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Biology

Photostimulation durch Femtosecond Laser aktiviert extrazellulär-signalregulierte Kinase (ERK) Signalisierung oder Mitochondrienereignisse in Zielzellen

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59661
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 3
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai Sixth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 2Ultrafast Laser Laboratory, College of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering, Tianjin University, 3School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University

Summary

Der eng fokussierte Femtosekundenlaser kann eine präzise Stimulation der Zellen ermöglichen, indem er in eine konfokale Mikroskopie gekoppelt wird, die die Echtzeitbeobachtung und Photostimulation ermöglicht. Die Photostimulation kann zellmolekulare Ereignisse wie ERK-Signalweg und mitochondriale Blitze reaktiver Sauerstoffspezies aktivieren.

Abstract

Die direkte Kontrolle zellulär definierter molekularer Ereignisse ist für die Biowissenschaft wichtig. Kürzlich haben Studien gezeigt, dass die Femtosekunden-Laserstimulation gleichzeitig mehrere zelluläre molekulare Signalwege aktivieren kann. In diesem Protokoll zeigen wir, dass durch die Kopplung des Femtosekundenlasers in ein konfokales Mikroskop Zellen durch den eng fokussierten Laser präzise stimuliert werden können. Einige molekulare Prozesse, die gleichzeitig beobachtet werden können, werden anschließend aktiviert. Wir präsentieren detaillierte Protokolle der Photostimulation zur Aktivierung des extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK) Signalwegs in Hela-Zellen. Mitochondriale Blitze von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und anderen mitochondrialen Ereignissen können auch stimuliert werden, wenn der Femtosekunden-Laserpuls auf eine bestimmte mitochondriale Röhrenstruktur fokussiert wird. Dieses Protokoll umfasst die Vorbehandlung von Zellen vor der Photostimulation, die Bereitstellung der Photostimulation durch einen Femtosekunden-Laserblitz auf das Ziel und das Beobachten/Identifizieren molekularer Veränderungen danach. Dieses Protokoll stellt ein rein optisches Werkzeug für verwandte biologische Forschungen dar.

Introduction

Die Technologie zur Steuerung zellulärer Signalmoleküle ist ein wichtiger Teil der Entwicklung der Biowissenschaften. Traditionell ist die am häufigsten verwendete Methode die biochemische Behandlung durch Medikamente oder biologische Materialien1,2,3. In den letzten zehn Jahren eröffnet die Erfindung der Optogenetik eine neue Ära der zellulären molekularen Signalmodulation. Die Transfektion mit lichtempfindlichen Proteinen durch Gentechnik macht Licht zu einem leistungsfähigen Werkzeug, um verschiedene Proteinaktivitäten in der Zielzelle zu modulieren. Diese Technologie hat ermutigende Fortschritte wie Anregung und Hemmung des neuronalen Signals, Förderung der Genexpression, Manipulation zellulärer Signalmuster, Führung verschiedener Zellschicksale und pathologische Untersuchung4,5 ,6,7,8,9. Licht kann jedoch nur funktionieren, indem es Zellen mit optogenetischen Proteinen transfiziert. Im aktuellen Stadium gibt es seltene Methoden, die es Dem Licht ermöglichen, zelluläre Moleküle direkt neben der Optogenetik zu steuern.

Femtosecond Laser hat fortschrittliche biologische Forschungen durch effiziente Multiphotonen Erregung unter Beibehaltung einer guten biologischen Sicherheit. Durch den Einsatz vielfältiger Fotoverarbeitungsstrategien hat es zahlreiche Erfolge wie Multiphotonenmikroskopie, Mikrochirurgie und multiphotonoptogenetische Anwendungen10,11,12,13 realisiert. ,14,15,16. Jüngste Untersuchungen zeigen, dass die Femtosekunden-Laserstimulation als hocheffiziente optische Methode zur direkten Induzieren molekularer Signalereignisse nachgewiesen wurde. Es wurde festgestellt, dass eine eng fokussierte Femtosekunden-Laserbestrahlung auf endoplasmatischem Retikulum (ER) in der Lage ist, Kalzium in ER zu abbauen und Calcium-Freisetzungs-aktivierte Calciumkanäle (CRAC) zu aktivieren, um Kalziumsignale in Zellen17zu bilden. Dieses fotoaktivierte Kalziumsignal kann sichzwischen mehreren Zelltypen 18,19,20ausbreiten. Darüber hinaus hat es auch die Fähigkeit, Zellsignalwege wie Kernfaktor aktivierter T-Zellen (NFAT) und ERK-Signalweg21,22zu aktivieren. Durch die Anpassung der Intensität und Lokalisierung der Femtosekunden-Laserbelichtung in Zellen, z. B. durch Fokussierung des Lasers auf Mitochondrien, kann es die mitochondriale Morphologie und molekulare Ereignissebeeinflussen 23,24, 25. Insbesondere können Ausbrüche der mitochondrialen ROS-Generation durch Photostimulation angeregt werden, die als fluoreszierende Blitze in Mitochondrien (Mitoflashes) bezeichnet wird.

Daher ist die Photostimulationstechnologie von großem Potenzial, in der verwandten biologischen Forschung weit verbreitet zu sein. Es ist auch eine gute Chance, Femtosekunden-Laseranwendungen bei der Steuerung von zellulären Signalmolekülen und Funktionen neben der Mikroskopie zu erweitern. Hier stellen wir Ihnen die technischen Details der Photostimulation zur Verfügung. Die Photostimulation wird durch die Kopplung eines Femtosekundenlasers an ein konfokales Mikroskop erreicht, um eine einzelne Zielzelle mit einer kurzen Blitzphotostimulation zu versorgen. Es kann eine effiziente und steuerbare ERK-Aktivierung in der Zelle initiieren. Befindet sich die Photostimulation auf der mitochondrialen röhrenförmigen Struktur, können das mitochondriale Membranpotential, die Morphologie, die ROS und die Permeabilitätsübergangsporen durch die Photostimulation gesteuert werden. Basierend auf diesem Photostimulationsschema bieten wir eine detaillierte Methode zur Aktivierung des ERK-Signalwegs und zur Beeinflussung mehrerer mitochondrialer Ereignisse in Hela-Zellen. Dieses Protokoll erläutert den Prozess der Femtosekunden-Laserstimulation in Zielzellen.

Das Photostimulationssystem wird auf einem konfokalen Mikroskop mit femtosekundenLaserkopplung für die gleichzeitige Stimulation und kontinuierliche Mikroskopie eingerichtet. Der Femtosekundenlaser (Wellenlänge: 1.040 nm, Wiederholungsrate: 50 MHz, Pulsbreite: 120 fs, maximale Ausgangsdurchschnittsleistung: 1 W) wird vor der Kopplung in zwei Strahlen aufgeteilt. Man wird durch ein Relaisteleskop geführt, das aus einem Linsenpaar besteht. Es wird dann direkt in die Hinterapertur eines Objektivs (60x, N.A. = 1.2, Wassereintauchen) reflektiert, um einen Beugungs-Grenzfokus (Stim-A) zu bilden. Die andere wird auf den optischen Scanpfad des konfokalen Mikroskops reflektiert, um als Zwei-Photonen-Scanmodus (Stim-B) zu arbeiten. Stim-A präsentiert einen festen Fokuspunkt im Blickfeld (FOV). Stim-B ist ein vorgefertigter partieller konfokaler Scanbereich im FOV. Stim-A und Stim-B sind in Abbildung 1Adargestellt. Eine CCD-Kamera unter dem dichroitischen Spiegel (DM) bietet Eine Lichtfeld-Bildgebung zur Überwachung des Fokus des Femtosekundenlasers.

Für die folgenden Experimente gibt es einige wesentliche Punkte. In diesem Protokoll wird als Beispiel eine Femtosekunden-Faserlaserquelle (1040 nm, 50 MHz, 120 fs) verwendet. In der Praxis können die meisten kommerziellen Femtosekunden-Oszillatoren verwendet werden, solange die Pulsbreite kürzer als 200 fs ist und die Spitzenleistungsdichte über dem Niveau von 1011 x 1012 W/cm2liegen sollte. Zum Beispiel ist ein Ti: Saphirlaser, der normalerweise für die Multiphotonenmikroskopie verwendet wird, in der Lage, den femtosekundenlaser zu ersetzen, der in Abbildung 1Bgezeigt wird. Die Laserleistung und einige andere Photostimulationsparameter müssen abgestimmt werden, da die optischen Parameter (Pulsbreite, Wellenlänge und Wiederholungsrate) bei verschiedenen Femtosekundenlasern stark variieren, die somit unterschiedliche Multiphotonen-Erregungseffizienzen induzieren.

Neben der Femtosekunden-Laserstimulation bietet die konfokale Mikroskopie eine kontinuierliche Zellbildgebung zur Überwachung der molekularen Dynamik in Echtzeit im Stim-A- und Stim-B-Modus. Beide Photostimulationsschemata (Stim-A und Stim-B) werden durch einen mechanischen Verschluss mit Millisekundenauflösung gesteuert (Abbildung 1).

Im Stim-A-Modus wird die Position des Laserfokus in der Mitte von FOV fixiert. Ein Relaisteleskop wird verwendet, um sicherzustellen, dass der Fokus des Femtosekundenlasers auf einer konfokalen Bildebene lokalisiert wird, indem der Abstand zwischen zwei Linsen in vertikaler Richtung (die Laserausbreitungsrichtung, vertikal zur konfokalen Bildebene, wie in Abbildung 1). Durch die Lichtfeld-Bildgebung der CCD-Kamera kann der Durchmesser des Laserfokus gemessen werden (abbildung 2B). Die Stimulationsdauer und Belichtungszeiten werden während des konfokalen Bildgebungsprozesses durch einen Verschluss gesteuert.

Im Stim-B-Modus kann der Stimulationsbereich in der konfokalen Imaging-Steuerungssoftware manuell jeder Form wie Linie, Polygon oder Kreis vorzugewiesen werden. Der Verschluss wird mit dem konfokalen Scanvorgang synchronisiert. Es öffnet sich zur vorgefertigten Zeit, die durch die konfokale Imaging-Controlling-Software eingestellt wird. Anschließend wird der Stimulationsbereich mit femtosekundenlaser als konfokale Mikroskopie gescannt. So wird die Probe nur durch Femtosekundenlaser stimuliert, wenn der konfokale Scanvorgang in einen bestimmten Bildrahmen eintritt.

Das Photostimulationssystem kann je nach Versuchsteilnehmer sowohl auf invertierten als auch aufrechten metallurgischen Mikroskopen aufgebaut werden. In-vitro-Zellen, die in Petrischalen kultiviert werden, sind besser, mit invertierten Mikroskopen zu arbeiten. Tiere, insbesondere Gehirne lebender Tiere, eignen sich besser mit aufrechten Mikroskopen. In dieser Studie nehmen wir das invertierte Mikroskop als Beispiel. Es sollte beachtet werden, dass die Abdeckung der Petrischale während der gesamten Experimente nicht geöffnet wird.

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Protocol

ACHTUNG: Das nachfolgend vorgestellte Protokoll beinhaltet die Verwendung von NIR-Femtosekundenlasern und toxischen Chemikalien. Bitte achten Sie auf alle möglichen Schäden, die durch Experimentierverfahren verursacht werden. Bitte lesen Sie vor der Verwendung Sicherheitsdatenblätter aller relevanten Chemikalien oder sonstigen Materialien. Bitte befolgen Sie die Sicherheitshinweise der Laseranlagen oder wenden Sie sich an Fachleute, um sich vor dem Betrieb der Laserquelle beraten zu lassen.

1. Experimentelle Vorbereitung

  1. Einrichten des Photostimulationssystems
    HINWEIS: Das System besteht aus einem Femtosekundenlaser und einem Laser (im sichtbaren Bereich für Fluoreszenzanregung) Raster-Konfokalmikroskop. In Abbildung 1wird ein Faserfemtosekundenlaser (1.040 nm, 50 MHz, 120 fs, 1 W) für die Kopplung verwendet. Die Parameter sind nicht fixiert oder notwendig. Es kann durch einen Ti: Saphirlaser oder andere kommerzielle Femtosekunden-Oszillatoren im NIR-Bereich ersetzt werden.
    1. Tune auf den Femtosekundenlaser und das konfokale Mikroskop.
      HINWEIS: Bitte stellen Sie die Femtosekunden-Laserleistung bei der Einstellung des optischen Pfades auf einem niedrigen Niveau (ca. 50 mW) ein.
    2. Verwenden Sie reflektierende Spiegel (RM1 und RM2 in Abbildung 1B) um Femtosekunden-Laserstrahl durch einen mechanischen Verschluss zu lenken. Öffnen Sie den Verschluss.
    3. Stellen Sie einen 50/50 Strahlsplitter (BS, Abbildung 1B) ein, um den Femtosekundenlaserstrahl in zwei separate Strahlen (Übertragungsstrahl und Reflexionsstrahl) aufzuteilen. Lenken Sie RM2 und BS, um den Femtosekunden-Laserstrahl mit dem Scanning-Laserstrahl zusammenzutreffen.
      HINWEIS: (1) Zur Positionierung des Laserpfades wird eine Referenz-Iris (Iris 1, Abbildung 1B) hinter dem langdurchlassenen dichroitischen Spiegel (DM, 700 nm eingeschnittene Wellenlänge, Abbildung 1B) verwendet. (2) Das System kann nur im Stim-A- bzw. Stim-B-Modus funktionieren. Für den Stim-A-Modus kann der BS entfernt werden. Für Stim-B kann der BS durch einen RM ersetzt werden.
    4. Stellen Sie ein Relaisteleskop ein, das aus einem Linsenpaar besteht, um die Transmissionsstrahlbreite zu erweitern, die mit der Hinteröffnung des Objektivs besteht.
      HINWEIS: (1) Die Referenz-Iris 2 und 3 (Abbildung 1B) werden so eingestellt, dass sie den Femtosekunden-Laserstrahl kollidieren (Abbildung 1B). (2) Die Vergrößerung des Relaisteleskops hängt vom ursprünglichen Durchmesser des Femtosekundenlaserstrahls und dem Durchmesser der Hinteröffnung des Objektivs ab.
    5. Lenken Sie RMs (RM 3-5, Abbildung 1B), um den erweiterten Strahl in das Mikroskop auszurichten. Lenken Sie RM 4 und RM 5, um den Fokus des Femtosekundenlasers auf die Mitte von FOV zu stimmen.
    6. Messen Sie die Transmissionseffizienz des Ziels des Femtosekundenlasers.
      HINWEIS: Bitte messen Sie die Laserleistung bei Stim-A bzw. Stim-B aufgrund der unterschiedlichen Eindringpfade des Lasers in diesen beiden Modi. Es wird die Kraft an der Probe nutzen, um die entsprechenden Experimentverfahren unten zu veranschaulichen.
    7. Schalten Sie den Verschluss, den Femtosekundenlaser und das konfokale Mikroskop ab, bis die Experimente beginnen.
      HINWEIS: In den folgenden Experimenten arbeiten Stim-A und Stim-B nicht zusammen. Bei Verwendung von Stim-A muss der Femtosekunden-Laserstrahl von Stim-B blockiert werden. Andererseits sollte der Strahl von Stim-A blockiert werden, wenn das System im Stim-B-Modus funktioniert.
  2. Bereiten Sie das Kulturmedium vor: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) hohe Glukose mit 10% fetalem Rinderserum (FBS).
  3. Bereiten Sie das ERK2-GFP-DNA-Plasmid, Das Mito-GFP-DNA-Plasmid und das mitochondriale Matrix-Targeting kreisförmig permutiertes gelbes Fluoreszenzprotein (mt-cpYFP) vor. Halten Sie die Plasmide bis zur Anwendung bei -20 °C.
  4. Bereiten Sie Tetramethylrhodin (TMRM, 100 M) und Polyethylenimin (PEI 1 mg/ml) vor. Halten Sie sie bei -20 °C bis zur Anwendung.
  5. Bereiten Sie 5% Paraformaldehyd, 0,5% Triton X-100, Anti-EIF4E (eukaryotic translation initiation factor 4E), Antikörper (Phosphor S209, 1 mg/ml), Anti-Bax-Antikörper (1 mg/ml), Anti-Cytochrom-C-Antikörper (1 mg/ml), Sekundärantikörper (Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488, 1 mg/ml) und 1% BSA mit 0,1% Tween20. Bewahren Sie diese Reagenzien bei 4 °C auf, bis sie verwendet werden.
  6. Bereiten Sie sterile Materialien vor: Zellkulturflaschen, Petrischalen mit Glasschiebeboden (Abbildung 3A), Geschirr mit Einem Glasboden, ein bedrucktes 300 m Zellpositionsraster (Abbildung3B, um die photostimulierten Zellen zu lokalisieren), 1,5 ml und 10 ml Rohre und 1 mL-, 100-L- und 10-L-Pipetten und -Spitzen.
  7. Bereiten Sie Standard-Zellkultur-Laborgeräte vor: einen Zellkultur-Inkubator mit 5%CO2 und 37 °C und einen biologischen Sicherheitsschrank.

2. Zellkultur und Transfektion

HINWEIS: Hela-Zelle (Zelllinie abgeleitet von Gebärmutterhalskrebs-Zellen am 8. Februar 1951 von Henrietta Lacks genommen)26 wird als Beispiel in diesem Protokoll verwendet.

  1. Zellpassage
    1. Entfernen Sie das Kulturmedium aus der Zellkulturflasche, die genügend Zellen enthält.
    2. Waschen Sie die Flasche mit 2 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Entfernen Sie die PBS.
    3. Fügen Sie 1 ml Trypsin langsam hinzu und tippen Sie leicht auf die Flasche. Die Flasche wieder in den Inkubator geben und die Zellen 3 min bei 37 °C bebrüten.
    4. Entfernen Sie das Trypsin. Fügen Sie 2-3 ml Kulturmedium hinzu. Pipette das Medium mehrmals, um die Zellen zu helfen, sich zu lösen. Übertragen Sie das Medium mit Zellen in ein 10 ml-Rohr.
    5. Nehmen Sie 10 l der Probe aus dem Rohr für die Zellzählung.
    6. Samen Sie 25.000 Zellen in eine Petrischale (Abbildung 3A) und fügen Sie Kulturmedium bis zu 1 ml hinzu.
    7. Legen Sie die enthaltenen Zellen wieder in den Inkubator. Inkubieren Sie die Zellen 24 h bei 37 °C vor der Transfektion.
  2. Zelltransfektion
    1. Verwenden Sie 0,5 g DNA-Plasmid (ERK2-GFP, Mito-GFP oder mt-cpYFP) für die Transfektion pro Schale. Fügen Sie 0,5 g Plasmid und 2,5 g PEI in 50 l DMEM in einem 1,5 ml-Rohr hinzu. Inkubieren Sie Mischtechnik 10 min bei Raumtemperatur.
    2. Nehmen Sie die Schale mit den Zellen aus dem Brutkasten. Ersetzen Sie Kulturmedium durch 1 ml DMEM.
    3. Fügen Sie DNA/PEI Mischtechnik in die Zellen Tropfen für Tropfen. Legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator.
    4. Inkubieren Sie die Zellen 3 h bei 37 °C und ersetzen Sie DMEM DNA/PEI Mischmedium durch 1 ml Kulturmedium.
    5. Inkubieren Sie transfizierte Zellen 24 h bei 37 °C vor Photostimulationsexperimenten.

3. Aktivierung von ERK2 durch Photostimulation des Femtosekundenlasers

  1. Schalten Sie den Femtosekundenlaser ein und stellen Sie sicher, dass der Verschluss geschlossen ist.
  2. Schalten Sie das konfokale Laserscanning-Mikroskop ein und öffnen Sie die Mikroskopsoftware. Stellen Sie den Anregungslaser auf 488 nm ein. Stellen Sie den Leistungspegel von 488 nm Laser auf 0,1 mW ein. Legen Sie die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel fest. Legen Sie die Intervallzeit jedes Pixels auf 2,4 s fest. Stellen Sie die Intervallzeit zwischen zwei Frames auf 6 s ein, um Photobleichungen und Photoschäden an Zellen zu minimieren. Stellen Sie die gesamten Bildgebungsrahmen auf rund 300 Frames ein, um in einem einzelnen Experiment eine kontinuierliche Mikroskopie von 30 min zu ermöglichen.
    HINWEIS: Das Intervall von zwei benachbarten Frames, Gesamtbildrahmen und Bildzeit der kontinuierlichen Mikroskopie kann an experimentelle Anforderungen angepasst werden. Wenn ein einzelnes Experiment über 2 h dauert, stellen Sie bitte das CO2-Inkubationssystem (siehe Abbildung 4) für das Mikroskop wie in Schritt 3.3 dargestellt ein, um die Umgebung von 5% CO2 und 37 °C zur Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit bereitzustellen. Wenn ein einzelnes Experiment innerhalb von 2 h begrenzt ist, ist das CO2-Inkubationssystem nicht erforderlich.
  3. Schalten Sie das CO2-Inkubationssystem ein, schalten Sie alle Heizungen ein und stellen Sie die Arbeitstemperatur auf 37 °C ein. Warten Sie, bis die Temperatur auf 37 °C und die Konzentration von CO2 bis zu 5% steigt. Stellen Sie die Inkubatorstufe auf die Mikroskopstufe, wie in Abbildung 4Adargestellt.
  4. Bereiten Sie Hela-Zellen vor, die mit ERK2-GFP transfiziert wurden, wie in Schritt 2 beschrieben.
    HINWEIS: In einem individuellen Experiment wird das Schema Stim-A oder Stim-B angewendet, um Zellen Photostimulation zu liefern. Schritt 3.5 und 3.6 zeigen detaillierte Schritte unter Stim-A bzw. Stim-B.
  5. Femtosekunden-Laserstimulation in Zielzellen im Stim-A-Modus
    HINWEIS: Stellen Sie vor dem Photostimulationsverfahren bitte sicher, dass der Durchmesser des Fokus etwa 2 m beträgt. Dieser Prozess wird in Schritt 3.5.1 und 3.5.2 beschrieben.
    1. Nehmen Sie die schale mit ERK2-GFP transfizierte Zellen aus dem Inkubator und stellen Sie die Schale auf die Mikroskopstufe.
    2. Starten Sie den schnellen Scanmodus über die Betriebssystemsoftware des Mikroskops. Optimieren Sie das Ziel, klare fluoreszierende Bilder von Zellen zu erfassen. Beenden Sie das schnelle Scannen. Wechseln Sie mit der CCD-Kamera in den Hellfeld-Bildgebungsmodus (Abbildung 2A). Öffnen Sie den Verschluss und stellen Sie den Abstand zwischen zwei Linsen des Relaisteleskops ein, um sicherzustellen, dass der Durchmesser des Femtosekunden-Laserfokus 2 m beträgt (Abbildung 2B). Schließen Sie den Verschluss, um die Einstellung abzuschließen.
      HINWEIS: Ein Referenzpfeil kann beschriftet werden, um den Laserfokus anzuzeigen (Abbildung 2). In der Zwischenzeit kann auch ein Referenzpfeil in der Mitte des fluoreszierenden Bildgebungsfensters gesetzt werden, um die Position des Fokus des Femtosekundenlasers anzuzeigen.
    3. Stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf 15-40 mW (810 nm, 65 fs, 80 MHz) oder 20-60 mW (1040 nm, 120 fs, 50 MHz) an der Probe ein. Die Öffnungszeit des Verschlusses auf 0,05-0,2 s einstellen.
    4. Verwenden Sie den schnellen Scanmodus, um eine Zielzelle auszuwählen, die GUT ausgedrückter ERK2-GFP ist.
    5. Verschieben Sie die Bühne, um den Zytosolbereich der ausgewählten Zielzelle in der Mitte des FOV unter Hellfeldabbildung der CCD-Kamera zu lokalisieren (Abbildung 2A).
    6. Klicken Sie auf den Startunten, um den kontinuierlichen Mikroskopie-Bildfortschritt zu starten.
    7. Öffnen Sie den Verschluss zu jedem vordefinierten Zeitfenster, um die in Schritt 3.5.3 entworfene Femtosekunden-Laserstimulation in die Zielzelle zu liefern.
      HINWEIS: (1) Die Photostimulation kann jederzeit in der durch den Verschluss gesteuerten konfokalen Mikroskopiesequenz durchgeführt werden. (2) Die Photostimulation kann während der konfokalen Mikroskopiesequenz mehrmals an der gleichen Position abgegeben werden.
    8. Warten Sie, bis der Bildvorgang abgeschlossen ist. Speichern Sie die Bilddaten für weitere Datenanalysen.
  6. Femtosekunden-Laserstimulation in Zielzellen im Stim-B-Modus
    1. Stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf 15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1040 nm) an der Probe ein.
    2. Nehmen Sie die mit ERK2-GFP transfizierte Schale aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf die Mikroskopstufe.
    3. Verwenden Sie den schnellen Scanmodus, um eine Zielzelle auszuwählen, die GUT ausgedrückter ERK2-GFP ist.
    4. Stellen Sie den konfokalen Bildgebungsprozess in Schritt 3.2 ein. Definieren Sie einen speziellen Scanrahmen als Stimulationsrahmen im Bildprozess. Definieren Sie den Parameter des Simulationsrahmens.
      1. Stellen Sie einen Scanbereich (2 x 2-3 x 3 xm 2) im Cytosolbereich in der Nähe des Kerns in der Zielzelle ein.
      2. Die Gesamtscanzeit auf 0,1-0,2 s einstellen. Synchronisieren Sie den Verschluss des Femtosekundenlasers mit dem konfokalen Scannen entsprechend dem vordefinierten Photostimulationsbereich, der nur geöffnet ist, wenn der Laserscan im Stimulationsrahmen fällt, und schließen Sie ihn sofort, wenn er geht aus.
        HINWEIS: (1) Der Photostimulaion-Bereich kann auf eine beliebige Größe eingestellt werden. (2) Die Photostimulation kann in jedem vordefinierten Zeitfenster in der konfokalen Mikroskopiesequenz durchgeführt werden. (3) Die Photostimulation kann mehrmals an denselben oder unterschiedlichen vordefinierten Bereichen im FOV in dieser konfokalen Mikroskopiesequenz durchgeführt werden.
    5. Klicken Sie auf den Startunten, um den kontinuierlichen Mikroskopie-Bildfortschritt zu starten.
    6. Warten Sie, bis der Bildvorgang abgeschlossen ist. Speichern Sie die Bilddaten für weitere Datenanalysen.
  7. Schalten Sie den Femtosekundenlaser und das konfokale Mikroskop nach dem Experiment aus.

4. Aktivierung von eIF4E (Substrat von ERK) durch Femtosecond Laser Simulation

  1. Hela-Zell-Präparation
    1. Befolgen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.5.
    2. Säen Sie 20.000 Zellen in eine Petrischale mit Zellpositionsgittern (Abbildung3B), um die photostimulierten Zellen zu lokalisieren. Fügen Sie Kulturmedium bis zu 1 ml hinzu.
    3. Legen Sie die Schale mit den Zellen wieder in den Inkubator. Inkubieren Sie die Zellen 24 h bei 37 °C vor der Femtosekunden-Laserbehandlung.
  2. Schalten Sie den Femtosekundenlaser ein und stellen Sie sicher, dass der Verschluss geschlossen ist.
  3. Schalten Sie das konfokale Laserscanning-Mikroskop ein und öffnen Sie die Mikroskopsoftware.
  4. Bereiten Sie das CO2-Inkubationssystem als Anweisung in Schritt 3.3 vor.
  5. Femtosekunden-Laserstimulation in Zielzellen im Stim-A-Modus
    1. Stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf 15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1.040 nm) an der Probe ein. Die Öffnungszeit des Verschlusses auf 0,05-0,2 s einstellen.
    2. Nehmen Sie die Schale mit Zellen aus dem Inkubator und montieren Sie sie im CO2-Inkubator auf der Bühne des Mikroskops.
    3. Bewegen Sie das Ziel in vertikaler Richtung, um die Bildebene unter hellfeldbildnis der CCD-Kamera zu lokalisieren. Bewegen Sie die Probenstufe in horizontale Richtung, um sicherzustellen, dass sich keine Zelle in der Mitte von FOV befindet. Öffnen Sie den Verschluss und passen Sie den Abstand zwischen zwei Linsen des Relaisteleskops an, um den Durchmesser des Femtosekunden-Laserfokus bei 2 m zu gewährleisten. Schließen Sie den Verschluss, um die Einstellung abzuschließen.
    4. Verschieben Sie die Mikroskopstufe, um nach dem Zufallsprinzip 5 bis 10 Raster auszuwählen. Es kann durch die Gitter im Boden der Petri-Schalen unter Hellfeld-Bildgebung der CCD-Kamera angezeigt und lokalisiert werden. Markieren/aufzeichnen Sie die Koordinaten ausgewählter Raster in der Schale.
    5. Stimulieren Sie alle Zellen in den ausgewählten Rastern nacheinander manuell unter Hellfeld-Bildgebung der CCD-Kamera.
  6. Legen Sie die Schale wieder in den Inkubator. Inkubieren Sie die Zellen 24 h bei 37 °C vor der Immunfluoreszenzmikroskopie. Schalten Sie den Femtosekundenlaser und das konfokale Mikroskop nach dem Photostimualtionsverfahren aus.
  7. Immunfluoreszenzmikroskopie von phosphoryliertem EIF4E in Zellen mit Photostimulation zur Bestätigung der ERK-Aktivierung
    1. Nehmen Sie die Schale mit Zellen mit Photostimulationsbehandlung in Schritt 4.5 aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Kulturmedium. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Entfernen Sie PBS.
    2. 1 ml 5% Paraformaldehyd (4 °C) in die Schale geben. Fixieren Sie die Zellen mit 5% Paraformaldehyd für 10 min. Entfernen Sie den Paraformaldehydpuffer. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Entfernen Sie PBS.
    3. 1 ml 0,5% Triton X-100 in die Schale geben. Inkubieren Sie die Zellen 15 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Triton X-100-Puffer. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Entfernen Sie PBS.
    4. Fügen Sie 1 ml 1% BSA-Puffer in die Schale. Inkubieren Sie die Zellen 30 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den BSA-Puffer.
    5. Anti-EIF4E-Antikörper (Phosphor S209) in 1 ml PBS mit 1% BSA bis zu einer Endkonzentration von 1 g/ml verdünnen. Fügen Sie den Puffer in die Schale. Inkubieren Sie die Zellen für 10-12 h bei 4 °C. Entfernen Sie den Puffer.
    6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Entfernen Sie PBS.
    7. Den sekundären Antikörper Anti-Rabbit IgG H&L in 1 ml PBS mit 1% BSA auf eine Endkonzentration von 2 g/ml verdünnen. Fügen Sie den Puffer in die Schale. Inkubieren Sie die Zellen 2 h bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Puffer.
    8. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Entfernen Sie PBS.
    9. Fügen Sie 1 ml PBS in das Gericht.
    10. Schalten Sie das konfokale Laserscanning-Mikroskop ein. Öffnen Sie die Mikroskopsoftware. Setzen Sie den Anregungslaser auf 488 nm. Stellen Sie den Leistungspegel von 488 nm Laser auf 0,1 mW ein. Legen Sie die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel fest. Legen Sie die Intervallzeit jedes Pixels auf 2,4 s fest.
    11. Setzen Sie die Schale mit immunfluoreszierenden Färbezellen auf die Mikroskopstufe. Suchen Sie die ausgewählten Boxen unter der Lichtfeldabbildung der CCD-Kamera.
    12. Starten Sie das konfokale Scannen mit einem Rahmen. Speichern Sie die fluoreszierenden Bilder von Photostimulationszellen.
    13. Bewegen Sie die Bühne nach dem Zufallsprinzip, um Bereiche ohne Femtosekunden-Laserstimulation zu lokalisieren. Starten Sie das konfokale Scannen mit einem Rahmen. Speichern Sie die fluoreszierenden Bilder von keinen Stimulationszellen als Steuerdaten.
  8. Schalten Sie das konfokale Mikroskop nach dem Experiment aus.

5. Aktivierung von Mitoflashes und anderen mitochondrialen Ereignissen durch Photostimulation

HINWEIS: Um die mitochondriale morphologische Dynamik zu beobachten, werden Hela-Zellen mit Mito-GFP in Schritt 5.1 transfiziert, um Mitochondrien fluoreszierend anzuzeigen. Um Mitoflashe zu beobachten, werden Hela-Zellen in Schritt 5.1 mit mt-cpYFP transfiziert.

  1. Bereiten Sie Hela-Zellen vor, die nach Schritt 2 mit Mito-GFP oder mt-cpYFP transfiziert wurden.
  2. Schalten Sie den Femtosekundenlaser ein und stellen Sie sicher, dass der Verschluss geschlossen ist.
  3. Schalten Sie das konfokale Laserscanning-Mikroskop ein. Setzen Sie den Anregungslaser auf 488 nm. Stellen Sie den Leistungspegel von 488 nm Laser auf 0,1 mW ein. Legen Sie die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel fest. Legen Sie die Gesamtbildzeit jedes Frames auf 2,2 s fest. Legen Sie die Intervallzeit zwischen zwei Frames auf 0 s fest. Legen Sie die Gesamtbildrahmen auf 200 Frames fest, um in einem einzelnen Experiment eine kontinuierliche Mikroskopie von 440 s bereitzustellen.
    HINWEIS: Das Intervall von zwei benachbarten Frames, Gesamtbildrahmen und Bildzeit der kontinuierlichen Mikroskopie kann an experimentelle Anforderungen angepasst werden.
  4. Bereiten Sie bei Bedarf das CO2-Inkubationssystem wie in Schritt 3.3 beschrieben vor.
  5. Femtosekunden-Laserstimulation in das Zielmitochondrion im Stim-A-Modus
    1. Nehmen Sie die Schale mit Zellen, die mit Mito-GFP oder mt-cpYFP transfiziert sind, aus dem Inkubator und stellen Sie die Schale auf die Mikroskopstufe.
    2. Überprüfen Sie den Status des Femtosekundenlasers in Schritt 3.5.2. Stellen Sie sicher, dass sich der Fokus des Femtosekundenlasers in der Mitte von FOV befindet. Legen Sie einen Referenzpfeil in der Mitte des fluoreszierenden Bildgebungsfensters fest, um die Position des Fokus anzuzeigen.
    3. Stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf 5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) an der Probe ein. Die Öffnungszeit des Verschlusses auf 0,05-0,1 s einstellen.
    4. Verwenden Sie den schnellen Scanmodus, um eine Zielzelle auszuwählen, die mito-GFP oder mt-cpYFP gut ausgedrückt ist.
    5. Wählen Sie ein Mitochondrion nach dem Zufallsprinzip in der Zielzelle als Versuchsgegenstand aus. Bewegen Sie die Mikroskopstufe, um die mitochondriale Röhrenstruktur des Ziels in der Mitte des FOV (durch den Referenzpfeil anzeigen) durch schnellen Scanmodus zu lokalisieren.
    6. Klicken Sie auf den Startunten, um den kontinuierlichen Mikroskopie-Bildfortschritt zu starten.
    7. Öffnen Sie den Verschluss zu jeder vordefinierten Zeit, um die in Schritt 5.5.3 entworfene Femtosekunden-Laserstimulation in die mitochondriale Röhrenstruktur des Ziels zu bringen.
      HINWEIS: (1) Die Femtosekunden-Laserbelichtung auf der mitochondrialen Röhrenstruktur kann während der konfokalen Mikroskopie jederzeit über den Verschluss gesteuert werden. (2) Führen Sie nur eine Femtosekunden-Laser-Belichtung in einem Experiment durch, da eine Femtosekunden-Laserstimulation den mitochondrialen Status über einen langen Zeitraum stören kann.
    8. Warten Sie, bis der Bildvorgang abgeschlossen ist. Speichern Sie die Bilddaten für weitere Datenanalysen.
  6. Schalten Sie den Femtosekundenlaser und das konfokale Mikroskop nach dem Experiment aus.

6. Oszillation des mitochondrialen Membranpotentials auf Zielmitochondrien in Hela-Zellen durch Femtosekunden-Laserstimulation

  1. Bereiten Sie Hela-Zellen nach den Schritten 2.1.1-2.1.6 vor.
  2. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 °C vor dem Experiment.
  3. Bereiten Sie die TMRM-Färbelösung vor: Verdünnen Sie das TMRM in 1 ml DMEM mit 10% FBS auf eine Endkonzentration von 100 nM.
  4. Nehmen Sie das Gericht mit Zellen, die in Schritt 5.2.1 und 5.2.2 zubereitet werden, aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Kulturmedium. Fügen Sie die in Schritt 6.3 zubereitete TMRM-Färbelösung in die Schale ein. 15-20 min bei 37 °C im Inkubator färben. Entfernen Sie die Färbelösung. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Fügen Sie 1 ml Kulturmedium in das Gericht.
  5. Schalten Sie den Femtosekundenlaser ein und stellen Sie sicher, dass der Verschluss geschlossen ist.
  6. Schalten Sie das konfokale Laserscanning-Mikroskop ein. Öffnen Sie die Mikroskopsoftware. Setzen Sie den Anregungslaser auf 532 nm. Stellen Sie den Leistungspegel von 532 nm Laser auf 0,1 mW ein. Stellen Sie die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel und die Frame-Generierungszeit auf 2,2 s ein. Legen Sie die Intervallzeit zwischen zwei Frames auf 0 s fest. Legen Sie die Gesamtbildrahmen auf 200 Frames fest, um in einem einzelnen Experiment eine kontinuierliche Mikroskopie von 440 s bereitzustellen.
    HINWEIS: Das Intervall von zwei benachbarten Frames, Gesamtbildrahmen und Bildzeit der kontinuierlichen Mikroskopie kann an experimentelle Anforderungen angepasst werden.
  7. Bereiten Sie bei Bedarf das in Schritt 3.3 beschriebene CO2-Inkubationssystem vor.
  8. Verwenden Sie den Stim-A-Modus, um Femtosekunden-Laserstimulation in das Zielmitochondrion zu liefern. Führen Sie die Schritte 5.5.1-5.5.8 aus, um das Experiment abzuschließen.
    HINWEIS: Wählen Sie in Schritt 6.8 ein Mitochondrion aus, das gut mit TMRM als Zielmitochondrion gefärbt ist.
  9. Schalten Sie den Femtosekundenlaser und das konfokale Mikroskop nach dem Experiment aus.

7. Veränderungen von Bax und Cytochrom C an der Zielmitochondrien in Hela-Zellen durch Femtosekunden-Laserstimulation

HINWEIS: In diesem Experiment säen Sie die Zellen in Petrischalen mit Zellpositionsgittern (Abbildung 3B), um die Zelle zu lokalisieren, die mit Femtosekundenlaser behandelt wird. Stain die Zellen mit TMRM, um das Mitochondrion zu lokalisieren, die ausgewählt wird, um durch Femtosekundenlaser stimuliert werden.

  1. Bereiten Sie Hela-Zellen in einer Petrischale mit Zellpositionsrastern vor (Abbildung 3B), wie in Schritt 4.1 beschrieben.
  2. Färben Sie die Zellen mit TMRM, wie in den Schritten 6.3 und 6.4 beschrieben.
  3. Schalten Sie den Femtosekundenlaser ein und stellen Sie sicher, dass der Verschluss geschlossen ist.
  4. Schalten Sie das konfokale Laserscanning-Mikroskop ein. Öffnen Sie die Mikroskopsoftware. Setzen Sie den Anregungslaser auf 532 nm. Stellen Sie den Leistungspegel von 532 nm Laser auf 0,1 mW ein. Stellen Sie die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel und die Frame-Generierungszeit auf 2,2 s ein. Legen Sie die Intervallzeit zwischen zwei Frames auf 0 s fest. Legen Sie die Gesamtbildrahmen auf 50 Frames fest, um in einem einzelnen Experiment eine kontinuierliche Mikroskopie von 110 s zu ermöglichen.
  5. Femtosekunden-Laserstimulation in das Zielmitochondrion im Stim-A-Modus
    1. Stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf 5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) an der Probe ein. Die Öffnungszeit des Verschlusses auf 0,05-0,1 s einstellen.
    2. Nehmen Sie die Schale mit Zellen, die mit dem Inkubator gefärbt sind, und stellen Sie die Schale auf die Mikroskopstufe.
    3. Verwenden Sie den schnellen Scanmodus, um die Zielzelle auszuwählen, die gut mit TMRM befleckt ist.
    4. Verschieben Sie die Bühne, um die mitochondriale Röhrenstruktur des Ziels in der Mitte von FOV mithilfe des schnellen Scanmodus zu lokalisieren. Markieren Sie die Koordinate des Rasters, das sich die ausgewählte Zelle unter der Bildgebung mit hellem Feld befindet.
    5. Klicken Sie auf den Startunten, um den kontinuierlichen Mikroskopie-Bildfortschritt zu starten.
    6. Öffnen Sie den Verschluss zu jedem vordefinierten Zeitpunkt des Mikroskopie-Bildgebungsfortschritts manuell, um die in Schritt 7.5.1 entworfene Femtosekunden-Laserstimulation in die mitochondriale Röhrenstruktur des Ziels zu liefern.
    7. Warten Sie, bis der Bildvorgang abgeschlossen ist. Markieren Sie das ausgewählte Mitochondrion, das durch Femtosekundenlaser simuliert wird. Speichern Sie die Bilddaten für weitere Datenanalysen.
    8. Schalten Sie den Femtosekundenlaser und das konfokale Mikroskop nach dem Experiment aus. Bereiten Sie die Immunfluoreszenzmikroskopie von Bax oder Cytochrom C auf den Experimentzellen vor.
  6. Immunfluoreszenzmikroskopie von Bax oder Cytochrom C auf der Femtosekundenlaser behandeltes Mitochondrion.
    1. Nehmen Sie die Schale von der Mikroskop-Bühne.
    2. Vollständige immunfluoreszierende Färbung von Bax oder Cytochrom C folgen Sie den Schritten 4.7.1-4.7.9.
      HINWEIS: Verwenden Sie Anti-Bax oder Anti-Cytochrom C anstelle von Anti-EIF4E in Schritt 4.7.5, um die immunfluoreszierende Färbung von Bax oder Cytochrom C in Schritt 7.6.2 zu beenden.
    3. Schalten Sie das konfokale Laserscanning-Mikroskop ein und öffnen Sie die Mikroskopsoftware. Setzen Sie den Anregungslaser auf 488 nm und 532 nm. Stellen Sie den Leistungspegel von 488 nm und 532 nm Laser auf 0,1 mW ein. Legen Sie die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel und die Framegenerierungszeit auf 2,2 s fest.
    4. Setzen Sie die Schale mit immunfluoreszierenden Färbezellen auf die Mikroskopstufe. Suchen Sie das ausgewählte Raster unter der Lichtfeldabbildung der CCD-Kamera. Suchen Sie die Zelle, die mit Femtosekundenlaser behandelt wird.
    5. Starten Sie das konfokale Scannen mit einem Rahmen. Suchen Sie das Mitochondrion, das durch Femtosekundenlaser stimuliert wird. Speichern Sie das fluoreszierende Bild der Photostimulationszelle für weitere Datenanalysen.
  7. Schalten Sie das konfokale Mikroskop nach dem Experiment aus.

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Representative Results

Die Photostimulation kann gleichzeitig zusammen mit einer kontinuierlichen konfokalen Scanmikroskopie durchgeführt werden. Die Photostimulation kann zu jedem vordefinierten Zeitfenster in der Zeitraffer-Konfokalmikroskopiesequenz beginnen. Die konfokale Mikroskopie kann zelluläre Moleküle durch fluoreszierende Bildgebung überwachen. Die molekularen Reaktionen auf Photostimulation und andere Dynamiken können auf diese Weise identifiziert werden. Theoretisch, wenn ERK aktiviert ist, wird es phosphoryliert bewegen vom Zytoplasma zu Zellkern27. Das spezifische Zellschicksal kann durch bestimmte Muster dieses ERK-Signals28reguliert werden. In neueren Studien hat die optische Modulation auf basisder Optogentik eine hochpräzise Kontrolle des ERK-Signals in Dauer und Größe ermöglicht und gezeigt, dass gestörte ERK-Signalübertragungsdynamik eine unsachgemäße Proliferation in Krebszellen antreibt7, 8. Hier zeigen wir die ERK2-Translokation in den Kern nach der Behandlung der Zelle mit einem kurzen Blitz Femtosekundenlaser mit der in diesem Protokoll vorgestellten Methode. Wie in Abbildung 5Adargestellt, erreicht die ERK2-GFP-Fluoreszenz nach einigen Minuten Femtosekunden-Lasersimulation das Maximum. Die ERK2-Moleküle werden nach der Aktivierung nachgeschalteter Substrate im Zellkern dephosphoryliert, und dann kommt das ERK2 zum Zytoplasma zurück, das durch Absenkung der kernivären GFP-Fluoreszenz angezeigt wird. ERK2 kann mehrfach durch mehrere Photostimulationen aktiviert werden (Abbildung 5B). Daher ist es in der Lage, das ERK2-Signalmuster präzise zu manipulieren, indem die Intervallzeit zwischen mehreren Reizen gesteuert wird. Darüber hinaus kann ERK2 gelegentlich in benachbarten Zellen um die stimulierte Zelle aktiviert werden (Abbildung 5C). Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass einige diffusible Moleküle von der mit Femtosekundenlaser behandelten Zelle freigesetzt werden können, um ERK2 in den angrenzenden Zellen zu aktivieren. Die Phosphorylierung des ERK2-nachgeschalteten Proteins eIF4E kann durch Immunfluoreszenzmikroskopie bestätigt und visualisiert werden (Abbildung 5D). Dieses Ergebnis zeigt an, dass die Femtosekunden-Laserstimulation den ERK-Signalweg erfolgreich aktivieren kann. Ausführlichere Ergebnisse finden Sie in Wang S., et al.22.

Mitochondriale oxidative Blitze (Mitoflashes) sind oxidative Ausbrüche in Mitochondrien, die aus der komplexen mitochondrialen Molekulardynamik wurzeln. In den letzten zehn Jahren wurden Mitoflashes als elementare stellarisches Mitochondrien-Signalereignis realisiert und nehmen eine wichtige Rolle in den multitudinous Zellfunktionen29,30,31. Traditionell werden Mitoflashe in der Regel durch Zufall beobachtet, wenn Zellen mit Chemikalien behandelt werden, um indirekte Belastung von Mitochondrien29,30zu bieten. Durch die Implementierung dieses Photostimulationsschemas erreichen wir eine kontrollierbare und präzise Art und Weise, mitoflashes auf einzelner mitochondrialer Röhrenebene zu stimulieren. Die erfolgreiche Mitoflash-Erregung ist in Abbildung 6Adargestellt. Interessanterweise sind die Eigenschaften von Mitoflashen wie Pulsspitze, Breite und Ansprechdauer32 eng mit der Femtosekundenlaserleistung verbunden. Detailliertere quantitative Analyse von Mitoflashes, die durch Femtosekunden-Laserstimulation angeregt werden, ist in Wang S., et al.32. Diese Photostimulation der Mitochondrien zeigt auch Sorten der mitochondrialen Molekulardynamik, einschließlich Fragmentierung und Wiederherstellung der mitochondrialen Morphologie (Abbildung 6B), und Oszillation des mitochondrialen Membranpotentials ( Abbildung 6C). Ähnlich wie bei fotoaktivierten Mitoflashes weisen diese Mitochondrienereignisse unterschiedliche Leistungen mit unterschiedlichen Leistungsintensitäten der Photostimulation auf. Es unterscheidet sich von der Aktivierung des ERK-Signalwegs. Der Einfluss des Femtosekundenlasers ist stark auf eine einzelne mitochondriale Röhre beschränkt. Ausführlichere Ergebnisse finden Sie in Wang Y., et al. 24 und Shi F., etal. 25.

Figure 1
Abbildung 1: Das Photostimulationsschema, das an einer Femtosekunden-Laserkopplung in ein konfokales Mikroskop eingerichtet wurde. (A) Optische Pfade des Photostimulations- und konfokalen Bildgebungssystems (B). Der Femtosekundenlaser wird zunächst durch einen 50/50 Strahlteiler in zwei Strahlen aufgeteilt. Die Übertragung wird durch ein Relaisteleskop erweitert und dann in das Ziel der Stim-A reflektiert. Der Reflexionsstrahl wird durch das Mikroskop-Scanning-System zu Stim-B ausgerichtet. Eine CCD-Kamera wird verwendet, um eine hell-felid Bildgebung zur Überwachung von Zellen und Fokus des Femtosekundenlasers im Stim-A-Modus bereitzustellen. Stim-A = ein fester Fokus in der Mitte von FOV; Stim-B = ein spezieller Scanrahmen im vorgefertigten Bereich. DM = dichroitischer Spiegel, BS = Strahlsplitter, RM = reflektierender Spiegel. Die Wellenlänge des konfokalen Scanning-Lasers beträgt 488 nm/532 nm/635 nm, und das typische Sammelwellenlängenintervall der Fluoreszenz beträgt <560 nm/560-625 nm/> 625 nm. Der Faserfemtosekundenlaser (1.040 nm, 120 fs, 50 MHz, 1 W) kann durch einen Ti = Saphirlaser (810 nm, 80 MHz, 65 fs, 1 W) oder andere kommerzielle Femtosekundenlaseroszillatoren ersetzt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Im Stim-A-Modus konzentrieren sich die Lokalisation und die Größe des Femtosekundenlasers auf die Zielzelle auf der konfokalen Bildgebungsebene unter hell-felid-Bildgebung. (A) Femtosekundenlaser wird durch den Verschluss blockiert. (B) Femtosekundenlaser ist eingeschaltet. Pfeil: Der Referenzpfeil wird in der Mitte von FOV gesetzt, um zu bestätigen, dass der Femtosekunden-Laserfokus die richtige Position lokalisiert. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Die Petrischale, die für Zellkultur-, Transfektions- und Photostimulationsexperimente verwendet wird. (A) Die 35 mm Petrischale mit einem Durchmesser von 15 mm und einem Glasboden von 0,17 mm. (B) Die 35 mm Petrischale mit Glasboden und einem bedruckten Zellpositionsraster von 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Das CO2-Inkubationssystem. (A) Die CO2-Inkubatorstufe und (B) das Bedienfeld. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: ERK-Photoaktivierung mit stim-A-Modus. (A) Ein einziger Photostimulus (1.040 nm, 40 mW, 0,1 s) induziert ERK2-GFP-Translokation in den Kern und dann zurück zum Zytoplasma. (B) ERK2-Signalmuster, vermittelt durch einzelne Femtosekunden-Laserbelichtung (roter Pfeil, 1.040 nm, 40 mW, 0,1 s) und zwei Photostimulationen (grüne Pfeile, 810 nm, 30 mW, 0,1 s). (C) ERK-Aktivierung in umgebenden Zellen durch einzelne kurze Femtosekunden-Laserbelichtung in der Zielzelle (weißer Pfeil, 810 nm, 24 mW, 0,2 s). (D) Die Immunfluoreszenz von eIF4E-P zeigt nach einzelweiser Fotosimulation (810 nm, 25 mW, 0,2 s) einen signifikanten Anstieg um 24 h. Skala bar = 10 m (A) und 20 m (B, C). Die Fluoreszenz von ERK2-GFP und eIF4E-P wird durch 488 nm Anregungslaser angeregt und im <560 nm Kanal gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Mehrere Mitochondrienereignisse, die durch Photostimulation im Stim-A-Modus induziert werden. (A) Anregung von Mitoflash auf dem stimulierten mitochondrialen Tubule durch einzelnen Stimulus (810 nm, 16 mW, 0,1 s). (B) Mitochondrien morphologische Fragmentierung und Restauration durch einzelne Photostimulation induziert (1.040 nm, 30 mW, 0,1 s). (C) Oszillation des mitochondrialen Membranpotentials durch einzelne Femtosekunden-Laserstimulation (1040 nm, 20 mW, 0,1 s). Pfeile in (A) (B) und (C) zeigen die Position der Photostimulationen an. Skalenbalken = 10 m. Die Fluoreszenz von Mito-GFP oder mt-cpYFP wird durch 488 nm Anregungslaser angeregt und im <560 nm Kanal gesammelt. Die Fluoreszenz von TMRM wird durch 532 nm Anregungslaser angeregt und in 560-625 nm Kanal gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

0,05 s 0,1 s 0,2 s 0,5 s
810 nm, 65 fs, 80 MHz 20 - 65 mW 10 - 60 mW 5 - 50 mW 5 - 40 mW
1040 nm, 120 fs, 50 MHz 30 - 100 mW 20 - 80 mW 15 - 70 mW 10 - 60 mW

Tabelle 1: Empfohlene Stimulationsdauer und durchschnittliche Leistung des Femtosekundenlasers im Stim-A-Modus.

0,05 s 0,1 s 0,2 s 0,5 s
810 nm, 65 fs, 80 MHz 25 - 40 mW 20 - 30 mW 15 - 25 mW 10 - 25 mW
1040 nm, 120 fs, 50 MHz 40 - 60 mW 30 - 50 mW 25 - 40 mW 20 - 30 mW

Tabelle 2: Empfohlene Stimulationsdauer und durchschnittliche Leistung des Femtosekundenlasers im Stim-A-Modus bei 2 x 2-3 x 3 m 2 in der Zelle.

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Discussion

Wir demonstrieren eine Photostimulationsstrategie, indem wir einen Femtosekundenlaser mit einem laserscannenden Konfokalmikroskopsystem kombinieren. Die Photostimulation kann direkt als Zwei-Photonen-Mikroskopie wirken, indem Stim-B entsprechend definiert wird. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines kurzen Blitzes von Femtosekundenlaser, um ERK-Signalisierung oder Mitoflashes in Zielzellen auszulösen. Die verschiedenen Stimulationsmodi können nach unterschiedlichen experimentellen Zwecken und Systemen durchgeführt werden. Stim-A lässt sich einfach mit einem konfokalen Mikroskop einrichten. Der Femtosekundenlaser kann auf Beugungsgrenze im FOV-Zentrum fokussiert werden. Das subzelluläre Ziel muss manuell in die Femtosekunden-Laserfokusposition verschoben werden und kann für beliebige Dauern stimuliert werden, völlig unabhängig von der konfokalen Mikroskopie. Daher kann Stim-A die Probe, die sich ahl aus dem Fokusbereich befindet und für die Langzeit-Photostimulation geeignet ist, perfekt schützen. Der Stimulationsbereich von Stim-B kann als beliebiger Bereich im FOV vordefiniert werden. Es kann automatisch durchgeführt werden. Die Stimulationsdauer und Belichtungszeit kann jedoch nur mit dem konfokalen Scannen folgen. Nach dem Einstellen der Verweilzeit jedes Pixels und der gesamten Framegröße ist die Stimulationsdauer in einem einzelnen Mikroskoprahmen tatsächlich festgelegt. Die Photostimulation kann auch periodisch von Frame zu Rahmen durchgeführt werden. Es kann auch verwendet werden, um Photosensitoren und optogenetische Proteine zu aktivieren, die weniger Expositionsdauer, aber große Fläche erfordert.

Eine kritische Überlegung in diesem Protokoll ist, wie die Parameter der Femtosekunden-Laserstimulation bestimmt werden. Nach unseren früheren Studien wird die zelluläre molekulare Aktivität meist durch Multiphotonen-Exaktivität17,21,22,23,24,25induziert. Im Allgemeinen ist die Multiphotonen-Exaction-Effizienz mit allen Femtosekunden-Laserparametern verbunden, einschließlich Wellenlänge, Pulsbreite, Wiederholungsrate. Die zelluläre Reaktion hängt weiter mit der Laserleistung, Stimulationsposition/Region und Der Belichtungsdauer gleichzeitig zusammen. Grundsätzlich steht die Stimulationseffizienz im Widerspruch zur Zellsicherheit. Eine stärkere Photostimulation wie eine höhere Durchschnittsleistung, eine längere Stimulationsdauer und eine größere Gesamtlaserenergie tragen zu höheren Stimulationseffizienzen bei, bergen aber ein höheres Risiko von Zellschäden. Da diese Parameter auch relativ miteinander sind und alle zum Stimulations- und Schadenseffekt beitragen, ist es unmöglich, nur einen Parameter zu verwenden, wie die gesamte einfallende Laserenergie oder laserdurchschnittliche Leistung, um zu definieren, dass sie sicher ist oder nicht. Unter Berücksichtigung der Signalaktivierungseffizienz und der Zellsicherheit bieten wir hier die empfohlene durchschnittliche Leistung und Stimulationsdauer von zwei Femtosekunden-Laserquellen als Referenz in Tabelle 1 und Tabelle 2an. Außerdem sollten die Parameter der Femtosekunden-Laserstimulation entsprechend dem eigentlichen optischen System und der biologischen Probe geändert werden.

Nach den oben genannten Diskussionen beabsichtigen wir, detailliertere effektive Bereiche von Photostimulationsparametern zu präsentieren. Die Wellenlänge des Femtosekundenlasers kann im NIR-Bereich für die Photostimulation geändert werden. Die Pulsbreite sollte kurz sein, um eine hohe Spitzenleistung und eine hohe nichtlineare Exaction-Effizienz zu bieten. Eine lange Pulsdauer wird für dieses Protokoll nicht empfohlen. In der Regel ist die typische Pulsbreite für die Zwei-Photonen-Mikroskopie (<200 fs) die richtige Wahl. Die Wiederholungsrate des Lasers ist kein Schlüsselfaktor. Die Wiederholungsrate bis MHz ist für dieses Protokoll geeignet. Der kritischste Faktor für zelluläre molekulare Reaktionen ist die Laserleistung und Stimulationsdauer des Femtosekundenlasers. Für die Aktivierung von ERK reichen nach unserer bisherigen Arbeit22die durchschnittliche Leistung bei 15 mW (810 nm) oder 20 mW (1.040 nm) und die Expositionsdauer bei 0,2 s aus, um eine ausreichende Stimulation zu bieten, um die ERK-Signalisierung zu aktivieren und gleichzeitig die ultrahohe Zelllebensfähigkeit in Hela-Zellen. Im Gegenteil, eine durchschnittliche Leistung von über 80 mW (810 nm) oder 120 mW (1.040 nm) und eine Expositionsdauer von mehr als 1 s können irreversible Schäden an Zellen verursachen. Mitochondrien sind in der Regel empfindlicher gegenüber Photostimulation. Die Stimulation mit einer durchschnittlichen Leistung von mehr als 40 mW (810 nm) oder 80 mW (1.040 nm) und expositionsdauer über 0,2 s kann signifikante Schäden wie irreversible Fragmentierung in stimuliertem Mitochondrion oder sogar in allen Mitochondrien in der gesamten Zelle verursachen. Es sollte beachtet werden, dass die Lichtempfindlichkeit der Mitochondrien gegenüber Photostimulation bei verschiedenen Zelltypen sehr unterschiedlich ist. In HeLa-Zellen benötigt die Laserleistung beispielsweise nur etwa 6 mW (810 nm, 0,1 s Dauer). Alle Mitochondrien können auf die Photostimulation in Form von Fragmentierung, Mitoflashes und MMP-Oszillationen reagieren. Aber in menschlichen mesenchymalen Stammzellen muss die Leistung auf etwa 15 mW erhöht werden (810 nm, 0,1 s Dauer), und immer noch etwa die Hälfte stimulierter Mitochondrien zeigen keine Reaktion auf Photostimulation. Im Stim-B-Modus kann ein weiterer Faktor die Effizienz der Fotoaktivierung beeinträchtigen und Zellschäden sind der Stimulationsbereich. Die Photostimulation kann Zellschäden verursachen, indem sie einen kleinen Stimulationsbereich liefert. Aber die gleiche Stimulation kann ERK nicht aktivieren, indem sie einen größeren Stimulationsbereich liefert. Wir empfehlen, dass der Stimulationsbereich in der Zielzelle etwa 2 x 2-3 x 3 m2 beträgt und 25 m2nicht überschreitet.

Die Lokalisierung des Stimulationsbereichs ist auch für die Anwendung dieses Protokolls wichtig. Nach früheren Arbeiten17,22kann die Photostimulation in diesem Bereich den Ca2+ Store in ER effektiv aufbrauchen und den CRAC-Kanal aktivieren. Anschließend kann der Ca2+ Zustrom den ERK-Signalweg nachträglich aktivieren. Daher empfehlen wir, die Photostimulation auf der ER-Region in Hela-Zellen zu liefern, um eine hohe ERK-Aktivierungseffizienz zu erreichen. Der ER-Bereich kann leicht von Zytoplasma oder Kern unter Hellfeldmikroskopie durch ein Phasenkontrastobjektiv unterschieden werden. Um mitochondriale Signalereignisse einzuführen, kann der Fokus des Femtosekundenlasers nach den entsprechenden Verfahren einfach auf die ausgewählte mitochondriale Struktur montiert werden.

Photostimulationsmethoden, die in diesem Protokoll beschrieben werden, können auch verwendet werden, um andere zelluläre Ereignisse wie die Induktion von Ca2+ und ROS-Signalen17,20,21zu beeinflussen. Es sollte beachtet werden, dass alle früheren Arbeiten die Bewertung der Zellsicherheit nach der Photostimulation geliefert haben. Zum Beispiel deuten signifikante morphologische Veränderungen der Zellen, Sprudeln, mitochondriale Fragmentierung und Schwellung der gesamten Zelle, verminderte Proliferationsrate von Zellen und einige andere ungewöhnliche Veränderungen der Fluoreszenz während der konfokalen Mikroskopie Zellschäden. Es sollte sehr vorsichtig sein, den Zellstatus zu überwachen. Dennoch konnte die Zelllebensfähigkeit mit einer guten Steuerung der Laserleistung und Stimulationsparameter auf einem sehr hohen Niveau gleichzeitig mit hoher Stimulationseffizienz gehalten werden. Daher ist diese Photostimualtionsmethode des Femtosekundenlasers von einem guten Potenzial, sich weiter auf weitere Bereiche auszudehnen und in relevanten Anwendungen anzuwenden.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Acknowledgments

Die Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (81571719 und 81661168014, 81673014 und 81870055), Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1402300 und 16XD1403100) und National Key F&D Plan (2017YFA0104600).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted microscope Olympus
Femtosecond laser Fianium
CO2 incubation system Olympus MIU-IBC
Petri dish NEST 801002
Petri dish with imprinted grid Ibidi 81148
ERK-GFP addgene 37145 A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFP A gift from Heping Cheng's lab
mito-GFP Invitrogen C10508
Tetramethylrhodamine (TMRM) Invitrogen T668 Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6 Dilute in PBS
Paraformaldehyde Solarbio P8430 Dilute in PBS
Triton X-100 Solarbio T8200 Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8 Dilute in PBS
Tween20 Sigma-Aldrich 9005-64-5
anti-eIF4E antibody abcam ab76256
anti-Bax antibody abcam ab53154
anti-cytochrome C antibody abcam ab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) abcam ab150077

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie Ausgabe 149 Femtosekundenlaser Photostimulation extrazellulär-signalregulierte Kinase (ERK) Mitochondrien Mitoflash Biophotonik
Photostimulation durch Femtosecond Laser aktiviert extrazellulär-signalregulierte Kinase (ERK) Signalisierung oder Mitochondrienereignisse in Zielzellen
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Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H. Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells. J. Vis. Exp. (149), e59661, doi:10.3791/59661 (2019).

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