Summary
단단히 초점을 맞춘 펨토초 레이저는 공초점 현미경 검사법에 결합되어 세포에 정확한 자극을 전달하여 실시간 관찰 및 광자극을 가능하게 합니다. 광자극은 ERK 신호 통로 및 반응성 산소 종의 미토콘드리아 섬광을 포함한 세포 분자 이벤트를 활성화할 수 있습니다.
Abstract
세포 정의 분자 사건의 직접적인 통제는 생명 과학에 중요합니다. 최근 펨토초 레이저 자극이 여러 세포 분자 신호 경로를 동시에 활성화할 수 있다는 연구 결과가 있습니다. 이 프로토콜에서는 펨토초 레이저를 공초점 현미경으로 결합하여 단단히 초점을 맞춘 레이저에 의해 세포를 정확하게 자극할 수 있음을 보여줍니다. 동시에 관찰 될 수있는 일부 분자 과정은 이후에 활성화됩니다. 우리는 헬라 세포에 있는 세포외 신호 조절 키나아제 (ERK) 신호 통로를 활성화하기 위하여 광자극의 상세한 프로토콜을 제시합니다. 반응성 산소 종 (ROS) 및 기타 미토콘드리아 이벤트의 미토콘드리아 섬광은 또한 특정 미토콘드리아 관 구조에 펨토초 레이저 펄스를 집중하는 경우에 자극될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 사진 자극 전에 세포를 전처리하고, 펨토초 레이저 플래시를 대상으로 광자극을 전달하고, 나중에 분자 변화를 관찰/식별하는 것이 포함됩니다. 이 프로토콜은 관련 생물학적 연구를 위한 모든 광학 도구를 나타냅니다.
Introduction
세포 신호 분자를 제어하는 기술은 생명 과학의 발전의 중요한 부분입니다. 전통적으로 가장 일반적으로 사용되는 방법은 약물 또는 생물학적 물질에 의한 생화학적 치료 1,2,3. 지난 10 년 동안, 광유전학의 발명은 세포 분자 신호 변조를위한 새로운 시대를 엽니 다. 유전자 공학에 의해 빛에 민감한 단백질을 가진 형질감염은 빛을 표적으로 하는 세포에 있는 각종 단백질 활동을 조절하는 강력한 공구가 됩니다. 이 기술은 신경 신호의 여기 및 억제, 유전자 발현 촉진, 세포 신호 패턴 조작, 다른 세포 운명및 병리학 적 조사 선도 4, 5와 같은 촉진적인 진전을 이루었습니다. ,6,7,8,9. 그러나 빛은 광유전학 적 단백질로 세포를 배회하여만 작동 할 수 있습니다. 현재 단계에서는 광유전학 외에 직접 세포 분자를 제어하는 빛을 가능하게하는 드문 방법이 존재합니다.
펨토초 레이저는 좋은 생물학적 안전성을 유지하면서 효율적인 다원화 여기를 제공함으로써 생물학적 연구를 발전시켰습니다. 다양한 광처리 전략을 전개하여 다광자 현미경, 현미경 검사법, 다광자 광유전학 응용 분야10,11,12,13 등 수많은 성과를 실현했습니다. ,14,15,16. 최근 조사에 따르면 펨토초 레이저 자극은 분자 신호 이벤트를 직접 유도하는 고효율 광학 방법으로 입증되었습니다. 그것은 안 구 체 망상에 단단히 초점을 맞춘 펨토 초 레이저 조사 (ER) ER에서 칼슘을 고갈 하 고 칼슘 방출 활성화 칼슘 (CRAC) 채널을 활성화 하는 세포에서 칼슘 신호를 형성 할 수 발견되었다 17. 이 사진 활성화 칼슘 신호는 세포의 여러 유형 사이에 확산 될 수있다18,19,20. 더욱이, 또한 활성화된 T세포(NFAT) 및 ERK 신호통로(21,22)의핵인자와 같은 세포 신호경로를 활성화시키는 기능도 있다. 세포에서 펨토초 레이저 노출의 강도와 국소화를 조정함으로써, 예를 들어, 미토콘드리아에 레이저를 집중시킴으로써, 미토콘드리아 형태및 분자 사건에 영향을 미칠 수 있다23,24, 25. 특히, 미토콘드리아 ROS 생성의 파열은 미토콘드리아 (mitoflashes)에서 형광섬으로 언급되는 사진 자극에 의해 흥분 될 수 있습니다.
따라서, 광자극 기술은 관련 생물학적 연구에 널리 적용될 수 있는 좋은 잠재력이다. 또한 현미경 검사법 외에 세포 신호 분자 및 기능을 제어하는 펨토초 레이저 응용 프로그램을 확장할 수 있는 좋은 기회이기도 합니다. 여기에서는 사진 의 기술적 세부 사항을 제공합니다. 광자극은 펨토초 레이저를 공초점 현미경에 결합하여 단일 표적 세포에 짧은 플래시 광자극을 제공함으로써 달성됩니다. 그것은 세포에서 효율적이고 제어 가능한 ERK 활성화를 시작할 수 있습니다. 광자극이 미토콘드리아 관 구조상에 위치하는 경우, 미토콘드리아 막 전위, 형태학, ROS 및 투과성 전이 기공, 모두 광자극에 의해 제어될 수 있다. 이 광자극 계획에 기초하여, 우리는 ERK 신호 경로를 활성화하고 헬라 세포에 있는 다중 미토콘드리아 사건에 영향을 미치는 상세한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 펨토초 레이저 자극을 표적 세포로 전달하는 과정을 설명합니다.
광자극 시스템은 펨토초 레이저 커플링을 통해 동시 자극및 연속 현미경 검사를 위해 공초점 현미경에 설치됩니다. 펨토초 레이저(파장: 1,040 nm, 반복 속도: 50MHz, 펄스 폭: 120 fs, 최대 출력 평균 전력: 1W)는 커플링 전에 두 개의 빔으로 분할됩니다. 하나는 한 쌍의 렌즈로 구성된 릴레이 망원경을 통해 안내됩니다. 이어서 회절 한계 초점(Stim-A)을 형성하기 위해 목표(60x, N.A. = 1.2, 수지 침지)의 후면 조리개에 직접 반영된다. 다른 하나는 공초점 현미경의 스캐닝 광학 경로에 반영되어 2광자 스캐닝 모드(Stim-B)로 작동한다. Stim-A는 시야 중심(FOV)에 고정 된 초점 점을 제공합니다. Stim-B는 FOV에서 미리 설계된 부분 공초점 스캐닝 영역입니다. 스팀-A 와 스팀-B는 그림 1A에나와 있다. DM(이색 거울) 아래의 CCD 카메라는 펨토초 레이저의 초점을 모니터링하기 위한 밝은 필드 이미징을 제공합니다.
다음 실험에 대 한 몇 가지 중요 한 필수 가 있습니다. 이 프로토콜에서 펨토초 광섬유 레이저 소스(1040 nm, 50 MHz, 120 fs)가 예로 사용된다. 실제로 대부분의 상용 펨토초 발진기는 펄스 폭이 200 fs보다 짧고 피크 전력 밀도가 1011 ~ 1012 W/cm2 의 수준 이상이어야하는 한 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Ti: 사파이어 레이저는 일반적으로 다광자 현미경 검사법에 사용되는 펨토초 레이저를 도 1B에나타내어 대체할 수 있다. 레이저 전력 및 기타 광자극 파라미터는 광학 파라미터(펄스 폭, 파장 및 반복 속도)가 서로 다른 펨토초 레이저에서 많이 다르기 때문에 조정되어야 하므로 다양한 다원화 여기 효율을 유도합니다.
펨토초 레이저 자극과 함께 공초점 현미경은 연속 세포 이미징을 제공하여 Stim-A 및 Stim-B 모드에서 분자 역학을 실시간으로 모니터링합니다. 두 광 자극 방식(Stim-A 및 Stim-B)은 밀리초 해상도의기계식 셔터에 의해 제어됩니다(그림 1).
Stim-A 모드에서는 레이저 초점의 위치가 FOV 의 중심에 고정됩니다. 릴레이 망원경은 수직 방향으로 두 렌즈 사이의 거리를 조정하여 공초점 이미징 평면에 위치하는 펨토초 레이저의 초점을 보장하기 위해 사용됩니다 (레이저 전파 방향, 공초점 이미징 평면에 수직 그림1). CCD 카메라의 밝은 필드 이미징에 의해, 레이저 초점의 직경을 측정할 수 있다(~2 μm, 도 2B). 공초점 이미징 프로세스 동안 자극 지속 시간과 노출 시간은 셔터에 의해 제어됩니다.
Stim-B 모드에서 자극 영역은 선, 다각형 또는 원과 같은 임의의 형태로 공초점 이미징 제어 소프트웨어에 수동으로 미리 할당될 수 있습니다. 셔터는 공초점 스캐닝 프로세스와 동기화됩니다. 공초점 이미징 제어 소프트웨어를 통해 설정된 미리 설계된 시간에 열립니다. 이어서, 자극 영역은 공초점 현미경으로 펨토초 레이저에 의해 스캔된다. 따라서, 샘플은 공초점 스캐닝 과정이 주어진 이미징 프레임에 들어갈 때 펨토초 레이저에 의해서만 자극된다.
광자극 시스템은 실험 대상자에 따라 역및 직립 야금 현미경 모두에 확립될 수 있다. 페트리 접시에서 배양 된 시험관 내 세포는 거꾸로 된 현미경으로 작업하는 것이 좋습니다. 동물, 특히 살아있는 동물의 뇌는 직립 현미경으로 더 적합합니다. 이 연구에서는, 우리는 거꾸로 된 현미경을 예로 들기. 페트리 접시의 덮개는 전체 실험 중에 열리지 않는다는 점에 유의해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
주의 사항: 아래에 제시된 프로토콜은 NIR 펨토초 레이저 및 독성 화학물질을 사용하는 것을 포함한다. 실험 절차에 의해 유발되는 모든 가능한 손해에 주의하십시오. 사용하기 전에 모든 관련 화학 물질 또는 기타 재료의 안전 데이터 시트를 읽으십시오. 레이저 소스를 작동하기 전에 레이저 시설의 안전 지침을 따르거나 전문가와 상의하여 안내하십시오.
1. 실험 준비
- 포토티마레이션 시스템 설정
참고: 이 시스템은 펨토초 레이저와 레이저(형광 여기를 위한 가시 범위) 스캐닝 공초점 현미경으로 구성됩니다. 도1에서, 섬유 펨토초 레이저(1,040 nm, 50 MHz, 120 fs, 1W)는 커플링에 사용된다. 매개 변수가 고정되거나 필요하지 않습니다. NIR 범위의 사파이어 레이저 또는 기타 상업용 펨토초 발진기로 대체할 수 있습니다.- 펨토초 레이저와 공초점 현미경을 조정합니다.
참고: 광학 경로를 조정하는 과정에서 펨토초 레이저 파워를 낮은 레벨(~50mW)으로 설정하십시오. - 도 1B에나타난 반사 거울(RM1 및 RM2)을 사용하여 기계식 셔터를 통해 펨토초 레이저 빔을 직접 사용하십시오. 셔터를 엽니다.
- 펨토초 레이저 빔을 두 개의 별도 빔(투과 빔 및 반사 빔)으로 분할하도록 50/50 빔 스플리터(BS, 그림 1B)를설정합니다. 펨토초 레이저 빔이 스캐닝 레이저 빔과 일치하도록 RM2 및 BS를 조종합니다.
참고: (1) 긴 패스 이색 거울 뒤에 있는 참조 홍채(Iris 1, 도 1B)(DM, 700 nm 컷온 파장, 도 1B)는스캐닝 레이저 경로를 포지셔닝하는 데 사용된다. (2) 시스템은 각각 Stim-A 또는 Stim-B 모드에서만 작동할 수 있습니다. Stim-A 모드의 경우 BS를 제거할 수 있습니다. Stim-B의 경우 BS를 RM으로 대체할 수 있습니다. - 렌즈 쌍으로 구성된 릴레이 망원경을 설정하여 계수빔 폭을 확장하며, 이는 목적의 후면 조리개로 구성됩니다.
참고: (1) 기준 홍채 2및 3 (도 1B)은 펨토초 레이저 빔을 충돌하도록 설정된다(도1B). (2) 릴레이 망원경의 배율은 펨토초 레이저 빔의 원래 직경과 목표의 후면 조리개 직경에 따라 달라집니다. - 확장된 빔을 현미경으로 정렬하려면 RM(RM 3-5, 그림 1B)을조종합니다. RM 4와 RM 5를 조종하여 펨토초 레이저의 초점을 FOV 중앙에 조정합니다.
- 펨토초 레이저의 목적의 투과 효율을 측정합니다.
참고: 이러한 두 모드에서 레이저의 침투 경로가 다르기 때문에 Stim-A와 Stim-B에서 레이저 전력을 각각 측정하십시오. 그것은 아래의 관련 실험 절차를 설명하기 위해 표본에서 전력을 사용합니다. - 실험이 시작될 때까지 셔터, 펨토초 레이저 및 공초점 현미경을 조정합니다.
참고: 다음 실험에서는 Stim-A와 Stim-B가 함께 작동하지 않습니다. Stim-A를 사용하는 경우 Stim-B의 펨토초 레이저 빔을 차단해야 합니다. 반면에 시스템이 Stim-B 모드에서 작동하는 경우 Stim-A의 빔을 차단해야 합니다.
- 펨토초 레이저와 공초점 현미경을 조정합니다.
- 배양 배지 를 준비하십시오 : Dulbecco의 수정 된 독수리 배지 (DMEM) 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 가진 높은 포도당.
- ERK2-GFP DNA 플라스미드, 미토-GFP DNA 플라스미드 및 미토콘드리아 매트릭스 표적화 원형 투과 황색 형광 단백질(mt-cpYFP) DNA 플라스미드를 준비시다. 플라스미드를 사용할 때까지 -20°C에서 유지합니다.
- 테트라메틸호다민(TMRM, 100 μM) 및 폴리에틸렌민(PEI 1 mg/mL)을 준비합니다. 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
- 5% 파라포름데히드, 0.5% 트리톤 X-100, 항eIF4E(진핵 번역 개시 인자 4E), 항체(형광체 S209, 1 mg/mL), 항박스 항체(1 mg/mL), 항시크롬 C 항체(1 mg/mL), 이차 항체(항-이그/ML), 이차 항체(항-이그래치H&H&H 알렉사 플루어 488, 1 mg/mL), 그리고 1% BSA 와 0.1% Tween20. 사용 전까지 이 시약을 4°C에서 유지하십시오.
- 멸균 재료 준비: 세포 배양 병, 유리 슬라이드 바닥이있는 페트리 접시 (그림3A),유리 바닥이있는 요리, 각인 된 500 μm 셀 위치 그리드 (그림3B,광 자극 세포를 국소화하기 위해), 1.5 mL 및 10 mL 튜브, 1 mL, 100 μL 및 10 μL 파이펫 및 팁.
- 표준 세포 배양 실험실 장비를 준비: 5% CO2 및 37°C에 설정된 세포 배양 인큐베이터, 및 생물학적 안전 캐비닛.
2. 세포 배양 및 형질 감염
참고: 헬라세포(헨리에타 부족로부터 1951년 2월 8일에 채취된 자궁경부암세포로부터 유래된 세포주)26은 본 프로토콜의 예로 사용된다.
-
세포 통로
- 충분한 세포를 함유하는 세포 배양 병으로부터 배양 배지를 제거한다.
- 인산완식염수린(PBS) 2mL로 병을 씻으시다. PBS를 제거합니다.
- 트립신 1mL를 천천히 넣고 병을 약간 두드려 보세요. 병을 인큐베이터에 다시 넣고 37°C에서 3분 동안 세포를 배양합니다.
- 트립신을 제거합니다. 배양 배지 2-3 mL를 추가합니다. 배지를 여러 번 피펫하여 세포가 분리될 수 있도록 하였다. 세포와 함께 배지를 10 mL 튜브로 옮김을 옮김.
- 세포 계수를 위해 튜브에서 샘플의 10 μL을 가져 가라.
- 종자 ~25,000 세포를 페트리 접시에 넣고 (도3A)최대 1 mL의 배양 배지를 첨가한다.
- 접시에 포함 된 세포를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 형질전환 전에 37°C에서 세포 24h를 배양한다.
-
세포 형질감염
- 접시당 트랜스펙션을 위해 0.5 μg의 DNA 플라스미드(ERK2-GFP, 미토-GFP 또는 mt-cpYFP)를 사용하십시오. 플라스미드 0.5 μg와 PEI 2.5 μg를 1.5 mL 튜브에 DMEM 50 μL에 넣습니다. 실온에서 혼합 매체를 10 분 배양합니다.
- 인큐베이터에서 세포와 접시를 가져 가라. 배양 배지를 DMEM 의 1mL로 바꿉습니다.
- DNA/PEI 혼합 매체를 세포에 한 방울씩 넣습니다. 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- 37°C에서 세포를 3시간 배양하고 DMEM DNA/PEI 혼합 배지를 배양 배지의 1 mL로 대체합니다.
- 배양 형질감염 세포는 37°C에서 24시간 후 광자극 실험을 한다.
3. 펨토초 레이저의 광자극에 의한 ERK2 활성화
- 펨토초 레이저를 켜고 셔터가 닫혀 있는지 확인합니다.
- 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 켜고 현미경 소프트웨어를 엽니다. 여기 레이저를 488 nm로 설정합니다. 0.1 mW에서 488 nm 레이저의 전력 레벨을 설정합니다. 이미징 크기를 512 x 512 픽셀로 설정합니다. 각 픽셀의 간격 시간을 2.4μs로 설정합니다. 두 프레임 사이의 간격 시간을 6s로 설정하여 광표백 및 세포 에 대한 광손상을 최소화합니다. 개별 실험에서 ~ 30분 연속 현미경을 제공하기 위해 약 300 프레임에서 총 이미징 프레임을 설정합니다.
참고: 두 개의 인접한 프레임, 총 이미징 프레임 및 연속 현미경 의 이미징 시간은 실험 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다. 개별 실험이 2시간 이상 지속되는 경우, 세포 생존가능성을 유지하기 위한 5% CO2 및 37°C의 환경을 제공하기 위해 3.3단계에 존재하는 현미경에 대해 CO2 인큐베이션 시스템(그림 4에나타남)을 설정하십시오. 개별 실험이 2시간 이내에 제한되는 경우, CO2 배양 시스템은 필요하지 않다. - CO2 인큐베이션 시스템을 켜고 모든 히터를 켜고 작동 온도를 37 °C로 설정합니다. 온도가 37 °C까지 올라갈 때까지 대기하고CO2 농도는 최대 5 %까지 기다립니다. 그림 4A에나타난 바와 같이 현미경 스테이지에 인큐베이터 스테이지를 놓습니다.
- 2단계에서 기재된 바와 같이 ERK2-GFP로 형질감염된 헬라 세포를 준비한다.
참고: 개별 실험에서, 세포에 광자극을 전달하기 위해 스팀-A 또는 스팀-B 방식이 적용된다. 단계 3.5 및 3.6 각각 Stim-A 및 Stim-B에서 상세한 단계를 제시합니다. - Stim-A 모드를 사용하여 펨토초 레이저 자극을 대상 세포에 전달
참고: 사진 자극 절차 전에 초점의 직경이 약 2 μm인지 확인하십시오. 이 과정은 3.5.1 단계 및 3.5.2 단계에 설명되어 있습니다.- 인큐베이터에서 ERK2-GFP로 트랜스된 세포를 함유한 접시를 가지고 현미경 스테이지에 접시를 놓습니다.
- 현미경 작동 소프트웨어를 통해 빠른 스캐닝 모드를 시작합니다. 세포의 명확한 형광 이미지를 얻기 위해 목표를 조정합니다. 빠른 스캔을 중지합니다. CCD 카메라(그림 2A)에서 밝은필드 이미징 모드로 전환합니다. 셔터를 열고 릴레이 망원경의 두 렌즈 사이의 거리를 조정하여 펨토초 레이저 초점의 직경을~ 2 μm(도 2B)로 유지합니다. 셔터를 닫고 조정을 완료합니다.
참고: 레이저 포커스를 나타내기 위해 참조 화살표를 레이블링할 수 있습니다(그림 2). 그 동안, 참조 화살표는 펨토초 레이저의 초점의 위치를 나타내기 위해 형광 이미징 창의 중심에 설정할 수 있습니다. - 표본에서 펨토초 레이저의 전력을 15-40mW(810nm, 65fs, 80MHz) 또는 20-60mW(1040nm, 120fs, 50MHz)로 설정합니다. 셔터의 개통 시간을 0.05-0.2s로 설정합니다.
- 빠른 스캐닝 모드를 사용하여 잘 표현된 대상 셀을 ERK2-GFP로 선택합니다.
- CCD 카메라의 밝은 필드 이미징 하에서 FOV의 중심에 선택된 표적 셀의 시토졸 영역을국소화하기 위해 스테이지를 이동한다(도 2A).
- 연속 현미경 이미징 진행을 시작하려면 시작 하단을 클릭합니다.
- 미리 정의된 모든 시간 슬롯에서 셔터를 열어 3.5.3 단계에서 설계된 펨토초 레이저 자극을 대상 셀에 전달합니다.
참고: (1) 광자극은 셔터에 의해 제어되는 공초점 현미경 시퀀스에서 언제든지 수행될 수 있다. (2) 광자극은 공초점 현미경 시퀀스 동안 동일한 위치에서 여러 번 전달될 수 있다. - 이미징 프로세스가 완료될 때까지 기다립니다. 추가 데이터 분석을 위해 이미징 데이터를 저장합니다.
- Stim-B 모드를 사용하여 펨토초 레이저 자극을 대상 세포에 전달
- 표본에서 펨토초 레이저의 힘을 15-40mW(810nm), 20-60mW(1040nm)로 설정합니다.
- 인큐베이터에서 ERK2-GFP로 트랜스된 세포를 함유한 접시를 현미경 스테이지에 올려 놓습니다.
- 빠른 스캐닝 모드를 사용하여 잘 표현된 대상 셀을 ERK2-GFP로 선택합니다.
- 공초점 이미징 프로세스를 3.2단계로 설정합니다. 특수 스캐닝 프레임을 이미징 프로세스의 자극 프레임으로 정의합니다. 시뮬레이션 프레임의 매개변수를 정의합니다.
- 표적 세포내의 핵에 가까운 시토솔영역에서 스캐닝 영역(2 x 2-3 x 3 μm 2)을 설정한다.
- 0.1-0.2s로 총 스캐닝 시간을 설정합니다. 외출합니다.
참고: (1) 사진 자극 영역은 모든 크기로 설정할 수 있습니다. (2) 광자극은 공초점 현미경 시퀀스에서 미리 정의된 시간 슬롯에서 수행될 수 있다. (3) 광자극은 공초점 현미경 시퀀스에서 FOV에서 동일하거나 상이한 미리 정의된 영역에 대해 여러 번 수행될 수 있다.
- 연속 현미경 이미징 진행을 시작하려면 시작 하단을 클릭합니다.
- 이미징 프로세스가 완료될 때까지 기다립니다. 추가 데이터 분석을 위해 이미징 데이터를 저장합니다.
- 실험 후 펨토초 레이저 및 공초점 현미경을 끕니다.
4. 펨토초 레이저 시뮬레이션에 의한 eIF4E(ERK 기판) 활성화
- 헬라 세포 제제
- 2.1.1-2.1.5 단계를 따릅니다.
- 종자 ~20,000 세포를 세포 위치 격자(도3B)를 이어 페트리 접시에 넣고 광자극세포를 국소화한다. 최대 1mL의 배양 매체를 추가합니다.
- 세포와 접시를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 펨토초 레이저 처리 전에 37°C에서 세포 24를 배양한다.
- 펨토초 레이저를 켜고 셔터가 닫혀 있는지 확인합니다.
- 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 켜고 현미경 소프트웨어를 엽니다.
- 3.3단계에서CO2 인큐베이션 시스템을 문양으로 준비한다.
- Stim-A 모드를 사용하여 펨토초 레이저 자극을 대상 세포에 전달
- 표본에서 펨토초 레이저의 힘을 15-40mW(810nm), 20-60mW(1,040nm)로 설정합니다. 셔터의 개통 시간을 0.05-0.2s로 설정합니다.
- 인큐베이터에서 세포와 접시를 가지고 현미경의 단계에 CO2 인큐베이터에 장착.
- CCD 카메라의 밝은 필드 이미징 아래에서 이미징 평면을 찾기 위해 수직 방향으로 목표를 이동합니다. 시편 스테이지를 수평 방향으로 이동하여 FOV 중앙에 셀이 위치하지 않도록 합니다. 셔터를 열고 릴레이 망원경의 두 렌즈 사이의 거리를 조정하여 펨토초 레이저 초점의 직경을 ~2 μm에서 확인합니다. 셔터를 닫고 조정을 완료합니다.
- 현미경 단계를 이동하여 무작위로 5~10개의 그리드를 선택합니다. CCD 카메라의 밝은 필드 이미징 아래 페트리 접시 하단의 그리드에 의해 표시되고 국한될 수 있습니다. 접시에 선택한 그리드의 좌표를 표시/기록합니다.
- CCD 카메라의 밝은 필드 이미징 아래에서 선택한 그리드에 있는 모든 셀을 하나씩 자극합니다.
- 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 면역형광 현미경 검사법 전에 37°C에서 세포 24를 배양합니다. 광자극 절차 후 펨토초 레이저 및 공초점 현미경을 끕니다.
- ERK 활성화 확인을 위한 광자극을 가진 세포에 있는 인광eIF4E의 면역형광 현미경 검사법
- 인큐베이터에서 4.5단계에서 광자극 처리와 함께 세포를 함유하는 접시를 가져 가라. 배양 배지를 제거합니다. 한 번 PBS로 세포를 씻어. PBS를 제거합니다.
- 접시에 5% 파라포름데히드(4°C)의 1 mL을 추가합니다. 10 분 동안 5 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정. 파라 포름 알데히드 버퍼를 제거합니다. PBS로 세포를 두 번 5 분 동안 씻으하십시오. PBS를 제거합니다.
- 접시에 0.5% 트리톤 X-100의 1 mL을 추가합니다. 실온에서 세포를 15 분 배양하십시오. 트리톤 X-100 버퍼를 제거합니다. PBS로 세포를 두 번 5 분 동안 씻으하십시오. PBS를 제거합니다.
- 접시에 1% BSA 버퍼의 1 mL를 추가합니다. 실온에서 세포를 30 분 배양하십시오. BSA 버퍼를 제거합니다.
- 1% BSA로 1 mL의 PBS에서 항-eIF4E 항체(인산기 S209)를 1 μg/mL의 최종 농도로 희석하였다. 접시에 버퍼를 추가합니다. 4 °C에서 10-12 시간 동안 세포를 배양합니다. 버퍼를 제거합니다.
- PBS로 세포를 두 번 5 분 동안 씻으하십시오. PBS를 제거합니다.
- 이차 항체 항체 인 IgG H&L을 PBS의 1 mL에서 1% BSA로 2 μg/mL의 최종 농도로 희석한다. 접시에 버퍼를 추가합니다. 실온에서 세포를 2 시간 배양하십시오. 버퍼를 제거합니다.
- PBS로 세포를 씻으하십시오. PBS를 제거합니다.
- 접시에 1 mL의 PBS를 추가합니다.
- 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 켭니다. 현미경 소프트웨어를 엽니다. 488 nm에서 여기 레이저를 설정합니다. 0.1 mW에서 488 nm 레이저의 전력 레벨을 설정합니다. 이미징 크기를 512 x 512 픽셀로 설정합니다. 각 픽셀의 간격 시간을 2.4μs로 설정합니다.
- 현미경 단계에 면역 형광 염색 세포와 접시를 넣어. CCD 카메라의 밝은 필드 이미징 아래에서 선택한 상자를 찾습니다.
- 단일 프레임 공초점 스캐닝을 시작합니다. 사진 자극 세포의 형광 사진을 저장합니다.
- 펨토초 레이저 자극 없이 영역을 찾기 위해 스테이지를 무작위로 이동합니다. 단일 프레임 공초점 스캐닝을 시작합니다. 자극 세포의 형광 사진을 제어 데이터로 저장합니다.
- 실험 후 공초점 현미경을 끕니다.
5. 미투속눈썹 및 기타 미토콘드리아 이벤트 활성화
참고: 미토콘드리아 형태역학을 관찰하기 위해, 헬라 세포는 미토콘드리아를 형광적으로 나타내기 위해 5.1단계에서 미토-GFP로 형질감염된다. 미토플라을 관찰하기 위해, 헬라 세포는 5.1단계에서 mt-cpYFP로 형질전환된다.
- 미토-GFP 또는 mt-cpYFP로 감염된 헬라 세포를 2단계 에 따라 준비시다.
- 펨토초 레이저를 켜고 셔터가 닫혀 있는지 확인합니다.
- 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 켭니다. 488 nm에서 여기 레이저를 설정합니다. 0.1 mW에서 488 nm 레이저의 전력 레벨을 설정합니다. 이미징 크기를 512 x 512 픽셀로 설정합니다. 각 프레임의 총 이미징 시간을 2.2s로 설정합니다.
참고: 두 개의 인접한 프레임, 총 이미징 프레임 및 연속 현미경 의 이미징 시간은 실험 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다. - 필요한 경우 3.3단계에서 설명한 바와 같이 CO2 인큐베이션 시스템을 준비한다.
-
Stim-A 모드를 사용하여 타겟 미토콘드리아에 펨토초 레이저 자극 전달
- 인큐베이터에서 미토-GFP 또는 mt-cpYFP로 감염된 세포를 함유한 접시를 가지고 현미경 단계에 접시를 놓습니다.
- 3.5.2 단계로 펨토초 레이저의 상태를 확인합니다. 펨토초 레이저의 초점이 FOV의 중심에 있는지 확인하십시오. 형광 이미징 창의 중앙에 참조 화살표를 설정하여 초점의 위치를 나타냅니다.
- 펨토초 레이저의 힘을 시편에서 5-30mW(810nm), 10-40mW(1040nm)로 설정합니다. 셔터의 개통 시간을 0.05-0.1s로 설정합니다.
- 빠른 스캐닝 모드를 사용하여 잘 표현된 표적 셀인 미토-GFP 또는 mt-cpYFP를 선택합니다.
- 실험 대상체로서 대상 세포에서 무작위로 미토콘드리아 를 선택한다. 빠른 스캐닝 모드로 FOV의 중심에 있는 표적 미토콘드리아 관 구조를 국소화하기 위해 현미경 스테이지를 이동합니다(참조 화살표로 표시).
- 연속 현미경 이미징 진행을 시작하려면 시작 하단을 클릭합니다.
- 미리 정의된 시간에 셔터를 열어 5.5.3 단계에서 설계된 펨토초 레이저 자극을 타겟 미토콘드리아 관 구조로 전달합니다.
참고: (1) 미토콘드리아 관 구조상의 펨토초 레이저 노출은 공초점 현미경 검사법 동안 언제든지 셔터에 의해 제어될 수 있다. (2) 한 펨토초 레이저 자극이 장기간 미토콘드리아 상태를 교란시킬 수 있기 때문에 한 실험에서 펨토초 레이저 노출을 단 한 번만 수행합니다. - 이미징 프로세스가 완료될 때까지 기다립니다. 추가 데이터 분석을 위해 이미징 데이터를 저장합니다.
- 실험 후 펨토초 레이저 및 공초점 현미경을 끕니다.
6. 펨토초 레이저 자극에 의한 헬라 세포의 표적 미토콘드리아에 대한 미토콘드리아 막 전위
- 2.1.1-2.1.6 단계에 따라 헬라 세포를 준비합니다.
- 실험 전에 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양하였다.
- TMRM 염색 용액을 준비하십시오 : 10 % FBS로 DMEM의 1 mL에서 TMRM을 100 nM의 최종 농도로 희석하십시오.
- 인큐베이터에서 5.2.1 단계 및 5.2.2단계로 제조된 세포로 접시를 가져 가라. 배양 배지를 제거합니다. 6.3단계에서 제조된 TMRM 염색 용액을 접시에 넣는다. 인큐베이터에서 37°C에서 15-20분 동안 얼룩을 적시하였다. 염색 용액을 제거합니다. 한 번 PBS로 세포를 씻어. 요리에 배양 배지 1mL를 추가합니다.
- 펨토초 레이저를 켜고 셔터가 닫혀 있는지 확인합니다.
- 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 켭니다. 현미경 소프트웨어를 엽니다. 532 nm에서 여기 레이저를 설정합니다. 0.1 mW에서 532 nm 레이저의 전력 레벨을 설정합니다. 이미징 크기를 512 x 512 픽셀로 설정하고 2.2초로 프레임 생성 시간을 0s에서 두 프레임 사이의 간격 시간을 설정합니다. 총 이미징 프레임을 200 프레임으로 설정하여 개별 실험에서 ~440s의 연속 현미경 을 제공합니다.
참고: 두 개의 인접한 프레임, 총 이미징 프레임 및 연속 현미경 의 이미징 시간은 실험 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다. - 필요한 경우 3.3단계에서 기재된 CO2 인큐베이션 시스템을 준비한다.
- Stim-A 모드를 사용하여 펨토초 레이저 자극을 대상 미토콘드리아로 전달합니다. 5.5.1-5.5.8 단계를 수행하여 실험을 완료합니다.
참고: 단계 6.8에서, 표적 미토콘드리아로서 TMRM으로 잘 염색된 미토콘드리아를 선택한다. - 실험 후 펨토초 레이저 및 공초점 현미경을 끕니다.
7. 펨토초 레이저 자극에 의한 헬라 세포의 표적 미토콘드리아에 있는 박과 시토크롬 C의 변경
참고: 본 실험에서, 페트리 접시에 세포를 세포 위치격자(그림 3B)를 시드하여 펨토초 레이저로 처리되는 세포를 국소화하였다. 펨토초 레이저에 의해 자극되기로 선택되는 미토콘드리아를 국소화하기 위해 TMRM으로 세포를 염색한다.
- 4.1단계에서 설명한 바와 같이 셀 위치격자(그림 3B)를 가진 페트리 접시에 헬라 세포를 준비한다.
- 단계 6.3 및 6.4에 기재된 바와 같이 TMRM으로 세포를 염색한다.
- 펨토초 레이저를 켜고 셔터가 닫혀 있는지 확인합니다.
- 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 켭니다. 현미경 소프트웨어를 엽니다. 532 nm에서 여기 레이저를 설정합니다. 0.1 mW에서 532 nm 레이저의 전력 레벨을 설정합니다. 이미징 크기를 512 x 512 픽셀로 설정하고 2.2초로 프레임 생성 시간을 2.2초로 설정합니다.
-
Stim-A 모드를 사용하여 타겟 미토콘드리아에 펨토초 레이저 자극 전달
- 펨토초 레이저의 힘을 시편에서 5-30mW(810nm), 10-40mW(1040nm)로 설정합니다. 셔터의 개통 시간을 0.05-0.1s로 설정합니다.
- 인큐베이터에서 염색 된 세포가 들어있는 접시를 가지고 현미경 단계에 접시를 놓습니다.
- 빠른 스캐닝 모드를 사용하여 TMRM으로 얼룩진 대상 셀을 선택합니다.
- 빠른 스캐닝 모드를 사용하여 FOV 중앙에 있는 표적 미토콘드리아 관 구조를 지역화하기 위해 스테이지를 이동합니다. 선택한 셀이 밝은 필드 이미징 아래에 있는 그리드의 좌표를 표시합니다.
- 연속 현미경 이미징 진행을 시작하려면 시작 하단을 클릭합니다.
- 현미경 이미징 진행의 사전 정의 된 시간에 셔터를 열어 단계 7.5.1에서 설계된 펨토초 레이저 자극을 표적 미토콘드리아 관 구조로 전달합니다.
- 이미징 프로세스가 완료될 때까지 기다립니다. 펨토초 레이저로 시뮬레이션되는 선택한 미토콘드리아를 표시합니다. 추가 데이터 분석을 위해 이미징 데이터를 저장합니다.
- 실험 후 펨토초 레이저 및 공초점 현미경을 끕니다. 실험 세포에 Bax 또는 시토크롬 C의 면역형광 현미경 검사법을 준비합니다.
-
Bax 의 면역형광 현미경 검사법 또는 시토크롬 C 에 펨토초 레이저 미토콘드리아를 치료했습니다.
- 현미경 단계에서 접시를 가져 가라.
- Bax 또는 시토크롬 C의 완전한 면역 형광 염색은 4.7.1-4.7.9 단계를 따릅니다.
참고: 4.7.5단계에서 항-EIF4E 대신 안티박스 또는 안티-시토크롬 C를 사용하여 7.6.2단계에서 Bax 또는 시토크롬 C의 면역형 광 염색을 완료한다. - 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 켜고 현미경 소프트웨어를 엽니다. 488 nm 및 532 nm에서 여기 레이저를 설정합니다. 0.1 mW에서 488 nm 및 532 nm 레이저의 전력 레벨을 설정합니다. 이미징 크기를 512 x 512 픽셀로 설정하고 프레임 생성 시간을 2.2초로 설정합니다.
- 현미경 단계에 면역 형광 염색 세포와 접시를 넣어. CCD 카메라의 밝은 필드 이미징 아래에서 선택한 그리드를 찾습니다. 펨토초 레이저로 처리되는 셀을 찾습니다.
- 단일 프레임 공초점 스캐닝을 시작합니다. 펨토초 레이저에 의해 자극되는 미토콘드리아를 찾습니다. 추가 데이터 분석을 위해 광자극 세포의 형광 사진을 저장합니다.
- 실험 후 공초점 현미경을 끕니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
광자극은 연속 공초점 스캐닝 현미경 검사법과 함께 동시에 수행 될 수있다. 광자극은 타임랩스 공초점 현미경 시퀀스에서 미리 정의된 모든 시간 슬롯에서 시작할 수 있습니다. 공초점 현미경 검사법은 형광화상진찰에 의해 세포 분자를 감시할 수 있습니다. 광자극 및 기타 역학에 대한 분자 반응은 이런 식으로 식별될 수 있습니다. 이론적으로 ERK가 활성화되면 세포질에서 세포핵(27)으로인산화이동될 것이다. 특정 세포 운명은 이러한 ERK신호(28)의특정 패턴에 의해 조절될 수 있다. 최근 연구에서, 광 변조는 광원학에 기초한 ERK 신호의 지속 시간과 크기에 대한 높은 정밀한 제어를 제공하고 있으며, 교란된 ERK 신호 전송 역학이 암세포에서 부적절한 증식을 유도한다는 것이 밝혀졌다7, 8. 여기서, 우리는 이 프로토콜에 제시된 방법을 사용하여 펨토초 레이저의 짧은 플래시로 세포를 치료한 후 ERK2 전좌를 핵으로 입증한다. 그림 5A에도시된 바와 같이, ERK2-GFP 형광은 펨토초 레이저 시뮬레이션의 몇 분 후에 최대에 도달한다. ERK2 분자는 핵에서 하류 기판을 활성화한 후에 탈인성화되고, ERK2는 핵 GFP 형광의 감소에 의해 지시된 세포질로 돌아온다. ERK2는 여러 장의 광자극에 의해 여러번 활성화될 수 있다(도 5B). 따라서, 다중 자극 사이의 간격 시간을 제어함으로써 ERK2 신호 패턴을 정밀하게 조작할 수 있다. 또한, ERK2는 자극된 세포 주위의 인접세포에서 때때로 활성화될 수 있다(도 5C). 이러한 관찰은 일부 확산성 분자가 펨토초 레이저로 처리된 세포에 의해 방출되어 인접한 세포에서 ERK2를 활성화시킬 수 있음을 나타낸다. ERK2 하류 단백질 eIF4E의 인산화는 면역형광 현미경 검사법에 의해 확인 및가시화될 수 있다(도 5D). 이 결과는 펨토초 레이저 자극이 ERK 신호 경로를 성공적으로 활성화할 수 있음을 나타냅니다. 더 자세한 결과는 왕 S.,외. 22.
미토콘드리아 산화 섬광 (mitoflashes)은 복잡한 미토콘드리아 분자 역학에서 뿌리를 내리는 미토콘드리아에서 산화 파열입니다. 지난 10년 동안, 미투속눈썹은 원소 미토콘드리아 시그널링 이벤트로 실현되었으며 다발성 세포 기능29,30,31에서중요한 역할을 한다. 전통적으로, mitoflashes는 일반적으로 미토콘드리아29,30에간접적인 스트레스를 제공하기 위해 화학 물질로 세포를 치료 할 때 우연히 관찰됩니다. 이 광자극 체계를 구현함으로써, 우리는 단일 미토콘드리아 관 수준에서 mitoflashes를 자극하는 제어 가능하고 정확한 방법을 달성합니다. 성공적인 미토플래시 여기는 그림 6A에나와 있습니다. 흥미롭게도, 맥박 피크, 폭 및 응답 지속시간(32)과 같은 미토페라의 특성은 펨토초 레이저 파워와 밀접한 관련이 있다. 펨토초 레이저 자극에 의해 흥분된 미토프슬래시의 보다 상세한 정량 분석은 왕S., 외32. 미토콘드리아에 대한 이러한 광자극은 미토콘드리아 형태(도 6B)의 단편화 및 복원,미토콘드리아 막 전위 성교를 포함한 미토콘드리아 분자 역학의 품종을 보여줍니다. 그림6C). 사진 활성화 된 mitoflashes와 마찬가지로, 이러한 미토콘드리아 이벤트는 광 자극의 다른 힘 강도와 다른 성능을 가지고. ERK 신호 경로의 활성화와는 다릅니다. 펨토초 레이저의 영향은 단일 미토콘드리아 튜브에 매우 제한됩니다. 더 자세한 결과는 왕 Y., 외. 24 및 Shi F., 외. 25.
그림 1: 펨토초 레이저 커플링에 확립된 광자극 방식은 공초점 현미경으로 결합한다. (A) (B)광자극 및 공초점 이미징 시스템의 광학 경로. 펨토초 레이저는 처음에는 50/50 빔 스플리터로 두 개의 빔으로 분할됩니다. 전송은 릴레이 망원경에 의해 확장된 다음 Stim-A를 형성하기 위해 목표에 반영됩니다. 반사 빔은 현미경 스캐닝 시스템을 통해 정렬되어 Stim-B를 형성합니다. CCD 카메라는 Stim-A 모드에서 펨토초 레이저의 세포와 초점을 모니터링하기 위해 밝은 펠리드 이미징을 제공하는 데 사용됩니다. Stim-A = FOV의 중심에 고정 된 초점; Stim-B = 미리 설계된 영역에서 특수 스캐닝 프레임. DM = 이색 거울, BS = 빔 스플리터, RM = 반사 거울. 공초점 스캐닝 레이저의 파장은 488 nm/532 nm/635 nm이며, 형광의 일반적인 수집 파장 간격은 <560 nm/560-625 nm/> 625 nm입니다. 섬유 펨토초 레이저(1,040nm, 120fs, 50MHz, 1W)는 Ti = 사파이어 레이저(810nm, 80MHz, 65fs, 1W) 또는 기타 상업용 펨토초 레이저 발진기로 대체할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Stim-A 모드에서 는 펨토초 레이저의 국소화 및 크기가 밝은 펠리드 이미징 하에서 공초점 이미징 평면에서 표적 셀에 초점을 맞춥니다. (A) 펨토초 레이저가 셔터에 의해 차단됩니다. (B) 펨토초 레이저가 켜진 경우. 화살표: 참조 화살표는 펨토초 레이저 포커스가 올바른 위치를 찾는지 확인하기 위해 FOV의 중심에 설정됩니다. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 세포 배양, 형질감염 및 광자극 실험에 사용되는 페트리 접시. (A) 직경 15mm, 두께 0.17mm의 유리 바닥의 35mm 페트리 접시. (B) 유리 바닥과 각인 된 500 μm 셀 위치 그리드가있는 35mm 페트리 접시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4:CO2 배양 시스템. (A) CO2 인큐베이터 스테이지 및 (B) 제어판을. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Stim-A 모드를 사용하여 ERK 광 활성화. (A) 단일 사진 자극(1,040 nm, 40 mW, 0.1s)은 ERK2-GFP 전좌를 핵으로 유도한 다음 다시 세포질로 되갑니다. (B) ERK2 신호 패턴은 단일 펨토초 레이저 노출(적색 화살표, 1,040 nm, 40 mW, 0.1초)과 2개의 광자극(녹색 화살표, 810nm, 30 mW, 0.1초)에 의해 매개된다. (C) 표적 세포에서 단 하나 짧은 펨토초 레이저 노출에 의해 주변 세포에서 ERK 활성화 (흰색 화살표, 810 nm, 24 mW, 0.2 초). (D) eIF4E-P의 면역형광은 단일 포토시뮬레이션(810 nm, 25 mW, 0.2초) 후 24시간 유의한 증가를 나타낸다. 배율 막대 = 10 μm (A) 및 20 μm (B, C). ERK2-GFP 및 eIF4E-P의 형광은 488 nm 여기 레이저에 의해 흥분되고 <560 nm 채널에서 수집된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 스팀-A 모드에서 광자극에 의해 유도된 다중 미토콘드리아 이벤트. (A) 단일 자극에 의해 자극된 미토콘드리아 관상에 미토플래시의 흥분(810 nm, 16 mW, 0.1초). (B) 단일 광자극에 의해 유도된 미토콘드리아 형태학적 단편화 및 복원(1,040 nm, 30 mW, 0.1초). (c) 단일 펨토초 레이저 자극에 의한 미토콘드리아 막 전위(1040 nm, 20 mW, 0.1초)의 진동. (A) (B) 및 (C)의 화살표는 광자극의 위치를 나타낸다. 배율 막대 = 10 μm. 미토-GFP 또는 mt-cpYFP의 형광은 488 nm 여기 레이저에 의해 흥분되고 <560 nm 채널에서 수집된다. TMRM의 형광은 532 nm 여기 레이저에 의해 흥분되고 560-625 nm 채널에서 수집된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 0.05s | 0.1s | 0.2s | 0.5s | |
| 810 nm, 65 fs, 80 MHz | 20 - 65 mW | 10 - 60 mW | 5 - 50 mW | 5 - 40 mW |
| 1040 nm, 120 fs, 50 MHz | 30 - 100 mW | 20 - 80 mW | 15 - 70 mW | 10 - 60 mW |
표 1: 권장 자극 지속 시간 및 Stim-A 모드에서 펨토초 레이저의 평균 전력.
| 0.05s | 0.1s | 0.2s | 0.5s | |
| 810 nm, 65 fs, 80 MHz | 25 - 40 mW | 20 - 30 mW | 15 - 25 mW | 10 - 25 mW |
| 1040 nm, 120 fs, 50 MHz | 40 - 60 mW | 30 - 50 mW | 25 - 40 mW | 20 - 30 mW |
표 2: 2 x 2-3 x 3 μm에서 Stim-A 모드에서 펨토초 레이저의 권장 자극 지속 시간 및 평균 전력 2개 셀에 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
펨토초 레이저와 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템을 결합하여 광자극 전략을 시연합니다. 광자극은 그에 따라 Stim-B를 정의하여 2 광자 현미경으로 직접 작동 할 수 있습니다. 우리는 타겟 세포에서 ERK 신호 또는 mitoflashes를 트리거펨토초 레이저의 짧은 플래시를 활용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 상이한 자극 모드는 상이한 실험 목적 및 시스템에 따라 수행될 수 있다. Stim-A는 공초점 현미경을 기반으로 쉽게 설정할 수 있습니다. 펨토초 레이저는 FOV 센터의 회절 한계 레벨에 초점을 맞출 수 있습니다. 세포외 표적은 펨토초 레이저 포커스 위치로 수동으로 이동해야 하며 공초점 현미경검사법과는 완전히 독립적인 임의의 기간 동안 자극될 수 있습니다. 따라서 Stim-A는 초점 영역을 벗어난 샘플을 완벽하게 보호할 수 있으며 장시간 광자극에 적합합니다. 자극-B의 자극 영역은 FOV내의 임의의 영역으로서 미리 정의될 수 있다. 자동으로 수행할 수 있습니다. 그러나 자극 지속 시간 및 노출 시간은 공초점 스캐닝과 함께 만 따를 수 있습니다. 각 픽셀의 체류 시간과 총 프레임 크기를 설정한 후, 단일 현미경 프레임에서의 자극 지속 시간이 실제로 고정됩니다. 사진 자극은 또한 프레임별로 주기적으로 수행될 수 있다. 또한 노출 기간이 적지만 넓은 영역을 필요로 하는 광감광제 및 광유전학 단백질을 활성화하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 중요한 고려 사항은 펨토초 레이저 자극의 파라미터를 결정하는 방법입니다. 우리의 이전 연구에 따르면, 세포 분자 활동은 주로 다광자 엑셀에 의해 유도된다17,21,22,23,24,25. 일반적으로 다광자 발산 효율은 파장, 펄스 폭, 반복 속도를 포함한 모든 펨토초 레이저 파라미터와 관련이 있습니다. 세포 반응은 레이저 파워, 자극 위치/ 영역 및 노출 지속 시간과 동시에 더 관련이 있습니다. 원칙적으로, 자극 효율은 세포 안전과 충돌한다. 더 높은 평균 전력, 더 긴 자극 지속 시간 및 더 큰 총 사건 레이저 에너지와 같은 강한 광자극은 더 높은 자극 효율성에 기여하지만 세포 손상의 더 높은 위험을 가져옵니다. 이러한 파라미터는 서로 상대적이며 모두 자극 및 손상 효과에 기여하기 때문에 총 입사 레이저 에너지 또는 레이저 평균 전력과 같은 하나의 파라미터만 사용하여 안전여부로 정의하는 것은 불가능합니다. 신호 활성화 효율 과 셀 안전성 모두를 고려하여, 여기서, 우리는 표 1 및 표2에서 참조를 위한 2개의 펨토초 레이저 소스의 권장평균 전력 및 자극 기간을 제공한다. 게다가, 펨토초 레이저 자극의 파라미터는 실제 광학 시스템 및 생물학적 샘플에 따라 변경되어야 한다.
위의 논의에 따르면, 우리는 광 자극 매개 변수의 더 자세한 효과적인 범위를 제시 할 계획이다. 펨토초 레이저의 파장을 광자극에 사용되는 NIR 범위에서 변경할 수 있습니다. 펄스 폭은 높은 피크 파워와 높은 비선형 엑액션 효율을 제공하기 위해 짧아야 합니다. 이 프로토콜에는 긴 펄스 지속 시간이 권장되지 않습니다. 일반적으로 2 광자 현미경 검사법 (&200 fs)에 대한 일반적인 펄스 폭이 적절한 선택입니다. 레이저의 반복 속도는 핵심 요소가 아닙니다. 최대 MHz의 반복 속도는 이 프로토콜에 적합합니다. 세포 분자 반응에 가장 중요한 요소는 펨토초 레이저의 레이저 전력 및 자극 지속 시간입니다. ERK를 활성화하기 위해, 우리의 전작 에 따르면22,15 mW (810 nm) 또는 20 mW (1,040 nm)에서 평균 전력 및 0.2 s에서 노출 기간은 매우 높은 세포 생존력을 유지하면서 ERK 신호를 활성화하기에 충분한 자극을 제공하기에 충분하다 헬라 세포. 반대로, 80mW(810 nm) 또는 120mW(1,040 nm) 이상의 평균 전력과 1s보다 긴 노출 지속 시간은 세포에 돌이킬 수 없는 손상을 유발할 수 있습니다. 미토콘드리아는 일반적으로 사진에 더 민감합니다. 평균 전력이 40 mW (810 nm) 또는 80 mW (1,040 nm) 이상및 0.2 s 이상의 노출 기간을 가진 자극은 자극된 미토콘드리아에서 또는 전체 세포에 걸쳐 있는 모든 미토콘드리아에서 돌이킬 수 없는 단편화 같이 상당한 손상을 유도할 수 있습니다. 광자극에 대한 미토콘드리아의 감광성은 다른 세포 유형에서 많이 다르다는 점에 유의해야합니다. 예를 들어 HeLa 셀에서 레이저 전력은 약 6 mW (810 nm, 0.1 s 지속 시간)만 필요합니다. 모든 미토콘드리아는 단편화, 미토플라슬래시 및 MMP 진동의 형태로 광반응에 반응할 수 있다. 그러나 인간 중간 엽 줄기 세포에서, 힘은 약 15 mW (810 nm, 0.1 s 기간)로 증가될 필요가 있고, 아직도 약 반 자극된 미토콘드리아는 광자극에 아무 반응도 보여주지 않습니다. Stim-B 모드에서, 또 다른 요인은 광 활성화 효율및 세포 손상에 영향을 미칠 수 있으며 자극 영역이다. 광자극은 작은 자극 부위에 전달하여 세포 손상을 일으킬 수 있습니다. 그러나 동일한 자극은 더 큰 자극 영역에 전달함으로써 ERK를 활성화하지 못할 수 있습니다. 대상 세포의 자극 영역은 약 2 x 2-3 x 3 μm 2이고 25 μm2를초과하지 않는 것이 좋습니다.
자극 영역의 국소화는 또한 이 프로토콜을 적용하는 데 중요하다. 이전 작품17,22에따르면, 그 지역의 사진 자극은 효과적으로 ER에 Ca2 + 매장을 고갈하고 CRAC 채널을 활성화 할 수 있습니다. 그런 다음,Ca2+ 유입은 ERK 신호 경로를 이후에 활성화시킬 수 있다. 따라서 높은 ERK 활성화 효율을 달성하기 위해 헬라 세포의 ER 부위에 광 자극을 전달하는 것이 좋습니다. ER 영역은 위상 대비 목표에 의해 밝은 필드 현미경 검사법 의 밑에 세포질 또는 핵에서 쉽게 구별될 수 있습니다. 미토콘드리아 시그널링 이벤트를 도입하기 위해 펨토초 레이저의 초점은 관련 절차에 따라 선택된 미토콘드리아 구조에 쉽게 장착할 수 있습니다.
이 프로토콜에 기재된 광자극 방법은 또한Ca2+ 및 ROS 신호유도(17,20,21)와같은 다른 다중 세포 이벤트에 영향을 미치는 데 사용될 수 있다. 그것은 모든 이전 작품은 사진 자극 후 세포 안전성의 평가를 제공했다 주목해야한다. 예를 들어, 세포의 중요한 형태학적 변화, 버블링, 미토콘드리아 단편화 및 전체 세포의 부종, 세포의 증식 속도 감소, 공초점 현미경 검사법 중 형광의 다른 특이한 변화는 모두 높은 것을 암시합니다. 세포 손상. 셀 상태를 모니터링하는 것은 매우 신중해야 합니다. 그럼에도 불구하고, 레이저 전력 및 자극 파라미터를 잘 제어하면, 세포 생존력은 높은 자극 효율과 동시에 매우 높은 수준으로 유지될 수 있었다. 따라서 펨토초 레이저의 광자극 방법은 더 많은 영역으로 확장하고 관련 응용 분야에 적용 할 수있는 좋은 잠재력입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81571719 및 81661168014, 81673014, 81870055), 상하이 시 과학 기술 위원회(18QA1402300 및 16XD1403100 및 16XD1403100) 및 국가 핵심 R&D 계획(21010Fa)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Femtosecond laser | Fianium | ||
| CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
| Petri dish | NEST | 801002 | |
| Petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
| ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
| mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
| mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
| Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
| Paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
| anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
| anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
| Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |
References
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
- Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
- Deisseroth, K.
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
- Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson's disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Hoover, E. E., Squier, J. A.
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
- Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
- Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
- He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
- Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
- Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
- He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
- Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
- Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
- Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
- Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
- Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
- Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
- Wang, W., et al.
- Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , Springer. Cham. 403-422 (2016).
- Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
- Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).
