Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Photostimulation av femtosecond laser aktiverer ekstracellulære-signal-regulert kinase (ERK) signalering eller mitokondrie hendelser i målceller

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59661
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 3
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai Sixth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 2Ultrafast Laser Laboratory, College of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering, Tianjin University, 3School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University

Summary

Tett fokusert femtosecond laser kan levere presis stimulering til celler ved å bli koblet til en konfokalmikroskopi mikroskopi slik at sann tids observasjon og photostimulation. Photostimulation kan aktivere celle molekylære hendelser inkludert ERK signalveien og mitokondrie blinker av reaktive oksygen arter.

Abstract

Direkte kontroll av cellulære definerte molekylære hendelser er viktig for Life Science. Nylig har studier vist at femtosecond laser stimulering kan samtidig aktivere flere cellulære molekylære signal veier. I denne protokollen viser vi at gjennom koplings femtosecond laser til et konfokalmikroskopi mikroskop, kan cellene bli stimulert nettopp av tett fokusert laser. Noen molekylære prosesser som kan observeres samtidig er senere aktivert. Vi presenterer detaljerte protokoller av photostimulation å aktivere ekstracellulære signal regulert kinase (ERK) signalering sti i Hela celler. Mitokondrie blinker av reaktive oksygen arter (ROS) og andre mitokondrie hendelser kan også stimuleres hvis fokusere femtosecond laser pulsen på en bestemt mitokondrie rørformede struktur. Denne protokollen inkluderer pretreating celler før photostimulation, levere photostimulation av en femtosecond laser blits på målet, og observere/identifisere molekylære endringer etterpå. Denne protokollen representerer et helt optisk verktøy for relaterte biologiske undersøkelser.

Introduction

Teknologien for å kontrollere cellulære signalering molekyler er en viktig del av utviklingen av Life Science. Tradisjonelt er den mest brukte metoden biokjemiske behandling av narkotika eller biologiske materialer1,2,3. I løpet av det siste tiåret, åpner oppfinnelsen av optogenetics en ny æra for mobilnettet molekylær signal modulering. Transfeksjoner med lysfølsomme proteiner ved genteknologi gjør at lyset blir et kraftig verktøy for å modulere ulike protein aktiviteter i målcellen. Denne teknologien har gjort oppmuntrende skrider som eksitasjon og hemming av nevrale signal, fremme genuttrykk, manipulere cellulære signal mønstre, ledende ulike celle skjebne og patologisk undersøkelse4,5 ,6,7,8,9. Imidlertid kan lys bare fungere ved transfecting celler med optogenetic proteiner. Inne aktuelle scene, der eksisterer sjelden metoder det sette i stand lyset å administrere Cellular molekyler direkte for resten optogenetics.

Femtosecond laser har avansert Biological forskning av skaffer effektiv multiphoton eksitasjon stund bevarer fint Biological sikkerheten. Ved å distribuere ulike foto behandling strategier, har det realisert mange prestasjoner som multiphoton mikroskopi, microsurgeries og multiphoton optogenetic søknader10,11,12,13 ,14,15,16. Nylige undersøkelser viser at femtosecond laser stimulering har blitt demonstrert som en svært effektiv optisk metode for å direkte indusere molekylær signalering hendelser. Det har blitt funnet at tett fokusert femtosecond laser bestråling på endoplasmatiske retikulum (er) er i stand til å tømme kalsium i ER og aktivere kalsium-Release-aktivert kalsium (CRAC) kanaler for å danne kalsium signaler i cellene17. Dette Foto-aktiverte kalsium signalet kan spres mellom flere typer celler18,19,20. Videre har det også evnen til å aktivere celle signalering trasé som kjernefysisk faktor av aktiverte T celler (NFAT) og erk signalering Pathway21,22. Ved å justere intensiteten og lokaliseringen av femtosecond laser eksponering i celler, for eksempel ved å fokusere laseren på mitokondrier, kan det påvirke mitokondrie morfologi og molekylære hendelser23,24, 25. spesielt, serieopptak av MITOKONDRIE ros generasjon kan bli opphisset av photostimulation, som er bemerket som fluorescerende blinker i mitokondrier (mitoflashes).

Derfor er photostimulation teknologi av god potensial til å bli mye brukt i relaterte biologisk forskning. Det er også en god sjanse til å forlenge femtosecond laser applikasjoner i kontroll av mobilnettet signalering molekyler og funksjoner foruten mikroskopi. Her gir vi tekniske detaljer om photostimulation. Photostimulation oppnås ved å kopling en femtosecond laser til et konfokalmikroskopi mikroskop for å gi enkelt mål celle med en kort blits photostimulation. Det kan starte effektiv og kontrollerbar ERK aktivering i cellen. Hvis photostimulation er plassert på mitokondrie rørformede struktur, mitokondrie membran potensial, morfologi, ROS, og permeabilitet overgangen porene, kan alle styres av photostimulation. Basert på denne photostimulation ordningen, gir vi en detaljert metode for å aktivere ERK signalering sti og påvirke flere mitokondrie hendelser i Hela celler. Denne protokollen kaster prosessen med å levere femtosecond laser stimulering til målceller.

Photostimulation systemet er etablert på et konfokalmikroskopi mikroskop med en femtosecond laser kopling inn i den for samtidig stimulering og kontinuerlig mikroskopi. Den femtosecond laser (bølgelengde: 1 040 NM, Repetisjonshastighet: 50 MHz, pulsbredde: 120 FS, maksimal effekt gjennomsnittlig effekt: 1 W) er delt i to bjelker før kopling. En er guidet gjennom et relé teleskop bestående av et par linser. Det er da direkte reflektert inn i ryggen-blenderåpning av en objektiv (60x, N.A. = 1,2, vann nedsenking) å danne en Diffraksjon-grense fokus (Stim-A). Den andre gjenspeiles i skanne optiske banen til konfokalmikroskopi mikroskop for å fungere som en to-Foton skanning modus (Stim-B). Stim-A presenterer et fast fokuspunkt i midten av synsfeltet (FOV). Stim-B er et forhåndsutformet område for delvis konfokalmikroskopi skanning i FOV. Stim-A og Stim-B er vist i figur 1a. En CCD kameraet under det dichroic speilet (DM) skaffer lys-åker tenkelig for avlytting brennpunktet av femtosecond laser.

Det er noen viktige nødvendigheter for følgende eksperimenter. I denne protokollen, en femtosecond fiber laser kilde (1040 NM, 50 MHz, 120 FS) brukes som et eksempel. I praksis kan de fleste kommersielle femtosecond oscillatorer brukes så lenge pulsen bredden er kortere enn 200 FS og peak strøm tetthet bør være over nivået på 1011 ~ 1012 W/cm2. For eksempel, en ti: Sapphire laser vanligvis brukes for multiphoton mikroskopi er i stand til å erstatte femtosecond laser viste i figur 1B. Laseren makt og noe annet photostimulation parameterene nød å bli innstilt fordi det optisk parameterene (impuls bredde, bølgelengde, og gjentagelse rate) variere en meget inne annerledes femtosecond laser det således indusere annerledes multiphoton eksitasjon effektiviteten.

Sammen med femtosecond laser stimulering, gir konfokalmikroskopi mikroskopi kontinuerlig celle avbildning for å overvåke molekylær dynamikk i sanntid i både Stim-A-og Stim-B-moduser. Begge photostimulation ordningene (Stim-A og Stim-B) styres av en mekanisk lukker med oppløsning på millisekunder (figur 1).

I Stim-A-modus, er plasseringen av laser fokus fast i sentrum av FOV. Et relé teleskop brukes til å sikre at fokuset for femtosecond laser plasseres på konfokalmikroskopi bilde plan ved å justere avstanden mellom to linser i vertikal retning (laser overførings retningen, vertikal til konfokalmikroskopi bilde plan, som vist i Figur 1). Av det lys-åker tenkelig av CCD kameraet, diameteren av laser fokusere kan målt (~ 2 μm, skikkelsen 2b). Stimulering varigheter og eksponeringstider styres av en utløser under konfokalmikroskopi bildebehandlings prosessen.

I Stim-B-modus, kan stimulering området være pre-tilordnet manuelt i konfokalmikroskopi Imaging kontrollerende programvare til enhver form som linje, polygon, eller sirkel. Lukkeren synkroniseres med konfokalmikroskopi skanneprosess. Den åpner for det pre-designet tid hvilke er sette igjennom det konfokalmikroskopi tenkelig kontrollerer programvare. Deretter blir stimulering området skannet av femtosecond laser som konfokalmikroskopi mikroskopi. Dermed er prøven bare stimulert av femtosecond laser når konfokalmikroskopi skanning prosessen går inn i en gitt tenkelig ramme.

Photostimulation systemet kan etableres på både invertert og oppreist metallurgisk mikroskop i henhold til eksperimentet. In vitro celler kultivert i Petri retter er bedre å jobbe med invertert mikroskop. Dyr, spesielt hjernen av levende dyr, er mer egnet med oppreist mikroskop. I denne studien tar vi det omvendte mikroskopet som et eksempel. Det bør bemerkes at dekselet av Petri parabolen ikke er åpnet under hele eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsiktig: Protokollen som presenteres nedenfor innebærer bruk av NIR femtosecond laser og giftige kjemikalier. Vennligst vær oppmerksom på alle mulige skader forårsaket av eksperiment prosedyrer. Vennligst les sikkerhetsdatablad av alle relevante kjemikalier eller annet materiale før bruk. Følg sikkerhetsanvisningene til laser fasilitetene eller Rådfør deg med fagfolk før du bruker laser kilde.

1. eksperimentell forberedelse

  1. Sette opp photostimulation systemet
    Merk: Systemet består av en femtosecond laser og en laser (ved synlig rekkevidde for fluorescens eksitasjon) skanning konfokalmikroskopi mikroskop. I figur 1brukes en fiber femtosecond laser (1 040 nm, 50 MHz, 120 FS, 1 W) for kopling. Parametrene er ikke fast eller nødvendig. Den kan erstattes av en ti: Sapphire-laser eller andre kommersielle femtosecond-oscillatorer i NIR-serien.
    1. Tune på femtosecond laser og konfokalmikroskopi mikroskop.
      Merk: Vennligst sett femtosecond laser effekt på et lavt nivå (~ 50 mW) i prosessen med å justere den optiske banen.
    2. Bruk reflekterende speil (RM1 og RM2 viste i figur 1B) for å dirigere femtosecond laserstrålen gjennom en mekanisk lukker. Åpne lukkeren.
    3. Sett en 50/50 stråle splitter (BS, figur 1B) for å splitte femtosecond laserstrålen i to separate bjelker (overførings bjelke og refleksjon stråle). Styr RM2 og BS for å gjøre femtosecond laserstrålen sammenfaller med skanne laserstrålen.
      Merk: (1) en referanse Iris (Iris 1, figur 1B) bak den lange pass dichroic SPEILET (DM, 700 NM cut-on bølgelengde, figur 1B) brukes til posisjonering skanning laser banen. (2) systemet kan bare fungere på Stim-A eller Stim-B-modus, henholdsvis. For Stim-A-modus kan BS fjernes. For Stim-B kan BS erstattes med en RM.
    4. Sett et relé teleskop bestående av et par linser for å utvide overføringen strålen bredde, som er består med baksiden blenderåpning av målet.
      Merk: (1) referansen Iris 2 og 3 (figur 1B) er satt til å collimate den femtosecond laserstrålen (figur 1B). (2) forstørrelsen av relé teleskop avhenger av den opprinnelige diameteren av femtosecond laserstrålen og diameteren av bakre blenderåpning av målet.
    5. Steer RMs (RM 3-5, figur 1B) for å justere den forlengede strålen til mikroskopet. Styr RM 4 og RM 5 for å tune fokus for femtosecond laser til sentrum av FOV.
    6. Mål Overføringseffektiviteten til målet for den femtosecond laseren.
      Merk: Vennligst måle laser kraft ved Stim-A og Stim-B henholdsvis på grunn av ulike penetrasjon stier av laseren i de to modusene. Den vil bruke kraften på prøven for å illustrere relaterte eksperiment prosedyrer nedenfor.
    7. Tune av lukkeren, femtosecond laser og konfokalmikroskopi mikroskop til eksperimenter starter.
      Merk: I de følgende eksperimentene fungerer ikke Stim-A og Stim-B sammen. Hvis du bruker Stim-A, må den femtosecond laserstrålen til Stim-B blokkeres. På den annen side, strålen av Stim-A bør blokkeres hvis systemet fungerer på Stim-B-modus.
  2. Forbered kulturen medium: Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM) høy glukose med 10% fosterets storfe serum (FBS).
  3. Forbered ERK2-GFP DNA-plasmider, mito-GFP DNA plasmider og mitokondrie matrise-målretting sirkulært permuted gult fluorescerende protein (Mt-cpYFP) DNA plasmider. Hold plasmider ved-20 ° c til bruk.
  4. Forbered tetramethylrhodamine (TMRM, 100 μM) og polyethylenimine (PEI 1 mg/mL). Oppbevar dem ved-20 ° c til bruk.
  5. Forbered 5% paraformaldehyde, 0,5% Triton X-100, anti-eIF4E (eukaryote oversettelse Initiation faktor 4E), antistoff (fosfor S209, 1 mg/mL), anti-Bax antistoff (1 mg/mL), anti-cytokrom C antistoff (1 mg/mL), sekundært antistoff (anti-Rabbit IgG H & L, Alexa fluor 488, 1 mg/mL), og 1% BSA med 0,1% Tween20. Oppbevar disse reagensene ved 4 ° c til bruk.
  6. Forbered sterile materialer: cellekulturflasker, Petri retter med glass skyve bunn (figur 3a), retter med et glassbunn, en trykt 500 μm celleplassering rutenett (figur 3b, for å lokalisere de photostimulated cellene), 1,5 ml og 10 ml rør, og 1 mL, 100 μL og 10 μL Pipetter og spisser.
  7. Forbered standard cellekultur laboratorieutstyr: en cellekultur inkubator satt til 5% CO2 og 37 ° c, og en biologisk sikkerhet kabinett.

2. Cell kultur og Transfeksjoner

Merk: Hela celle (cellelinje avledet fra livmorhalskreft celler tatt på 8 februar, 1951 fra Henrietta mangler)26 brukes som et eksempel i denne protokollen.

  1. Celle passasje
    1. Fjern kultur mediet fra cellekultur flasken som inneholder nok celler.
    2. Vask flasken med 2 mL fosfat-bufret saltvann (PBS). Fjern PBS.
    3. Tilsett 1 mL Trypsin langsomt og trykk lett på flasken. Sett flasken tilbake i inkubator og ruge cellene 3 min ved 37 ° c.
    4. Fjern Trypsin. Tilsett 2-3 mL kultur medium. Pipetter mediet flere ganger for å hjelpe cellene til å løsne. Overfør mediet med celler til et 10 mL rør.
    5. Ta 10 μL av prøven fra røret for celle telling.
    6. Seed ~ 25 000 celler til en Petri parabol (figur 3a) og legge kultur medium opp til 1 ml.
    7. Sett parabolen inneholdt cellene tilbake i inkubator. Ruge cellene 24 h ved 37 ° c før transfeksjoner.
  2. Celle transfeksjoner
    1. Bruk 0,5 μg av DNA-plasmider (ERK2-GFP, mito-GFP eller Mt-cpYFP) for transfeksjoner per fat. Tilsett 0,5 μg av plasmider og 2,5 μg av PEI i 50 μL av DMEM i et 1,5 mL rør. Ruge blandet media 10 min ved romtemperatur.
    2. Ta parabolen med cellene fra inkubator. Erstatt kultur medium med 1 mL DMEM.
    3. Legg DNA/PEI blandet media inn i cellene dråpe for dråpe. Sett cellene tilbake i inkubator.
    4. Ruge cellene 3 h ved 37 ° c og erstatt DMEM DNA/PEI blandede medier med 1 mL kultur medium.
    5. Ruge transfekterte celler 24 h ved 37 ° c før photostimulation eksperimenter.

3. aktivering av ERK2 av Photostimulation av femtosecond laser

  1. Slå på femtosecond laser og kontroller at lukkeren er lukket.
  2. Slå på konfokalmikroskopi mikroskop for laserskanning og åpne mikroskop programvaren. Still inn den eksitasjon laseren ved 488 NM. Sett strømnivået på 488 NM laser ved 0,1 mW. Angi bildestørrelse som 512 x 512 piksler. Angi intervalltid for hver piksel som 2,4 μs. Angi intervalltiden mellom to rammer på 6 s for å minimere photobleaching og photoskade til celler. Sett totalt tenkelig rammer på rundt 300 rammer for å gi ~ 30 min kontinuerlig mikroskopi i et individuelt eksperiment.
    Merk: Intervallet for to tilstøtende rammer, total bildebehandling rammer og Imaging tid for kontinuerlig mikroskopi kan justeres i henhold til eksperimentelle krav. Hvis et enkelt eksperiment varer over 2 timer, må du stille inn CO2 inkubasjons-systemet (vist i Figur 4) for mikroskop som finnes i trinn 3,3 for å gi miljøet 5% co2 og 37 ° c for å opprettholde celle levedyktighet. Hvis et individuelt eksperiment er begrenset innen 2 timer, er ikke CO2 inkubasjons-systemet nødvendig.
  3. Slå på CO2 inkubasjons-systemet, slå på alle varmeovner og Still inn arbeidstemperatur ved 37 ° c. Vent til temperaturen går opp til 37 ° c og konsentrasjon av CO2 opp til 5%. Sett inkubator etappen på mikroskop scenen som vist i figur 4a.
  4. Forbered Hela celler transfekterte med ERK2-GFP som beskrevet i trinn 2.
    Merk: I et enkelt eksperiment brukes oppsettet Stim-A eller Stim-B for å levere photostimulation til celler. Trinn 3,5 og 3,6 presentere detaljerte trinn under Stim-A og Stim-B hhv.
  5. Levere femtosecond laser stimulering til målceller ved hjelp av Stim-A-modus
    Merk: Før photostimulation prosedyren, må du sørge for at diameteren av fokuset er rundt 2 μm. Denne prosessen er beskrevet i trinn 3.5.1 og 3.5.2.
    1. Ta parabolen inneholder celler transfekterte med ERK2-GFP fra inkubator og sette parabolen på mikroskopet scenen.
    2. Start rask skannemodus gjennom operativsystemet for mikroskopet. Tune målet å tilegne seg klare fluorescerende bilder av celler. Stopp rask skanning. Skru av å lys-åker tenkelig måte av det CCD kameraet (skikkelsen 2a). Åpne lukkeren og Juster avstanden mellom to linser av relé teleskop for å sikre diameteren av femtosecond laser fokus til å være ~ 2 μm (figur 2b). Lukk lukkeren for å fullføre justeringen.
      Merk: En referanse pil kan merkes for å indikere laser fokuset (figur 2). I mellomtiden kan en referanse pil også settes i midten av fluorescerende bildevinduet for å indikere posisjonen til fokus for femtosecond laser.
    3. Angi kraften til femtosecond laser ved 15-40 mW (810 NM, 65 FS, 80 MHz) eller 20-60 mW (1040 NM, 120 FS, 50 MHz) på prøven. Angi åpningstid for lukkeren ved 0,05-0,2 s.
    4. Bruk rask skanning modus for å velge en mål celle godt uttrykt ERK2-GFP.
    5. Bevege det scene for at lokalisere det stoffer område av det valgt målcellen for senteret av FOV under lys-åker tenkelig av det CCD kameraet (skikkelsen 2a).
    6. Klikk på Start nederst for å starte kontinuerlig mikroskopi Imaging fremgang.
    7. Åpne lukkeren i en forhåndsdefinert tidsperiode for å levere den femtosecond laser stimulering som er utformet i trinn 3.5.3 i målcellen.
      Merk: (1) photostimulation kan utføres når som helst i konfokalmikroskopi mikroskopi sekvens styrt av lukkeren. (2) photostimulation kan leveres for flere ganger i samme posisjon under konfokalmikroskopi mikroskopi sekvensen.
    8. Vent til bilde prosessen er fullført. Lagre bildedata for ytterligere dataanalyse.
  6. Leverer femtosecond laser stimulering til målceller ved hjelp av Stim-B-modus
    1. Still inn kraften i femtosecond laser ved 15-40 mW (810 NM), 20-60 mW (1040 NM) ved prøven.
    2. Ta parabolen inneholder celler transfekterte med ERK2-GFP fra inkubator og legg den på mikroskopet scenen.
    3. Bruk rask skanning modus for å velge en mål celle godt uttrykt ERK2-GFP.
    4. Angi konfokalmikroskopi avbildnings prosess som trinn 3,2. Definer en spesiell skanne ramme som stimulering amme i bildebehandlings prosessen. Definer parameteren for simulerings RAM men.
      1. Angi et skanneområde (2 x 2-3 x 3 μm2) ved stoffer området nær kjernen i målcellen.
      2. Angi total skannetid på 0,1-0.2 s. Synkroniser lukkeren på femtosecond laser med konfokalmikroskopi skanning i henhold til det forhåndsdefinerte photostimulation-området, som bare er åpent når laser skanningen faller i stimulering ammen og lukkes umiddelbart når det slukkes.
        Merk: (1) photostimulaion regionen kan settes til alle størrelser. (2) photostimulation kan utføres på en hvilken som helst forhåndsdefinert tids spalte i konfokalmikroskopi mikroskopi rekkefølge. (3) photostimulation kan utføres for flere ganger på samme eller forskjellige forhåndsdefinerte områder i FOV i den konfokalmikroskopi mikroskopi sekvensen.
    5. Klikk på Start nederst for å starte kontinuerlig mikroskopi Imaging fremgang.
    6. Vent til bilde prosessen er fullført. Lagre bildedata for ytterligere dataanalyse.
  7. Slå av femtosecond laser og konfokalmikroskopi mikroskop etter eksperimentet.

4. aktivering av eIF4E (substrat for ERK) ved femtosecond laser simulering

  1. Jakten celle forberedelse
    1. Følg trinn 2.1.1-2.1.5.
    2. Seed ~ 20 000 celler til en Petri parabol med celleplassering nett (figur 3b) for å lokalisere de photostimulated cellene. Legg til kultur medium opptil 1 mL.
    3. Sett parabolen med cellene tilbake i inkubator. Ruge cellene 24 h ved 37 ° c før femtosecond laser behandling.
  2. Slå på den femtosecond laseren og kontroller at lukkeren er lukket.
  3. Slå på konfokalmikroskopi mikroskop for laserskanning og åpne mikroskop programvaren.
  4. Klargjør CO2 inkubasjons-systemet som setning i trinn 3,3.
  5. Levere femtosecond laser stimulering til målceller ved hjelp av Stim-A-modus
    1. Still inn kraften i femtosecond laser ved 15-40 mW (810 NM), 20-60 mW (1 040 NM) ved prøven. Angi åpningstid for lukkeren ved 0,05-0,2 s.
    2. Ta fatet med celler fra inkubator og Monter den i CO2 inkubator på scenen av mikroskop.
    3. Flytt målsettingen i vertikal retning for å finne bilde planet under lyse felt avbildning av CCD-kameraet. Flytt prøve trinnet i horisontal retning for å sikre at ingen celler lokaliserer i midten av FOV. Åpne lukkeren og justere avstanden mellom to linser av relé teleskop for å sikre diameteren av femtosecond laser fokus på ~ 2 μm. Lukk lukkeren for å fullføre justeringen.
    4. Flytt mikroskopet for å tilfeldig velge 5 ~ 10 rutenett. Det kan angis og lokaliserte av nett i bunnen av Petri retter under lyse felt Imaging av CCD-kameraet. Merk/Registrer koordinatene for valgte rutenett i fatet.
    5. Stimulere alle celler som ligger i de valgte rutenettene en etter en manuelt under lyse felt avbildning av CCD-kameraet.
  6. Sett parabolen tilbake i inkubator. Ruge cellene 24 h ved 37 ° c før immunofluorescence mikroskopi. Slå av femtosecond laser og konfokalmikroskopi mikroskop etter photostimualtion prosedyren.
  7. Immunofluorescence mikroskopi av fosforylert eIF4E inne celler med photostimulation for bekreftelsen av ERK aktivisering
    1. Ta parabolen inneholder celler med photostimulation behandling i trinn 4,5 ut av inkubator. Fjern kultur mediet. Vask cellene med PBS gang. Fjern PBS.
    2. Tilsett 1 mL 5% paraformaldehyde (4 ° c) i fatet. Fest cellene med 5% paraformaldehyde i 10 min. Fjern paraformaldehyde buffer. Vask cellene med PBS for 5 min to ganger. Fjern PBS.
    3. Tilsett 1 mL 0,5% Triton X-100 inn i fatet. Ruge cellene 15 min ved romtemperatur. Fjern Triton X-100-bufferen. Vask cellene med PBS for 5 min to ganger. Fjern PBS.
    4. Tilsett 1 mL 1% BSA-buffer i fatet. Ruge cellene 30 min ved romtemperatur. Fjern BSA-bufferen.
    5. Fortynne anti-eIF4E antistoff (fosfor S209) i 1 mL PBS med 1% BSA til en endelig konsentrasjon på 1 μg/mL. Legg buffer i fatet. Ruge cellene for 10-12 h ved 4 ° c. Fjern bufferen.
    6. Vask cellene med PBS for 5 min to ganger. Fjern PBS.
    7. Fortynne den sekundære antistoff anti-Rabbit IgG H & L i 1 mL PBS med 1% BSA til en endelig konsentrasjon på 2 μg/mL. Legg buffer i fatet. Ruge cellene 2 h ved romtemperatur. Fjern bufferen.
    8. Vask cellene med PBS. Fjern PBS.
    9. Tilsett 1 mL PBS i fatet.
    10. Slå på laser skanne konfokalmikroskopi mikroskop. Åpne programvaren for mikroskopet. Sett eksitasjon laser ved 488 NM. Sett strømnivået på 488 NM laser ved 0,1 mW. Angi bildestørrelse som 512 x 512 piksler. Angi intervalltid for hver piksel som 2,4 μs.
    11. Sett parabolen med immunofluorescent flekker celler på mikroskopet scenen. Finne det valgt boksene under lys-åker tenkelig av det CCD kameraet.
    12. Start enkelt bilde konfokalmikroskopi skanning. Lagre fluorescerende bilder av photostimulation celler.
    13. Flytt scenen tilfeldig for å finne områder uten femtosecond laser stimulering. Start enkelt bilde konfokalmikroskopi skanning. Lagre fluorescerende bilder av ingen stimulering celler som kontroll data.
  8. Slå av konfokalmikroskopi mikroskop etter eksperimentet.

5. aktivering av Mitoflashes og andre mitokondrie hendelser av Photostimulation

Merk: For å observere mitokondrie morfologiske dynamikk, er Hela celler transfekterte med mito-GFP i trinn 5,1 til fluorescensmerkete indikere mitokondrier. For å observere mitoflashes, er Hela celler transfekterte med Mt-cpYFP i trinn 5,1.

  1. Forbered Hela celler transfekterte med mito-GFP eller Mt-cpYFP følgende trinn 2.
  2. Slå på femtosecond laser og kontroller at lukkeren er lukket.
  3. Slå på laserskanning konfokalmikroskopi mikroskop. Sett eksitasjon laser ved 488 NM. Sett strømnivået på 488 NM laser ved 0,1 mW. Angi bildestørrelse som 512 x 512 piksler. Angi total bilde tid for hver ramme som 2,2 s. Angi intervalltiden mellom to rammer ved 0 s. Angi totalt bildebehandlings RAM mer som 200 rammer for å gi ~ 440 s kontinuerlig mikroskopi i et individuelt eksperiment.
    Merk: Intervallet for to tilstøtende rammer, total bildebehandling rammer og Imaging tid for kontinuerlig mikroskopi kan justeres i henhold til eksperimentelle krav.
  4. Klargjør CO2 inkubasjons-systemet som beskrevet i trinn 3,3 hvis nødvendig.
  5. Levere femtosecond laser stimulering til mål mitokondrie ved hjelp av Stim-A-modus
    1. Ta parabolen inneholder celler transfekterte med mito-GFP eller Mt-cpYFP fra inkubator og sette parabolen på mikroskopet scenen.
    2. Kontroller status for femtosecond laser som trinn 3.5.2. Sørg for at fokuset for femtosecond laser ligger i sentrum av FOV. Angi en referanse pil i midten av det fluorescerende bildevinduet for å angi posisjonen til fokus.
    3. Still inn kraften i femtosecond laser ved 5-30 mW (810 NM), 10-40 mW (1040 NM) ved prøven. Angi åpningstid for lukkeren ved 0,05-0,1 s.
    4. Bruk rask skanning modus for å velge en mål celle godt uttrykt mito-GFP eller Mt-cpYFP.
    5. Velg en mitokondrie tilfeldig i målcellen som det eksperimentelle motivet. Beveg mikroskop fasen for å lokalisere mål mitokondrie rørformede struktur i midten av FOV (indikerer ved referanse pilen) ved rask skannemodus.
    6. Klikk på Start nederst for å starte kontinuerlig mikroskopi Imaging fremgang.
    7. Åpne lukkeren til enhver forhåndsdefinert tid til å levere femtosecond laser stimulering utformet i trinn 5.5.3 inn i målet mitokondrie rørformede struktur.
      Merk: (1) den femtosecond laser eksponeringen på den mitokondrie rørformede strukturen kan styres av lukkeren når som helst under konfokalmikroskopi-mikroskopi. (2) Utfør bare en femtosecond-laser eksponering i ett eksperiment fordi en femtosecond laser stimulering kan forurolige mitokondrie status over en lang periode.
    8. Vent til bilde prosessen er fullført. Lagre bildedata for ytterligere dataanalyse.
  6. Slå av femtosecond laser og konfokalmikroskopi mikroskop etter eksperimentet.

6. bevegelse av mitokondrie membran potensial på Target mitokondrier i Hela celler ved femtosecond laser stimulering

  1. Forbered Hela celler følge trinnene 2.1.1-2.1.6.
  2. Ruge cellene i 24 timer ved 37 ° c før eksperimentet.
  3. Klargjør TMRM farge løsning: fortynne TMRM i 1 mL DMEM med 10% FBS til en endelig konsentrasjon på 100 nM.
  4. Ta parabolen med celler fremstilt i trinn 5.2.1 og 5.2.2 ut av inkubator. Fjern kultur mediet. Legg til TMRM farge løsning fremstilt i trinn 6,3 i fatet. Stain for 15-20 min ved 37 ° c i inkubator. Fjern farge løsningen. Vask cellene med PBS gang. Tilsett 1 mL kultur medium i fatet.
  5. Slå på femtosecond laser og kontroller at lukkeren er lukket.
  6. Slå på laserskanning konfokalmikroskopi mikroskop. Åpne programvaren for mikroskopet. Sett eksitasjon laser ved 532 nm. Sett strømnivået på 532 nm laser ved 0,1 mW. Sette tenkelig størrelse idet 512 x 512 pixels og rammen generasjon tid for 2,2 s. Angi intervalltiden mellom to rammer ved 0 s. Angi totalt bildebehandlings RAM mer som 200 rammer for å gi ~ 440 s kontinuerlige mikroskopi i et enkelt eksperiment.
    Merk: Intervallet for to tilstøtende rammer, total bildebehandling rammer og Imaging tid for kontinuerlig mikroskopi kan justeres i henhold til eksperimentelle krav.
  7. Klargjør CO2 inkubasjons-systemet beskrevet i trinn 3,3 hvis nødvendig.
  8. Bruk Stim-A-modus for å levere femtosecond laser stimulering til mål mitokondrie. Følg trinn 5.5.1-5.5.8 for å fullføre eksperimentet.
    Merk: I trinn 6,8, Velg en mitokondrie som er godt farget med TMRM som målet mitokondrie.
  9. Slå av femtosecond laser og konfokalmikroskopi mikroskop etter eksperimentet.

7. endringer av Bax og Cytokrom C på Target mitokondrier i Hela celler ved femtosecond laser stimulering

Merk: I dette eksperimentet, frø cellene i Petri retter med celleplassering nett (figur 3b) for å lokalisere cellen som er behandlet av femtosecond laser. Stain cellene med TMRM å lokalisere mitokondrie som er valgt for å bli stimulert av femtosecond laser.

  1. Forbered Hela celler i en Petri parabol med celleplassering nett (figur 3b) som beskrevet i trinn 4,1.
  2. Stain cellene med TMRM som beskrevet i trinn 6,3 og 6,4.
  3. Slå på femtosecond laser og kontroller at lukkeren er lukket.
  4. Slå på laserskanning konfokalmikroskopi mikroskop. Åpne programvaren for mikroskopet. Sett eksitasjon laser ved 532 nm. Sett strømnivået på 532 nm laser ved 0,1 mW. Sette tenkelig størrelse idet 512 x 512 pixels og rammen generasjon tid for 2,2 s. Angi intervalltiden mellom to rammer ved 0 s. Angi totalt bildebehandlings RAM mer som 50 rammer for å gi ~ 110 s kontinuerlige mikroskopi i et enkelt eksperiment.
  5. Levere femtosecond laser stimulering til mål mitokondrie ved hjelp av Stim-A-modus
    1. Still inn kraften i femtosecond laser ved 5-30 mW (810 NM), 10-40 mW (1040 NM) ved prøven. Angi åpningstid for lukkeren ved 0,05-0,1 s.
    2. Ta parabolen inneholder celler beiset med fra inkubator og sette parabolen på mikroskopet scenen.
    3. Bruk rask skanning modus for å velge målcellen som er godt farget med TMRM.
    4. Flytt scenen for å lokalisere målet mitokondrie rørformede struktur i sentrum av FOV ved hjelp av rask skanning modus. Merk koordinaten til rutenettet som den merkede cellen er plassert under klar bilde.
    5. Klikk på Start nederst for å starte kontinuerlig mikroskopi Imaging fremgang.
    6. Åpne lukkeren til enhver forhåndsdefinert tid for mikroskopi Imaging fremdrift manuelt for å levere femtosecond laser stimulering designet i trinn 7.5.1 inn i målet mitokondrie rørformede struktur.
    7. Vent til bilde prosessen er fullført. Merk den valgte mitokondrie som er simulert av femtosecond laser. Lagre bildedata for ytterligere dataanalyse.
    8. Slå av femtosecond laser og konfokalmikroskopi mikroskop etter eksperimentet. Forbered immunofluorescence mikroskopi av Bax eller cytokrom C på eksperiment cellene.
  6. Immunofluorescence mikroskopi av Bax eller Cytokrom C på den femtosecond laser behandlet mitokondrie.
    1. Ta parabolen fra mikroskopet scenen.
    2. Fullfør immunofluorescent farging av Bax eller cytokrom C Følg trinnene 4.7.1-4.7.9.
      Merk: Bruk anti-Bax eller anti-cytokrom C i stedet for anti-eIF4E i trinn 4.7.5 å fullføre immunofluorescent farging av Bax eller cytokrom C i trinn 7.6.2.
    3. Slå på konfokalmikroskopi mikroskop for laserskanning og åpne mikroskop programvaren. Sett eksitasjon laser ved 488 NM og 532 nm. Sett strømnivået på 488 NM og 532 nm laser ved 0,1 mW. Sette tenkelig størrelse idet 512 x 512 pixels og rammen generasjon tid for 2,2 s.
    4. Sett parabolen med immunofluorescent flekker celler på mikroskopet scenen. Finne det valgt gitter under lys-åker tenkelig av det CCD kameraet. Finn cellen som er behandlet av femtosecond laser.
    5. Start enkelt bilde konfokalmikroskopi skanning. Finn mitokondrie som stimuleres av femtosecond laser. Lagre fluorescerende bilde av photostimulation celle for ytterligere dataanalyse.
  7. Slå av konfokalmikroskopi mikroskop etter eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Photostimulation kan utføres samtidig sammen med kontinuerlig konfokalmikroskopi skanning mikroskopi. Photostimulation kan starte ved en forhåndsdefinert tidsperiode i tidsforløp konfokalmikroskopi mikroskopi sekvens. Den konfokalmikroskopi mikroskopi kan overvåke cellulære molekyler ved fluorescerende bilder. Den molekylære reaksjoner på photostimulation og andre dynamikk kan identifiseres på denne måten. Teoretisk sett, hvis ERK er aktivert, vil det være fosforylert flytte fra cytoplasma til cellekjernen27. Den spesifikke cellen skjebne kan reguleres av visse mønstre av denne ERK signal28. I nyere studier, optisk modulering basert på optogentics har gitt en høypresis kontroll av ERK signal i varighet og omfang, og avslørte at perturbed ERK signaloverføring dynamikk stasjoner upassende spredning i kreftceller7, 8i den. Her viser vi ERK2 translokasjon i kjernen etter behandling av celle med en kort Flash av femtosecond laser ved hjelp av metoden som presenteres i denne protokollen. Som vist i figur 5a, når ERK2-GFP fluorescens maksimalt etter flere minutter med femtosecond laser simulering. Den ERK2 molekyler vil bli dephosphorylated etter aktivering nedstrøms underlag i kjernen, og deretter ERK2 kommer tilbake til cytoplasma indikert av synkende kjernefysiske GFP fluorescens. ERK2 kan aktiveres for flere ganger av flere photostimulations (figur 5B). Derfor er det i stand til å manipulere ERK2 signal mønsteret presist ved å kontrollere intervalltid mellom flere stimuli. I tillegg kan ERK2 aktiveres i tilstøtende celler rundt stimulert cellen og til (figur 5c). Denne observasjonen indikerer at noen ekstremt molekyler kan frigjøres ved cellen behandlet med femtosecond laser for å aktivere ERK2 i de tilstøtende cellene. Fosforylering av ERK2 nedstrøms protein eIF4E kan bekreftes og visualisere av immunofluorescence mikroskopi (figur 5D). Dette resultatet indikerer at femtosecond laser stimulering kan lykkes med å aktivere ERK signal vei. Mer detaljerte resultater er i Wang S., et al.22.

Mitokondrie oksidativt Blink (mitoflashes) er oksidativt utbrudd i mitokondrier som rot fra komplekse mitokondrie molekylær dynamikk. I siste ti år, mitoflashes er realisert å være en elementær mitokondrier signalering hendelse og ta en viktig rolle i multitudinous celle funksjoner29,30,31. Tradisjonelt er mitoflashes vanligvis observert ved en tilfeldighet når behandling av celler med kjemikalier for å gi indirekte stress til mitokondrier29,30. Ved å implementere denne photostimulation ordningen, oppnår vi en kontrollerbar og presis måte å opphisse mitoflashes på enkelt mitokondrie rørformede nivå. Den vellykkede mitoflash eksitasjon er vist i figur 6a. Interessant, egenskapene til mitoflashes som puls topp, bredde og respons varigheter32 er nært knyttet til femtosecond laser effekt. Mer detaljert kvantitativ analyse av mitoflashes opphisset av femtosecond laser stimulering er i Wang S., et al.32. Denne photostimulation til mitokondrier viser også varianter av mitokondrie molekyl dynamikk, inkludert fragmentering og restaurering av mitokondrie morfologi (figur 6b), og bevegelse av mitokondrie membran potensiale ( Figur 6C). I likhet med foto-aktiverte mitoflashes, har disse mitokondrier hendelsene ulik ytelse med ulik effekt av photostimulation. Det er forskjellig fra aktivering av ERK signalering veien. Innflytelsen av femtosecond laser er høylig innskrenket opp på en enkelt mitokondrie rør. Mer detaljerte resultater er i Wang Y., et al. 24 og Shi F., et al. 25på.

Figure 1
Figur 1: photostimulation ordningen opprettet på en femtosecond laser kopling til et konfokalmikroskopi mikroskop. (A) optiske baner (B) photostimulation og konfokalmikroskopi bildesystem. Den femtosecond laseren er først delt av en 50/50 stråle splitter i to bjelker. Overføringen utvides av et relé teleskop og reflekteres deretter inn i målsettingen for å danne Stim-A. Den refleksjon strålen er justert gjennom mikroskop skanning system for å danne Stim-B. En CCD kameraet brukes å skaffe en lys-katt tenkelig å dataskjerm celler og fokusere av femtosecond laser inne Stim-en måte. Stim-A = et fast fokus i sentrum av FOV; Stim-B = en spesiell skanne ramme på pre-designede området. DM = dichroic speil, BS = stråle splitter, RM = reflekterende speil. Bølgelengden til konfokalmikroskopi skanning laser er 488 NM/532 nm/635 NM, og typisk samling bølgelengde intervall av fluorescens er < 560 NM/560-625 NM/> 625 NM. Den fiber femtosecond laser (1 040 NM, 120 FS, 50 MHz, 1 W) kan erstattes av en ti = Sapphire laser (810 NM, 80 MHz, 65 FS, 1 W) eller andre kommersielle femtosecond laser oscillatorer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: i Stim-A-modus er lokalisering og størrelse på femtosecond laser fokus på målcellen ved konfokalmikroskopi bilde plan under lys-katt bildebehandling. (A) femtosecond laser er blokkert av lukkeren. (B) femtosecond laser er på. Pil: referanse pilen er innstilt i midten av FOV for å bekrefte at femtosecond laser fokus finner riktig posisjon. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Petri parabolen brukes for cellekultur, transfeksjoner og photostimulation eksperimenter. (A) 35 mm Petri parabolen med en 15 mm diameter og 0,17 mm tykkelse glassbunn. (B) den 35 mm Petri parabolen med et glassbunn og en trykt 500 μm celleplassering rutenett. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: CO2 inkubasjons-systemet. (A) co2 inkubator scenen og (B) kontrollpanelet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: erk photoactivation ved hjelp av Stim-A-modus. (A) enkelt bilde stimulans (1 040 nm, 40 mW, 0,1 s) induserer ERK2-GFP translokasjon i kjernen og deretter tilbake til cytoplasma. (B) ERK2 signal mønster formidlet av enkelt femtosecond laser eksponering (rød pil, 1 040 nm, 40 mW, 0,1 s) og to photostimulations (grønne piler, 810 NM, 30 mW, 0,1 s). (C) erk aktivering i omkringliggende celler ved enkelt kort femtosecond laser eksponering i målcellen (hvit pil, 810 NM, 24 mW, 0,2 s). (D) Immunofluorescence av EIF4E-P viser en betydelig økning 24 timer etter én photosimulation (810 NM, 25 mW, 0,2 s). Scale bar = 10 μm (A), og 20 μm (B, C). Den fluorescens av ERK2-GFP og eIF4E-P er begeistret av 488 NM eksitasjon laser og samlet i < 560 NM kanal. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: flere mitokondrier hendelser indusert av photostimulation under Stim-A-modus. (A) eksitasjon av mitoflash på stimulert mitokondrie tubule av enkelt stimulans (810 NM, 16 mW, 0,1 s). (B) mitokondrier morfologiske fragmentering og restaurering indusert av enkelt photostimulation (1 040 NM, 30 mW, 0,1 s). (C) bevegelse av mitokondrie membran potensial ved enkel femtosecond laser stimulering (1040 NM, 20 mW, 0,1 s). Pilene i (A) (B) og (C) angir posisjonen til photostimulations. Scale bar = 10 μm. Den fluorescens av mito-GFP eller Mt-cpYFP er begeistret av 488 NM eksitasjon laser og samlet i < 560 NM kanal. Det fluorescens av TMRM er opphisset av 532 nm eksitasjon laser og avhentet inne 560-625 NM kanalen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

0,05 s 0,1 s 0,2 s 0,5 s
810 NM, 65 FS, 80 MHz 20-65 mW 10-60 mW 5-50 mW 5-40 mW
1040 NM, 120 FS, 50 MHz 30-100 mW 20-80 mW 15-70 mW 10-60 mW

Tabell 1: Anbefalt stimulering varighet og gjennomsnittlig effekt av femtosecond laser i Stim-A-modus.

0,05 s 0,1 s 0,2 s 0,5 s
810 NM, 65 FS, 80 MHz 25-40 mW 20-30 mW 15-25 mW 10-25 mW
1040 NM, 120 FS, 50 MHz 40-60 mW 30-50 mW 25-40 mW 20-30 mW

Tabell 2: Anbefalt stimulering varighet og gjennomsnittlig effekt av femtosecond laser i Stim-A-modus ved 2 x 2-3 x 3 μm 2 andre priser i cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi demonstrerer en photostimulation strategi ved å kombinere en femtosecond laser med et laserskanning konfokalmikroskopi mikroskop system. Photostimulation kan direkte fungere som en to-Foton mikroskopi ved å definere Stim-B tilsvarende. Vi gir en detaljert protokoll for å utnytte en kort Flash av femtosecond laser for å utløse ERK signalering eller mitoflashes i målceller. De ulike stimulering moduser kan utføres i henhold til ulike eksperimentelle formål og systemer. Stim-A kan enkelt settes opp basert på et konfokalmikroskopi mikroskop. Den femtosecond laseren kan fokuseres på Diffraksjon-nivå ved FOV-senteret. Subcellulære målet må flyttes til femtosecond laser fokus posisjon manuelt og kan stimuleres for vilkårlig varighet, helt uavhengig av konfokalmikroskopi mikroskopi. Derfor kan Stim-A beskytte prøven som er ute av fokusområdet perfekt og er egnet for lang varighet photostimulation. Stimulering regionen av Stim-B kan være forhåndsdefinert som ethvert område i FOV. Den kan utføres automatisk. Men stimulering varighet og eksponeringstid kan bare følge sammen med konfokalmikroskopi skanning. Når du har angitt botid for hver piksel og den totale rammestørrelsen, blir stimulering varigheten i en enkelt mikroskopi ramme faktisk fast. Photostimulation kan også utføres periodisk bilde for bilde. Den kan også brukes til å aktivere fotosensibilisatorer og optogenetic proteiner som krever mindre eksponerings varighet, men stort område.

En kritisk vurdering i denne protokollen er hvordan man skal bestemme parametrene for femtosecond laser stimulering. Ifølge våre tidligere studier, cellular molekylær aktivitet er hovedsakelig indusert av multiphoton exaction17,21,22,23,24,25. Vanligvis multiphoton exaction effektivitet er relatert med alle femtosecond laser parametre inkludert bølgelengde, pulsbredde, repetisjon rate. Den cellulære responsen er videre relatert til laser kraft, stimulering posisjon/region, og eksponerings varighet samtidig. I prinsippet er stimulering effektiviteten i konflikt med celle sikkerhet. Sterkere photostimulation som høyere gjennomsnittlig kraft, lengre stimulering varighet og større total hendelse laser energi bidrar til høyere stimulering effektivitet men gir høyere risiko for celle skade. Siden disse parametrene er også relative med hverandre og alle bidra til stimulering og skade effekt, er det umulig å bruke bare én parameter, som den totale hendelsen laser energi, eller laser gjennomsnittlig strøm, for å definere det er trygt eller ikke. I betraktning av både signal aktiverings effektivitet og celle sikkerhet, her gir vi anbefalt gjennomsnittlig effekt-og stimulering varighet av to femtosecond laser kilde for referanse i tabell 1 og tabell 2. Dessuten bør parametrene av femtosecond laser stimulering endres i henhold til den faktiske optiske systemet og biologisk prøve.

Ifølge diskusjonene ovenfor, har vi til hensikt å presentere mer detaljerte effektive områder av photostimulation parametre. Bølgelengden til femtosecond laser kan endres ved NIR-serien som brukes til photostimulation. Puls bredden bør være kort for å gi en høy topp effekt og høy ikke-lineær exaction effektivitet. Lang puls varighet anbefales ikke for denne protokollen. Vanligvis, det typisk impuls bredde for to-Foton mikroskopi (< 200 FS) er det lated valget. Den gjentakelse rate av laseren er ikke en nøkkelfaktor. Det gjentagelse rate til MHz er egnet til denne protokollen. Den mest kritiske faktoren for cellulære molekylære responser er laser effekt og stimulering varighet av femtosecond laser. For å aktivere ERK, i henhold til vår tidligere arbeid22, gjennomsnittlig kraft ved 15 mw (810 NM) eller 20 mW (1 040 NM) og eksponeringstid på 0,2 s er nok til å gi tilstrekkelig stimulering for å aktivere erk signalering og samtidig opprettholde beryllium celle levedyktighet i Jakten celler. Tvert imot, gjennomsnittlig kraft over 80 mW (810 NM) eller 120 mW (1 040 NM) og eksponerings varighet lenger enn 1 s kan indusere irreversible skader på celler. Mitokondrier er generelt mer følsomme for photostimulation. Stimulering med en gjennomsnittlig effekt høyere enn 40 mW (810 NM) eller 80 mW (1 040 NM) og eksponerings varighet over 0,2 s kan indusere betydelige skader som irreversibel fragmentering i stimulert mitokondrie eller til og med i alle mitokondrier over hele cellen. Det bør bemerkes at Foto av mitokondrier til photostimulation varierer mye i ulike celletyper. For eksempel, i jakten celler, laseren makt trenger bare rundt 6 mW (810 NM, 0,1 s varighet). Alle mitokondrier kan svare på photostimulation i form av fragmentering, mitoflashes og MMP svingninger. Men i humane Mesenchymal stamceller, må strømmen økes til rundt 15 mW (810 NM, 0,1 s varighet), og fortsatt rundt halvparten stimulert mitokondrier viser ingen respons på photostimulation. I Stim-B-modus, en annen faktor kan påvirke bildet aktivisering effektivitet og celle skade er stimulering området. Photostimulation kan forårsake celle skade ved å levere på et lite stimulerende område. Men den samme stimulering kan mislykkes i å aktivere ERK ved å levere på et større stimulering område. Vi anbefaler at stimulering området i målcellen er rundt 2 x 2-3 x 3 μm2 og ikke overstiger 25 μm2.

Lokalisering av stimulering regionen er også viktig for å bruke denne protokollen. Ifølge tidligere arbeider17,22, photostimulation i dette området kan tømme ca2 + store i er effektivt og aktivere CRAC kanalen. Deretter kan ca2 + TILSTRØMNINGEN aktivere erk signalveien senere. Derfor anbefaler vi å levere photostimulation på ER-regionen i Hela celler for å oppnå en høy ERK aktiverings effektivitet. ER-regionen kan lett skilles fra cytoplasma eller kjernen under lyse felt mikroskopi av en fase-kontrast målsetting. For å innføre mitokondrie signal hendelser, kan fokuset for femtosecond laser enkelt monteres på den valgte mitokondrie strukturen etter de relaterte prosedyrene.

Photostimulation metoder beskrevet i denne protokollen er også i stand til å bli brukt til å påvirke andre flere mobilnettet hendelser som inducing ca2 + og ros signaler17,20,21. Det bør bemerkes alle de tidligere verkene har gitt evaluering av celle sikkerhet etter photostimulation. For eksempel betydelige morfologiske endringer av celler, boblende, mitokondrie fragmentering og hevelse i hele cellen, redusert sprednings hastighet av celler, og noen andre uvanlige endringer av fluorescens under konfokalmikroskopi mikroskopi alle innebærer høy skade på cellen. Det bør være svært forsiktig med å overvåke celle status. Likevel, med godt kontroll av laser kraft og stimulering parametre, kan cellen levedyktighet opprettholdes på et svært høyt nivå samtidig med høy stimulering effektivitet. Herav, denne photostimualtion metoden av femtosecond laser er av fint muligheter å fremme forlenge å flere arealer og anvendt inne relevant søknadene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81571719 og 81661168014, 81673014 og 81870055), Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1402300 og 16XD1403100), og National Key R & D plan (2017YFA0104600).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted microscope Olympus
Femtosecond laser Fianium
CO2 incubation system Olympus MIU-IBC
Petri dish NEST 801002
Petri dish with imprinted grid Ibidi 81148
ERK-GFP addgene 37145 A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFP A gift from Heping Cheng's lab
mito-GFP Invitrogen C10508
Tetramethylrhodamine (TMRM) Invitrogen T668 Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6 Dilute in PBS
Paraformaldehyde Solarbio P8430 Dilute in PBS
Triton X-100 Solarbio T8200 Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8 Dilute in PBS
Tween20 Sigma-Aldrich 9005-64-5
anti-eIF4E antibody abcam ab76256
anti-Bax antibody abcam ab53154
anti-cytochrome C antibody abcam ab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) abcam ab150077

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  2. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
  3. Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
  4. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  6. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  7. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  8. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
  9. Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson's disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
  10. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  11. Hoover, E. E., Squier, J. A. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).
  12. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
  13. Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
  14. Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
  15. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  16. Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
  17. He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
  18. Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
  19. Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
  20. He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
  21. Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
  22. Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
  23. Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
  24. Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
  25. Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
  26. Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
  27. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
  28. Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
  29. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134 (2), 279-290 (2008).
  30. Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , Springer. Cham. 403-422 (2016).
  31. Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
  32. Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).

Tags

Biologi femtosecond laser photostimulation ekstracellulære-signal-regulert kinase (ERK) mitokondrier mitoflash biofotonikk
Photostimulation av femtosecond laser aktiverer ekstracellulære-signal-regulert kinase (ERK) signalering eller mitokondrie hendelser i målceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H.… More

Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H. Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells. J. Vis. Exp. (149), e59661, doi:10.3791/59661 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter