध्य 488 एनएम/532 एनएम/635 एनएम है, और फ्लोरोसेंट के विशिष्ट संग्रह तरंगदैर्ध्य अंतराल है और lt;560 एनएम/560-625 एनएम / फाइबर femtosecond लेजर (1,040 एनएम, 120 fs, 50 मेगाहर्ट्ज, 1 डब्ल्यू) एक ती द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है - नीलम लेजर (810 एनएम, 80 मेगाहर्ट्ज, 65 fs, 1 डब्ल्यू) या अन्य वाणिज्यिक femtosecond लेजर oscillators. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: Stim-एक मोड में, स्थानीयकरण और उज्ज्वल-फेलिड इमेजिंग के तहत confocal इमेजिंग विमान में लक्ष्य सेल पर femtosecond लेजर ध्यान केंद्रित के आकार. (ए) फेमोसेकंड लेजर शटर द्वारा अवरुद्ध है। (ख) फेम्टोसेकंड लेजर चालू है। तीर: संदर्भ तीर FOV के केंद्र में सेट करने के लिए पुष्टि करें कि femtosecond लेजर फोकस सही स्थिति locates है. स्केल बार ] 10 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पेट्री डिश सेल संस्कृति, transfection और photostimulation प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया. (ए) 15 मिमी व्यास और 0.17 मिमी मोटाई कांच के नीचे के साथ 35 मिमी पेट्री डिश। (बी) एक गिलास नीचे और एक अंकित 500 डिग्री सेल स्थान ग्रिड के साथ 35 मिमी पेट्री पकवान. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: सीओ2 ऊष्मायन प्रणाली। (क) सीओ2 इनक्यूबेटर अवस्था और (ठ) नियंत्रण कक्ष। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: Stim-A मोड का उपयोग करके ERK photoactivation. (ए) एकल फोटो उद्दीपक (1,040 दउ, 40 उ.मा., 0ण्1 स) एआरके2-जीएफपी स्थानांतरण को नाभिक में प्रेरित करता है और फिर कोशिकाद्रव्य में वापस आ जाता है। (बी) ERK2 संकेत पैटर्न एकल femtosecond लेजर जोखिम (लाल तीर, 1,040 एनएम, 40 mW, 0.1 s) और दो photostimulations (हरे तीर, 810 एनएम, 30 mW, 0.1 s) द्वारा मध्यस्थता. (सी) लक्ष्य सेल में एकल लघु femtosecond लेजर जोखिम द्वारा आसपास की कोशिकाओं में ERK सक्रियण (सफेद तीर, 810 एनएम, 24 mW, 0.2 s). (घ) ईआईएफ4ई-पी का इम्यूनोफ्लोरेसिस एकल फोटोसिमुलेशन (810 एनएम, 25 डब्ल्यूडब्ल्यू, 0ण्2 स) के बाद 24 एच में उल्लेखनीय वृद्धि दर्शाता है। स्केल बार - 10 डिग्री मी (ए), और 20 डिग्री (बी, सी)। ERK2-GFP और eIF4E-P के फ्लोरोसेंट 488 एनएम उत्तेजना लेजर द्वारा उत्साहित है और में एकत्र;560 एनएम चैनल. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: Stim-A मोड के तहत photostimulation द्वारा प्रेरित एकाधिक mitochondria घटनाओं. (क) एकल उद्दीपक द्वारा प्रेरित माइटोकोंड्रियाल नलिका पर मिटोफ्लैश का उत् तेजक (810 दउ, 16 उउ, 0.1 श)। (बी) मोयाबिटो रूपात्मक विखंडन और एकल प्रकाश-उत्तेजना द्वारा प्रेरित बहाली (1,040 एनएम, 30 उ.मा., 0.1 श)। (C) एकल फेमोसेकंड लेजर उत्तेजना (1040 दउ, 20 उउ, 0ण्1 स)। (A) (B) और (C) में तीर फोटोस्टिमुलेशन की स्थिति को दर्शाते हैं। स्केल बार ] 10 डिग्री मी. Mito-GFP या mt-cpYFP के फ्लोरोसेंट 488 एनएम उत्तेजना लेजर द्वारा उत्साहित है और में एकत्र;560 एनएम चैनल. TMRM के फ्लोरोसेंट 532 एनएम उत्तेजना लेजर से उत्साहित है और 560-625 एनएम चैनल में एकत्र. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

0.05 एस 0.1 एस 0.2 एस 0.5 एस
810 एनएम, 65 एफ एस, 80 मेगाहर्ट्ज 20 - 65 mW 10 - 60 mW 5 - 50 mW 5 - 40 mW
1040 एनएम, 120 एफ एस, 50 मेगाहर्ट्ज 30 - 100 mW 20 - 80 mW 15 - 70 mW 10 - 60 mW

तालिका 1: अनुशंसित उत्तेजना अवधि और Stim-एक मोड में femtosecond लेजर की औसत शक्ति.

0.05 एस 0.1 एस 0.2 एस 0.5 एस
810 एनएम, 65 एफ एस, 80 मेगाहर्ट्ज 25 - 40 mW 20 - 30 mW 15 - 25 mW 10 - 25 mW
1040 एनएम, 120 एफ एस, 50 मेगाहर्ट्ज 40 - 60 mW 30 - 50 mW 25 - 40 mW 20 - 30 mW

तालिका 2: अनुशंसित उत्तेजना अवधि और Stim-एक मोड में femtosecond लेजर की औसत शक्ति 2 x 2-3 x 3 $m २ सेल में.

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Discussion

हम एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप प्रणाली के साथ एक femtosecond लेजर के संयोजन के द्वारा एक photostimulation रणनीति का प्रदर्शन. photostimulation सीधे Stim-B तदनुसार परिभाषित करके एक दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी के रूप में काम कर सकते हैं। हम लक्ष्य कोशिकाओं में ERK संकेतन या mitoflashes ट्रिगर करने के लिए femtosecond लेजर की एक छोटी फ्लैश का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। विभिन्न उत्तेजना मोड विभिन्न प्रयोगात्मक प्रयोजनों और प्रणालियों के अनुसार किया जा सकता है. स्टिम-ए को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के आधार पर आसानी से स्थापित किया जा सकता है। फेमोसेकंड लेजर एफओवी केंद्र पर विवर्तन-सीमा स्तर पर केंद्रित किया जा सकता है। subcellular लक्ष्य को femtosecond लेजर फोकस स्थिति को मैन्युअल रूप से ले जाया जा करने की जरूरत है और मनमाने ढंग से durations के लिए प्रेरित किया जा सकता है, confocal माइक्रोस्कोपी से पूरी तरह से स्वतंत्र. इसलिए, Stim-A नमूना है कि पूरी तरह से ध्यान क्षेत्र से बाहर है और लंबे समय से duration photostimulation के लिए उपयुक्त है की रक्षा कर सकते हैं. Stim-B के उत्तेजना क्षेत्र FOV में किसी भी क्षेत्र के रूप में पूर्व निर्धारित किया जा सकता है. यह स्वचालित रूप से किया जा सकता है. लेकिन उत्तेजना अवधि और जोखिम समय केवल confocal स्कैनिंग के साथ पालन कर सकते हैं. प्रत्येक पिक्सेल और कुल फ्रेम आकार के रहने का समय निर्धारित करने के बाद, एक माइक्रोस्कोपी फ्रेम में उत्तेजना अवधि वास्तव में तय की है. photostimulation भी फ्रेम द्वारा समय-समय पर फ्रेम प्रदर्शन किया जा सकता है। यह भी photosensitizers और optogenetic प्रोटीन है कि कम जोखिम अवधि लेकिन बड़े क्षेत्र की आवश्यकता को सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण विचार है कैसे femtosecond लेजर उत्तेजना के मापदंडों को निर्धारित करने के लिए. हमारे पिछले अध्ययनों के अनुसार , कोशिकीय आण्विक क्रियाप्राय बहुप्रकाशन क्रिया17,21,22,23,24,25द्वारा प्रेरित होती है । आम तौर पर multiphoton एक्सेशन दक्षता तरंगदैर्ध्य, पल्स चौड़ाई, पुनरावृत्ति दर सहित सभी femtosecond लेजर मापदंडों के साथ संबंधित है. सेलुलर प्रतिक्रिया लेजर शक्ति, उत्तेजना की स्थिति / क्षेत्र, और जोखिम अवधि के साथ एक साथ आगे संबंधित है। सिद्धांत रूप में, सेल सुरक्षा के साथ उत्तेजना दक्षता संघर्ष. मजबूत photostimulation जैसे उच्च औसत शक्ति, लंबी उत्तेजना अवधि और बड़ा कुल घटना लेजर ऊर्जा उच्च उत्तेजना क्षमता के लिए योगदान देता है, लेकिन सेल क्षति के उच्च जोखिम लाता है. के बाद से उन मापदंडों भी एक दूसरे के साथ रिश्तेदार हैं और सभी उत्तेजना और क्षति के प्रभाव में योगदान, यह केवल एक पैरामीटर का उपयोग करने के लिए असंभव है, कुल घटना लेजर ऊर्जा की तरह, या लेजर औसत शक्ति, परिभाषित करने के लिए यह सुरक्षित है या नहीं. संकेत सक्रियण दक्षता और सेल सुरक्षा दोनों को ध्यान में रखते हुए, यहाँ, हम सारणी 1 और तालिका 2में संदर्भ के लिए दो फेमोसेकंड लेजर स्रोत की अनुशंसित औसत शक्ति और उत्तेजना अवधि प्रदान करते हैं। इसके अलावा, femtosecond लेजर उत्तेजना के मापदंडों वास्तविक ऑप्टिकल प्रणाली और जैविक नमूने के अनुसार बदला जाना चाहिए.

उपरोक्त चर्चाओं के अनुसार, हम photostimulation मापदंडों के अधिक विस्तृत प्रभावी पर्वतमाला पेश करना चाहते हैं. femtosecond लेजर की तरंगदैर्ध्य NIR रेंज photostimulation के लिए इस्तेमाल में बदला जा सकता है. पल्स चौड़ाई एक उच्च शिखर शक्ति और उच्च nonlinear एक्सक्रिया दक्षता प्रदान करने के लिए कम होना चाहिए. इस प्रोटोकॉल के लिए लंबी पल्स अवधि की सिफारिश नहीं की जाती है. आमतौर पर, दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी के लिए ठेठ पल्स चौड़ाई (lt;200 fs) उचित विकल्प है. लेजर की पुनरावृत्ति दर एक महत्वपूर्ण कारक नहीं है. मेगाहर्ट्ज तक पुनरावृत्ति दर इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त है। सेलुलर आणविक प्रतिक्रियाओं के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक लेजर शक्ति और femtosecond लेजर की उत्तेजना अवधि है. ERK को सक्रिय करने के लिए, हमारे पिछले काम के अनुसार22, 15 mW (810 एनएम) या 20 mW (1,040 एनएम) पर औसत शक्ति और 0.2 s पर जोखिम अवधि पर्याप्त उत्तेजना प्रदान करने के लिए पर्याप्त हैं ERK संकेतन को सक्रिय करते हुए ultrahigh सेल व्यवहार्यता बनाए रखने हेला कोशिकाओं. इसके विपरीत, औसत शक्ति पर 80 mW (810 एनएम) या 120 mW (1,040 एनएम) और जोखिम अवधि से अधिक 1 s कोशिकाओं को अपरिवर्तनीय क्षति पैदा कर सकते हैं. Mitochondria आम तौर पर photostimulation के प्रति अधिक संवेदनशील हैं. एक औसत शक्ति से अधिक के साथ उत्तेजना 40 mW (810 एनएम) या 80 mW (1,040 एनएम) और जोखिम अवधि से अधिक 0.2 s प्रेरित mitochondrion में अपरिवर्तनीय विखंडन की तरह महत्वपूर्ण नुकसान पैदा कर सकता है या यहां तक कि पूरे सेल भर में सभी mitochondria में. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि mitochondria के photosensitivity photostimulation के लिए विभिन्न प्रकार के सेल में एक बहुत भिन्न होता है. उदाहरण के लिए, HeLa कोशिकाओं में, लेजर शक्ति केवल 6 mW (810 एनएम, 0.1 s अवधि) के आसपास की जरूरत है. सभी mitochondria विखंडन, mitoflashes, और एमएमपी दोलनों के रूप में photostimulation के लिए प्रतिक्रिया कर सकते हैं. लेकिन मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं में, शक्ति के आसपास करने के लिए बढ़ा दिया जाना चाहिए 15 mW (810 एनएम, 0.1 s अवधि), और अभी भी लगभग आधा प्रेरित mitochondria photostimulation के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं दिखा. Stim-B मोड में, एक और कारक फोटो सक्रियण दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं और सेल क्षति उत्तेजना क्षेत्र है. photostimulation एक छोटे से उत्तेजना क्षेत्र पर पहुंचाने से सेल नुकसान हो सकता है. लेकिन एक ही उत्तेजना एक बड़ा उत्तेजना क्षेत्र पर पहुंचाने के द्वारा ERK को सक्रिय करने में विफल हो सकता है. हम अनुशंसा करते हैं कि लक्ष्य सेल में उत्तेजना क्षेत्र लगभग 2 x 2-3 x 3 $m2 है और यह 25 डिग्री उ2से अधिक नहीं है।

उत्तेजना क्षेत्र के स्थानीयकरण भी इस प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है. पिछले काम करता है के अनुसार17,22, उस क्षेत्र में photostimulation ईआर में Ca2 + दुकान को प्रभावी ढंग से कम कर सकते हैं और CRAC चैनल को सक्रिय करें. फिर, Ca2 + प्रवाह बाद में ERK संकेतन मार्ग को सक्रिय कर सकते हैं. इसलिए, हम एक उच्च ERK सक्रियण दक्षता प्राप्त करने के लिए हेला कोशिकाओं में ईआर क्षेत्र पर photostimulation देने की सलाह देते हैं। ईआर क्षेत्र आसानी से एक चरण विपरीत उद्देश्य से उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के तहत कोशिका द्रव्य या नाभिक से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। आदेश में mitochondrial संकेतन घटनाओं को लागू करने के लिए, femtosecond लेजर का ध्यान आसानी से संबंधित प्रक्रियाओं का पालन चयनित mitochondrial संरचना पर रखा जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल में वर्णित फोटोस्टिमुलेशन विधियों का उपयोग अन्य एकाधिक सेलुलर घटनाओं को प्रभावित करने में भी सक्षम है जैसे Ca2+ और ROS संकेत17,20,21. यह उन सभी पिछले कार्यों photostimulation के बाद सेल सुरक्षा के मूल्यांकन प्रदान की है ध्यान दिया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, कोशिकाओं के महत्वपूर्ण रूपात्मक परिवर्तन, bubbling, mitochondrial विखंडन और पूरे सेल की सूजन, कोशिकाओं की प्रसार दर में कमी आई, और confocal माइक्रोस्कोपी के दौरान फ्लोरोसेंट के कुछ अन्य असामान्य परिवर्तन सभी उच्च मतलब सेल क्षति. यह सेल की स्थिति पर नजर रखने के लिए बहुत सावधान रहना चाहिए. फिर भी, लेजर शक्ति और उत्तेजना मानकों की अच्छी तरह से नियंत्रण के साथ, सेल व्यवहार्यता उच्च उत्तेजना दक्षता के साथ एक साथ एक बहुत ही उच्च स्तर में बनाए रखा जा सकता है. इसलिए, femtosecond लेजर के इस photostimualtion विधि अच्छी क्षमता के लिए और अधिक क्षेत्रों के लिए विस्तार और प्रासंगिक अनुप्रयोगों में लागू है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं.

Acknowledgments

इस कार्य को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81571719 और 81661168014, 81673014, और 81870055), शंघाई नगर विज्ञान और प्रौद्योगिकी समिति (18QA1402300 और 16XD1403100) और राष्ट्रीय कुंजी आर एंड डी योजना (2017) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted microscope Olympus
Femtosecond laser Fianium
CO2 incubation system Olympus MIU-IBC
Petri dish NEST 801002
Petri dish with imprinted grid Ibidi 81148
ERK-GFP addgene 37145 A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFP A gift from Heping Cheng's lab
mito-GFP Invitrogen C10508
Tetramethylrhodamine (TMRM) Invitrogen T668 Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6 Dilute in PBS
Paraformaldehyde Solarbio P8430 Dilute in PBS
Triton X-100 Solarbio T8200 Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8 Dilute in PBS
Tween20 Sigma-Aldrich 9005-64-5
anti-eIF4E antibody abcam ab76256
anti-Bax antibody abcam ab53154
anti-cytochrome C antibody abcam ab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) abcam ab150077

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References

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जीव विज्ञान अंक 149 femtosecond लेजर photostimulation extracellular-संकेत विनियमित kinase (ERK) mitochondria mitoflash biophotonics
Femtosecond लेजर द्वारा फोटोउत्तेजना अतिरिक्त सेल्यूलर-संकेत विनियमित Kinase (ERK) संकेतया लक्ष्य कोशिकाओं में Mitochondrial घटनाक्रम सक्रिय करता है
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Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H. Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells. J. Vis. Exp. (149), e59661, doi:10.3791/59661 (2019).

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